Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

DOI:

10.3791/56248

⸱

7 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy monitorowanie migracji komórek w czasie rzeczywistym w teście gojenia ran przy użyciu komórek nabłonka piersi MCF10A zubożonych w TIP60. Implementacja technik obrazowania żywych komórek w naszym protokole pozwala nam analizować i wizualizować ruch pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i w czasie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test gojenia ran jest skuteczny i jest jednym z najbardziej ekonomicznych sposobów badania migracji komórek in vitro. Tradycyjnie obrazy są wykonywane na początku i na końcu eksperymentu za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, a zdolności migracyjne komórek są oceniane przez zamknięcie ran. Jednak ruch komórek jest zjawiskiem dynamicznym, a konwencjonalna metoda nie pozwala na śledzenie ruchu pojedynczej komórki. Aby ulepszyć obecne testy gojenia się ran, wykorzystujemy techniki obrazowania żywych komórek do monitorowania migracji komórek w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala nam określić szybkość migracji komórek w oparciu o system śledzenia komórek i zapewnia wyraźniejsze rozróżnienie między migracją komórek a proliferacją komórek. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie obrazowania żywych komórek w testach gojenia się ran w celu zbadania różnych zdolności migracyjnych komórek nabłonka piersi, na które wpływa obecność TIP60. Ponieważ ruchliwość komórek jest bardzo dynamiczna, nasza metoda zapewnia więcej wglądu w procesy gojenia się ran niż migawka zamknięcia rany wykonana za pomocą tradycyjnych technik obrazowania stosowanych do oznaczania gojenia ran.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-Tat-interactive białko 60 kDa (TIP60) to acetylotransferaza lizynowa, która może acetylować zarówno białka histonowe, jak i niehistonowe1,2. Stwierdzono, że jego funkcje mają wpływ na wiele szlaków sygnałowych, w tym transkrypcję, naprawę uszkodzeń DNA i apoptozę1,3,4,5,6,7,8. Co więcej, TIP60 jest często regulowany w dół w nowotworach, a jego obniżenie jest skorelowane z przerzutami raka i słabymi wskaźnikami przeżycia9,10,11,12,13,14. Przerzuty nowotworowe są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Jest to proces wieloetapowy, a początkowy etap przerzutów obejmuje migrację i inwazję komórek nowotworowych do sąsiednich tkanek15,16. Aby to zrobić, komórki nowotworowe muszą najpierw odłączyć się od pierwotnej masy nowotworowej, albo w postaci kolektywnie atakującego arkusza komórek, albo jako oderwane pojedyncze komórki17. Podczas tego procesu komórki nowotworowe często przechodzą przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), co powoduje zmiany w morfologii i zdolności adhezji komórek17,18.

Opracowano kilka technik do badania zdolności migracji i inwazji komórek nowotworowych in vitro. Wśród nich test gojenia się ran jest najbardziej wydajny i ekonomiczny19. Po pierwsze, metoda ta polega na utworzeniu sztucznej luki na zlewającej się monowarstwie komórek, umożliwiając w ten sposób komórkom migrację i zamknięcie luki. Po drugie, obrazy luk mogą być rejestrowane na początku i na końcu eksperymentu. Na koniec stosuje się porównanie zamykania luki w celu określenia szybkości migracji komórek. Mikroskop z kontrastem fazowym jest zwykle używany do rejestrowania obrazów do konwencjonalnych testów gojenia się ran. Kolejną zaletą testu gojenia się ran jest to, że częściowo przypomina on migrację komórek nowotworowych in vivo. Podobnie jak w przypadku przerzutów nowotworowych in vivo, migracja komórek w testach gojenia się ran wykazuje zarówno zbiorową migrację arkuszy nabłonka, jak i migrację oderwanych pojedynczych komórek.

Wiadomo jednak, że migracja komórek jest dynamiczna i istnieje potrzeba dokumentowania ruchu komórek w czasie rzeczywistym. Na przykład konwencjonalny test gojenia się ran nie pozwala badaczowi na analizę ruchu pojedynczej komórki. Z drugiej strony, komórki hodowane do testów gojenia się ran są często głodne surowicy, aby zahamować proliferację komórek. Ma to na celu wykluczenie możliwości zamknięcia luki z powodu proliferacji komórek. Niemniej jednak nadal będzie występować pewna proliferacja i śmierć komórki, a obrazy z kontrastem fazowym wykonane przed i po eksperymencie nie są w stanie ich rozróżnić.

Technika obrazowania żywych komórek rozwiązuje to ograniczenie konwencjonalnych testów gojenia ran. Korzystając z mikroskopu do obrazowania na żywo w połączeniu z inkubatorem CO2 i odpowiednią kontrolą temperatury, naukowcy mogą zmierzyć wielkość luki i tempo jej zamykania w czasie, śledząc ruch aktywnie migrujących komórek znajdujących się na końcach frontu inwazyjnego. W związku z tym wdrożenie obrazowania żywych komórek w celu monitorowania migracji komórek nie tylko zapewni lepszą wizualizację migracji komórek, ale także umożliwi rozróżnienie między migracją komórek a proliferacją komórek, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodną analizę migracji komórek.

W tym badaniu, komórki nabłonka piersi MCF10A zostały użyte do zademonstrowania kombinacji testu gojenia ran i obrazowania żywych komórek w celu zbadania roli TIP60 w migracji komórek. Wyczerpanie TIP60 powoduje zwiększenie zdolności migracyjnych w komórkach MCF10A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną MCF10A: Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM)/F12 (1:1) firmy Dulbecco z 5% surowicą końską, 20 ng/ml nabłonkowym czynnikiem wzrostu, 0,5 mg/ml hydrokortyzonu, 100 ng/ml toksyny i 10 μg/ml insuliny.
  2. Przygotuj pożywkę bez surowicy: DMEM/F12 (1:1) z 20 ng/ml nabłonkowego czynnika wzrostu, 0,5 mg/ml hydrokortyzonu, 100 ng/ml toksyny i 10 μg/ml insuliny.
  3. Użyj następującej sekwencji siRNA:
    siControl:
    Do przodu: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
    Rewers: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
    siTIP60:
    Do przodu: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
    Rewers: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
  4. Użyj 10-centymetrowych naczyń do hodowli komórkowych i 24-dołkowych płytek.

2. Przejściowe wyczerpanie TIP60 za pomocą siRNA

  1. W dniu 1 należy podać 15 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine RNAiMAX) i 2 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM) i wymieszać je odpowiednio z 10 μl każdego siRNA (zapas 10 μM).
  2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  3. Wysiew 1 x 106 komórek MCF10A wraz z 3 ml pożywki hodowlanej w naczyniu o średnicy 10 cm. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  4. Dodaj mieszaninę siRNA kropla po kropli do 10 cm naczynia.
  5. Wstrząsnąć naczyniem, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone przed umieszczeniem go w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  6. Po 6 godzinach inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą siRNA 8 ml świeżej pożywki hodowlanej.
  7. W dniu 2 przygotuj kolejną partię mieszanin siRNA i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  8. Odessać 8 ml pożywki dodanej w dniu 1 i zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki hodowlanej.
  9. Dodaj drugą partię mieszaniny siRNA do naczyń kropla po kropli. Wstrząśnij naczyniami, aby upewnić się, że odczynniki są całkowicie wymieszane przed włożeniem ich do inkubatora.
  10. Po 6 godzinach zastąp pożywkę zawierającą siRNA 8 ml świeżej pożywki hodowlanej.

3. Komórki nasienne do badania gojenia ran

  1. W dniu 3 należy wyrzucić pożywkę i raz przemyć komórki 2 ml buforowanego roztworem soli fizjologicznej (PBS). Odrzuć bufor PBS.
  2. Trypsynizuj komórki traktowane siControl i siTIP60, dodając 1 ml 1x buforu trypsyna-EDTA do płytki. Włóż go z powrotem do inkubatora na 20 minut.
  3. Dodać 4 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdej płytki, ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Wirować przy 200 g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  5. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki wolnej od surowicy i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  6. Przygotować zawiesinę komórek 6 x 105 komórek/ml zarówno dla siControl, jak i siTIP60; upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane. Dodaj 500 μl zawiesiny komórkowej do jednego dołka 24-dołkowej płytki, aby zapewnić 100% zgrywkę. Wysiewaj od 5 do 6 dołków każdy dla siControl i siTIP60.
  7. Delikatnie potrząśnij talerzem w przód i w tył, a następnie z boku na bok, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Unikaj ruchów okrężnych. Pozostaw płytkę w inkubatorze na 24 godziny.
  8. Zbierz pozostałe komórki, aby sprawdzić skuteczność powalania TIP60. W tym celu należy odwirować pozostałą zawiesinę komórek o masie 200 g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  9. Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego odczynnika, postępując zgodnie z protokołem producenta, i przystąp do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, aby ocenić skuteczność knockdownu.

4. Stwórz ranę

  1. Sprawdź pod mikroskopem kontrastu fazowego, aby upewnić się, że komórki są w pełni połączone. Obserwuj komórki pod mikroskopem (powiększenie 4x, 10x i 20x), aby upewnić się, że komórki są w pełni przyczepione, że utworzyła się zlewająca się monowarstwa komórek.
    UWAGA: ogniwa siControl zwykle przyczepiają się lepiej niż ogniwa siTIP60. Jest to oczekiwane, ponieważ wyczerpanie TIP60 sprawia, że komórki są bardziej mezenchymalne20. W tym przypadku używany jest zwykły stacjonarny mikroskop z kontrastem fazowym światła białego.
  2. Aby wytworzyć ranę, delikatnie podrapaj prostą linię w poprzek środka studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl; długość powstałej rany jest taka sama jak średnica studzienki. Powtórz ten krok dla wszystkich pozostałych studzienek. Do każdego dołka należy użyć nowej końcówki do pipety.
  3. Delikatnie umyj każdą studzienkę 5 razy za pomocą pożywki bez surowicy, aby usunąć oderwane komórki.
  4. Dodaj 1 ml pożywki bez surowicy do każdego dołka i przystąp do obrazowania żywych komórek.

5. Konfiguracja obrazowania żywych komórek

  1. Włącz mikroskop i regulator temperatury co najmniej 1 godzinę przed ustawieniem obrazowania żywych komórek, aby upewnić się, że temperatura w komorze osiągnie 37 °C.
  2. Włącz dopływ dwutlenku węgla (CO2 ) przed rozpoczęciem obrazowania żywych komórek. Ustaw stężenie CO2 na 5%.
  3. Umieść 24-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i wybierz soczewkę obiektywu o 10-krotnym powiększeniu do obrazowania. Skieruj emitowane światło na okulary zamiast na aparat i dostosuj ostrość, aby zlokalizować ranę i komórki wokół niej.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano światło białe z kontrastem fazowym.
  4. Użyj systemu obserwatora żywych komórek, aby oznaczyć położenie rany w każdym dołku.
    UWAGA: Zautomatyzowany etap systemu obrazowania żywych komórek pozwala na akwizycję obrazu w wielu pozycjach. Zdjęcia są wykonywane w każdej oznaczonej pozycji raz na interwał.
  5. Ustaw warunek czasowy: 1 h interwał i 72 h czas trwania; zgodnie z tym ustawieniem system będzie robił zdjęcia w każdej zaznaczonej pozycji co godzinę przez 72 h. Ustaw dowolny żądany przedział czasu i okres monitorowania.
    UWAGA: W tym przypadku najlepszy jest czas trwania 72 godzin, ponieważ komórki te zaczynają obumierać po 72 godzinach w pożywce bez surowicy.

6. Śledzenie ruchu pojedynczej komórki

  1. Eksportuj dane po 72 godzinach. Eksportuj dane zarówno jako obrazy w formacie JPEG, jak i jako filmy w formacie AVI.
    UWAGA: Jest to ważne, ponieważ oprogramowanie ImageJ rozpoznaje filmy tylko w formacie AVI. Na filmie można wyraźnie zaobserwować różne prędkości migracji komórek między komórkami siTIP60 i siControl.
  2. Otwórz wideo AVI w oprogramowaniu ImageJ.
  3. Otwórz wtyczkę MTrackJ (wtyczkę należy pobrać i zainstalować osobno): Wtyczki > MtrackJ.
  4. Dodaj ścieżkę dla pojedynczych komórek wybranych z filmu, klikając kartę "Dodaj" na pasku narzędzi MtrackJ. Wybierz komórkę na końcu frontu inwazyjnego i komórkę, która może migrować samodzielnie (migracja jednokomórkowa). Śledź ruch wybranych komórek na filmie i śledź je za pomocą MtrackJ.
  5. Zmierz odległość ruchu, klikając zakładkę "zmierz" na pasku narzędzi.
    UWAGA: W tym przypadku prawie żadna komórka w siControl nie poruszała się jako pojedyncze komórki, co utrudniało pomiar ruchu pojedynczej komórki, podczas gdy wiele komórek siTIP60 poruszało się jako pojedyncze komórki. Jednak ruch komórek zlokalizowanych na froncie inwazyjnym można nadal śledzić i obliczać zarówno w komórkach siControl, jak i siTIP60.
  6. Zapisz wideo ze ścieżkami w formacie AVI.

7. Kwantyfikacja zdolności migracji komórek

  1. Do kwantyfikacji wybierz obrazy w godzinie 0 i obrazy w godzinie "n", gdzie "n" odnosi się do punktu czasowego, w którym komórki siTIP60 lub siControl całkowicie zamknęły ranę.
    UWAGA: W tym przypadku wybrano 48 godzin, ponieważ rany w komórkach siTIP60 były prawie całkowicie zamknięte.
  2. Określ ilościowo migrację procentową za pomocą ImageJ, korzystając z następującego wzoru: (obszar rany w 0 h - obszar rany w "n" h) / obszar rany w 0 h x 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny schemat testu migracji komórek opartego na obrazowaniu żywych komórek
Rysunek 1A to schemat tego protokołu. Komórki MCF10A transfekowane siControl wykazywały typową morfologię nabłonka. Po wyczerpaniu TIP60, komórki MCF10A były bardziej mezenchymalne w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rysunek 1B).

Badanie skuteczności powalania TIP60...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że w procesie migracji komórek komórki mogą poruszać się w postaci przylegających arkuszy; luźne grona; lub pojedyncze, izolowane komórki. Tryb i dynamika inwazji komórek może się różnić w zależności od stanu, a fenotyp może się zmienić w ciągu kilku godzin. Tradycyjny test gojenia się ran opiera się na zdjęciach migawkowych wykonanych z mikroskopu w długim odstępie czasu, takim jak 12 lub 24 godziny. Utrudnia to uchwycenie dynamiki zamykania się rany i wzorca ruchów komórek.

Z drugie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Jha za ich pomocną dyskusję i komentarze. S.J. był wspierany przez granty z National Research Foundation Singapore i Ministerstwa Edukacji Singapuru w ramach inicjatywy Research Centers of Excellence dla Cancer Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), National Medical Research Council (CBRG-NIG; BNIG11nov001 oraz CS-IRG; R-713-000-162-511), Fundusz Badań Akademickich Ministerstwa Edukacji (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. i C.Y.T. były wspierane przez stypendium podyplomowe przyznane przez Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórka MCF10AATCCCRL-10317TMPożywka dla komórek nabłonka piersi
DMEM/F12 (1:1)Gibco11330-032Pożywka hodowlana MCF10A
Nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF)PeprotechAF-100-15Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A
ToksynaSigma-AldrichC-8052Suplementy do pożywek
hodowlanych MCF10AHydrokortyzonSigma-AldrichH-0888Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A
InsulinaSigma-AldrichI-1882Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A
Surowica domowaGibco16050-122Suplementy do pożywek hodowlanych MCF10A
TrypsynaGibco25200-056Do MCF10A odłączyć od płytki
HemacytometrFisher Scientific267110Do liczenia komórek
Opti-MEM o zmniejszonej pożywce surowicyGibco31985-070Do mieszaniny siRNA
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Odczynnik transfekcyjny
Odczynnik TrizolInvitrogen/Life Technologies15596-026Do ekstrakcji mRNA
iScript Zestaw do syntezy cDNABio-Rad170-8891Do cDNA generacja
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125czasie rzeczywistym qPCR
7500 BiosystemsMechaniczna maszyna do qPCR w czasie rzeczywistym
10-centymetrowa szalkaGreiner bio-one664160Do eksperymentu Knockdown
Płytka 24-dołkowaCellstar662160Do oznaczania gojenia ran
siControl siRNASelf zaprojektowanySamodzielnie zaprojektowanyCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNASamodzielnie zaprojektowanyUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Obserwator żywych komórekZeissZeiss Zeiss Obserwator odwróconych komórek do eksperymentów
Do szybkiego systemu PCR w z żywymi komórkami

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
  2. Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
  3. Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
  4. Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
  5. Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
  6. Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
  7. Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
  8. Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
  9. Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
  10. Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
  11. Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
  12. Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
  13. Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
  14. Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
  15. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  16. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  17. Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
  19. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
  21. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie ywych kom rektest gojenia randeplekcja TIP60kom rki nab onka piersitraktowanie siRNAmikroskopia w kontra cie fazowymsystem ledzenia kom rekprzej cie epitelialno mezenchymalneobrazowanie w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły