Method Article

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

DOI:

10.3791/56261

⸱

November 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach zarodek danio pręgowanego stał się popularnym modelem do badania biologii rozwojowej ze względu na takie cechy jak rozwój zarodka ex utero i przezroczystość optyczna. W szczególności zarodek danio pręgowanego stał się ważnym organizmem do badania organogenezy nerek kręgowców, a także rozwoju komórek wielorzęskowych (MCC). Aby uwidocznić MCC w embrionalnej nerce danio pręgowanego, opracowaliśmy połączony protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunofluorescencji całej góry (IF), który umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Ten manuskrypt opisuje naszą technikę kolokalizacji transkryptów RNA i białka jako narzędzie do lepszego zrozumienia regulacji programów rozwojowych poprzez ekspresję różnych czynników linii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, danio pręgowany (Danio rerio) stał się głównym organizmem modelowym do badania biologii rozwojowej. Zarodki rozwijają się poza organizmem matki i są optycznie przezroczyste. Ponadto tworzenie ważnych narządów, takich jak oko, nerki i przodomózgowie, zachodzi szybko, a struktury powstają w ciągu zaledwie 24 godzin po zapłodnieniu (hpf). Co ważne, genom danio pręgowanego jest wysoce konserwatywny u ssaków1,2,3. Ponadto narządy danio pręgowanego i ssaków mają podobną anatomię i fizjologię. Nerka embrionalna danio pręgowanego, czyli przednercze, demonstruje wartość systemu modelowego do badania funkcji genów podczas wczesnej nefrostenezy i określania losu zachowanych populacji komórek nabłonkowych kręgowców nefron4,5,6,7,8,9,10. Podobnie, zarodek danio pręgowanego staje się coraz ważniejszy w badaniu ontogenezy MCCs11,12,13,14,15,16,17.

Jak sama nazwa wskazuje, MCC to komórki nabłonkowe charakteryzujące się wiązką ruchliwych rzęsek znajdujących się na powierzchni wierzchołkowej17. U danio pręgowanego MCC funkcjonują w przepływie płynu i są rozpraszane w sposób podobny do "soli i pieprzu" w środku każdego nefronu przednercza przez 24 hpf11,12,13,14,15,xref"16,17. Chociaż zostały one odnotowane tylko w kilku przypadkach chorób nerek u ludzi18,19,20,21, MCC są powszechne w innych tkankach ssaków, takich jak mózg i tchawica22,23,24, co stwarza szereg wyzwań dla projektowania eksperymentalnego. Eleganckie badania na różnych modelach kręgowców, w tym danio pręgowanego, wykazały konserwatywny szlak losu MCC, ze szlakiem sygnałowym Notch jako inhibitorem rozwoju MCC12,17,25,26,27. W związku z tym pręgowany stanowi łatwo dostępny model do badania genetycznych mechanizmów rozwoju MCC in vivo11,12,13,14,15,16,17.

Zarówno przejrzystość, jak i łatwa manipulacja genetyczna zarodkami danio pręgowanego okazały się nieocenionymi cechami podczas badania genetycznych i molekularnych szlaków regulujących los komórek, wzrost tkanek i rozwój wczesnego zarodka1,2,3. W związku z tym tradycyjne techniki wizualizacji transkryptów białek i genów, takie jak hybrydyzacja in situ i całe wierzchowce IF, zostały zastosowane i zoptymalizowane dla danio pręgowanego16,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Łącząc popularne protokoły dla FISH i IF, możliwe jest oznaczanie i analizowanie MCC in vivo16,28,37,38.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół wykorzystuje dorosłe rybki danio pręgowane, które są utrzymywane i pielęgnowane przez Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre Dame. Wszystkie metody pracy z dorosłymi i zarodkami danio pręgowanego zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania.

1. Utrwalenie zarodka

  1. Zbieraj zarodki danio pręgowanego za pomocą wcześniej opisanych metod39,40. Przy 24 hpf dodać 500 μl niespecyficznego roztworu mieszaniny proteazy (50 mg / ml) do E3 w naczyniu zarodkowym Inkubować w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Gdy zarodki zaczną wychodzić z kosmówki, usuń cały płyn z naczynia na zarodki.
  3. Umyj zarodki 2-3 razy świeżym E3, dodając około 20 ml E3, delikatnie obracając E3 w naczyniu, a następnie dekantując płyn do pojemnika na odpady płynne.
  4. Aby poddać eutanazji zarodki przed utrwaleniem, dodaj 2 ml 0,2% trikainy do E3.
  5. Przenieść zarodki do szklanej fiolki o pojemności 5 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Usunąć większość roztworu trikainy/E3 za pomocą pipety po tym, jak zarodki osiądą na dnie fiolki.
  6. Utrwalić 24 zarodki hpf za pomocą 5 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 2 - 4 godziny w temperaturze pokojowej, bez mieszania.
    UWAGA: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA powinny być obsługiwane pod kapturem chemicznym, podczas gdy badacz ma na sobie okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny. Przygotowanie utrwalacza PFA z granulowanego proszku PFA powinno być wykonywane z wyjątkową ostrożnością, ponieważ granulowany PFA ma tendencję do rozpraszania się pod wpływem ładunków elektrostatycznych.
    UWAGA: Zarodki mogą utrwalać się w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Przygotować 4% PFA, podgrzewając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) do wrzenia, ciągle mieszając roztwór, aby całkowicie rozpuścić granulowany PFA. Gdy roztwór ostygnie z powrotem do temperatury pokojowej, 4% PFA jest sterylizowany filtrem, przepuszczając go przez jednorazowy system 0,45 μm do filtracji próżniowej, a następnie i rozdzielany na porcje o pojemności 15 ml lub 50 ml do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  7. Usunąć 4% PFA i przemyć zarodki dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem z 0,1% Tween-20 (PBST) w temperaturze pokojowej stężenia. Umyć zarodki raz 5 ml 100% metanolu (MeOH) w temperaturze pokojowej stężenia. Dodać 5 ml świeżego 100% MeOH do zarodków i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 min.
    UWAGA: Zarodki można przechowywać w 100% MeOH w temperaturze -20°C, aż będą gotowe do przygotowania zarodków.

2. Przygotowanie zarodków i hybrydyzacja

  1. Ponownie nawodnić zarodki, myjąc je raz na 5 ml 50% MeOH w 1x PBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj nawadnianie, myjąc zarodki w 5 ml 30% MeOH w 1x PBST przez 5 minut w RT. Umyj zarodki w 5 ml 1x PBST dwa razy po 5 minut w RT.
  2. Przepuszczalność zarodków poprzez inkubację w 5 ml roztworu 1:1 000 proteinazy K (pK) (10 mg / ml) w 1x PBST przez 2 minuty w RT.
    UWAGA: Starsze zarodki mogą być inkubowane dłużej niż 2 minuty w stężeniu pK podanym powyżej, jednak dla zarodków poniżej 24 hpf sugeruje się stężenie 5 mg/ml i czas inkubacji krótszy niż 2 minuty.
  3. Usunąć roztwór pK i natychmiast przemyć w 5 ml 1x PBST dwa razy w temperaturze pokojowej. Utrwalić zarodki w 5 ml 4% PFA w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut
    UWAGA: Zarodki mogą wiązać się w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć PFA i przemyć dwukrotnie w 5 ml 1x PBST w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieś zarodki w 5 ml 1x PBST do probówek do mikrowirówek z płaskim dnem umieszczonych pionowo na stojaku do mikrowirówek w temperaturze pokojowej, aby ułatwić interakcje między każdym zarodkiem a późniejszym roztworem hybrydyzacyjnym
    6. .
  6. Umyć zarodki dwukrotnie w 1,5 ml roztworu do hybrydyzacji (Hyb+) w temperaturze pokojowej. Dodać 1,5 ml świeżego Hyb+ i inkubować zarodki w temperaturze 70 °C w piecu do hybrydyzacji przez 4-6 godzin.
  7. Zastąp 1,5 ml Hyb+ objętością roztworu sondy (10 μl sondy RNA/500 μl Hyb+) wystarczającą do całkowitego pokrycia zarodków.
    UWAGA: Zsyntetyzuj antysensowną sondę RNA przy użyciu wcześniej opisanych metod39.
  8. Sondę należy hybrydyzować przez noc w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 70 °C z pojedynczymi probówkami umieszczonymi pionowo na stojaku do mikrowirówek, bez wstrząsania.

3. Gorące pranie i blokowanie

UWAGA: Mycie na gorąco odbywa się poprzez nałożenie odpowiedniego roztworu na zarodki, a następnie inkubację w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 70 °C. Aby roztwory myjące utrzymywały się w temperaturze 70 °C, należy umieścić 50 ml probówek każdego roztworu w piecu do hybrydyzacji po dodaniu mieszaniny sonda/Hyb+.

  1. Wyjmij sondę. Umyj zarodki dwukrotnie w temperaturze 70 °C w 1,5 ml 50% buforu formamidu/2x soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC) przez 20-30 minut każdy.
    UWAGA: Sonda może być przechowywana w Hyb+ w temperaturze -20 °C i ponownie użyta w późniejszym terminie.
  2. Umyć zarodki raz w temperaturze 70 °C w 1,5 ml 2x SSC przez 15 min. Umyć zarodki dwukrotnie w temperaturze 70 °C w 1,5 ml 0,2X SSC przez 20-30 minut każdy. Zastąp 0,2x SSC 1,5 ml odczynnika blokującego i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Możliwe jest inkubowanie odczynnika blokującego w temperaturze pokojowej przez 4 godziny zamiast przez noc.

4. Inkubacja przeciwciał i płukanie buforem kwasu maleinowego

UWAGA: Chroń zarodki przed światłem otoczenia.

  1. Zastąp odczynnik blokujący 0,2 ml odczynnika anty-DIG-POD w odczynniku blokującym w stosunku 1:1 000 i inkubuj przez 3 godziny pod folią lub inną osłoną blokującą światło w RT.
    UWAGA: Alternatywnie, przeciwciało może inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Po 3 godzinach przemyć zarodki w 1,5 ml buforu kwasu maleinowego 2-4 razy przez 10-15 minut każdy w temperaturze pokojowej. Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C w 1,5 ml świeżego buforu kwasu maleinowego.
    UWAGA: Nie jest konieczna inkubacja w buforze kwasu maleinowego przez noc, ale zmniejsza to tło sondy.

5. Sonda do wykrywania i usuwania peroksydazy

UWAGA: Chroń zarodki przed światłem otoczenia.

  1. Usuń bufor kwasu maleinowego i zastąp go 1,5 ml 1x PBS. Umyj zarodki dwukrotnie w 1,5 ml 1x PBS przez 5 minut każdy w RT. Inkubuj zarodki w 0,2 ml fluorescencyjnego roztworu barwiącego Cy3 przez 60 minut w RT.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić dla różnych sond.
  2. Umyj zarodki raz 1,5 ml następującego procentu MeOH w 1X PBS przez 10 minut w temperaturze RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH i 100% MeOH.
  3. Inkubować zarodki z 1,5 ml 1% H2O2 w MeOH przez 30 minut w temperaturze pokojowej Umyj zarodki dwa razy przez 5 minut każdy w temperaturze RT w 1,5 ml 1x PBS.
    UWAGA: Zarodki można przechowywać w PBS przez noc w temperaturze 4°C.

6. Immunofluorescencja

UWAGA: Chroń zarodki przed światłem otoczenia.

  1. Płukać zarodki w 1,5 ml ddH2O przez 5 minut w temperaturze pokojowej przemywania zarodków. Myć zarodki w 1,5 ml wstępnie schłodzonego acetonu (przechowywanego w temperaturze -20 °C) przez 7 minut w temperaturze pokojowej przepyskiwania. Płukać zarodki raz w 1,5 ml ddH2O przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płukać zarodki raz na 1,5 ml 1x PBST z 1% DMSO (PBDT) przez 5 minut w suchej temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować zarodki w 1,5 ml PBDT + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na bujaczku w temperaturze RT przez 2 godziny.
  3. Usuń PBDT + FBS i zastąp 1,5 ml przeciwciał pierwszorzędowych, antyacetylowaną tubuliną (wytwarzaną przez mysz) i anty-γ-tubuliną (wytwarzaną przez królika), rozcieńczonymi razem w stosunku 1:400 w PBDT + 1% FBS. Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od przeciwciała pierwszorzędowego. Testowanie różnych przedziałów czasowych może być konieczne w celu optymalizacji etykietowania.

7. Przeciwciało drugorzędowe

UWAGA: Chroń zarodki przed światłem otoczenia.

  1. Aby usunąć nadmiar niezwiązanego przeciwciała z zarodków, przemyj 1,5 ml PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl przez 1 minutę w temperaturze pokojowej na kołysce.
  2. Umyj zarodki 5 razy w 1,5 ml PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl przez 30 minut każdy na kołysku w RT. Umyj zarodki w 1,5 ml PBDT + 1% FBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce.
  3. Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C w 200 μl drugorzędowych przeciwciał, Alexa 488 koziej anty-mysiej IgG i Alexa 647 koziej anty-króliczej IgG, rozcieńczonych razem w PBDT w stosunku 1:500.

8. Barwienie DAPI

UWAGA: Chroń zarodki przed światłem otoczenia.

  1. Szybko umyj zarodki w RT w 1,5 ml PBDT dwa razy. Zastąp PBDT 1,5 ml DAPI, rozcieńczonym w stosunku 1:15000 w 1X PBST i inkubuj 15 minut w temperaturze RT na kołysce.
  2. Umyj zarodki w 1,5 ml PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl trzy razy w RT przez 15-20 minut każdy. Przechowuj zarodki w 1,5 ml PBDT w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do zamontowania i zobrazowania.

9. Montaż i obrazowanie dla pręgowanego

  1. Połóż zarodek bocznie na szkiełku w małej objętości, około 10 μl, PBDT.
  2. Ściśnij zarodek za oczami za pomocą cienkich kleszczy, aby usunąć głowę i część kulki żółtkowej.
  3. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie zeskrob pozostałą kulkę żółtka z ciała zarodka. Usuń zdysocjowane żółtko i nadmiar płynu ze szkiełka za pomocą cienkiej chusteczki.
  4. Dodaj kroplę pożywki montażowej do pozostałego ogona zarodka i ustaw tak, aby ogon był ułożony bokiem. Umieść szkiełko nakrywkowe na ogonie, aby spłaszczyć próbkę, a następnie umieść w zakrytym pudełku na szkiełka.
  5. Obraz rzęsek nerki w 60-krotnym powiększeniu na mikroskopie konfokalnym za pomocą następujących kanałów: DAPI w kolorze niebieskim (zestaw laserowy na 408,0 nm), FITC w kolorze zielonym (zestaw laserowy na 488,0 nm), znakowany barwnikiem Cy3 na czerwono (zestaw laserowy na 561,0 nm) i Alexa 680 w kolorze białym (zestaw laserowy na 637,0 nm).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki danio pręgowanego typu dzikiego zostały utrwalone na poziomie 24 hpf i natychmiast przygotowane zgodnie z powyższym opisem. Rysunek 1 przedstawia eksperymentalny przebieg pracy wraz z wybranymi ilustrowanymi etapami. Przepływ pracy opisany w krokach 1-8 obejmuje procesy pobierania próbek, utrwalania i manipulowania utrwaloną tkanką w celu znakowania endogennych transkryptów za pomocą antysensownych rybosond, a następnie immunofluorescencji w celu znakowania białka (ów) będącego przedmiotem zainteresowania. Krok 9 w procesie pracy odnosi się do technik montażu i obrazowania zaprojektowanych specjalnie w celu optymalizacji wizualizacji pnia embrionalnego danio pręgowanego. Na rysunkach dołączonych do Kroku 9 ilustrujemy metodę manipulacji w celu ułożenia tkanki na szkiełku podstawowym. Na tym etapie usuwa się głowę zarodka i kulkę żółtka, pozostawiając ogon umieszczony z boku między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Sugeruje się usunięcie kulki żółtka i głowy w celu uzyskania najlepszego obrazowania populacji MCC rezydenta w przednerczu, ponieważ kulka żółtka ulega autofluorescencji i utrudnia proces montowania.

Reprezentatywne obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu konfokalnego znajdują się w Rysunek 2, który pokazuje ten sam zarodek typu dzikiego przy 60-krotnym powiększeniu i cyfrowym powiększeniu przy tym samym powiększeniu. Górne panele dostarczają obrazy każdego pojedynczego kanału, podczas gdy dwa dolne panele są złożoną nakładką tych danych obrazowania. Białe pole (na obrazie w lewej kolumnie) wyznacza obszar, na którym skupia się zoom cyfrowy (obraz w prawej kolumnie). Podświetlone w ostatnim panelu zoomu cyfrowego, jądra zostały oznaczone w DAPI, a MCC wykryto na podstawie antysensownej rybosondy zaprojektowanej do rozpoznawania odf3b, gdzie przeciwciała przeciwko γ-tubulinie oznaczają ciała podstawne, a α-tubulina oznacza rzęski. W cyfrowym powiększeniu nakładki kompozytowej żółte przerywane kółko wskazuje obwód MCC, który został zidentyfikowany z powodu posiadania transkryptów odf3b, wielu ciał podstawnych i rzęsek. Sąsiednia komórka monorzęskowata, oznaczona żółtym kropkowanym kółkiem, została zidentyfikowana na podstawie fenotypu posiadania pojedynczego ciała podstawnego i pojedynczej rzęski.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat eksperymentalnego schematu blokowego. Ten schemat blokowy przedstawia eksperymentalny przepływ pracy, któremu towarzyszą ilustracje krytycznych etapów, w których płatek śniegu wskazuje inkubację w zimnie, trzy zakrzywione linie reprezentują ciepło, a zegar reprezentuje długi czas inkubacji. Przepływ pracy może być wykonany w ciągu co najmniej 6 dni (patrz numer dnia w prawym górnym rogu każdego etapu procesu), chociaż niektóre kroki mogą być wykonywane w dłuższych okresach czasu, jak zaznaczono w protokole. Szczegółowy obraz procesu montażu jest narysowany, pokazując ostatni zamontowany ogon zarodka między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. przerywana ramka wyznacza obszar, który jest obrazowany w 60-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki wizualizacji MCC przednercza danio pręgowanego. Maksymalne projekcje obrazu zarodka danio pręgowanego typu dzikiego o wartości 24 hpf przy 60-krotnym powiększeniu, a także zoom cyfrowy na konfokalny przy 60-krotnym powiększeniu tego samego zarodka. Białe pola wskazują obszar, na którym ustawiono ostrość, aby powiększyć. Poszczególne barwniki DAPI (jądra), odf3b (MCC), γ-tubuliny (ciała podstawne) i α-tubuliny (rzęski) są znakowane, a następnie łączone ze sobą w dwóch dolnych panelach. W zoomie cyfrowym podajemy przybliżenia lokalizacji komórek w następujący sposób: MCC jest obrysowany przerywanym żółtym kółkiem, a przerywane żółte kółko wyznacza komórkę monorzęskową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany powyżej jest zoptymalizowany pod kątem znakowania MCC w przednerczu za pomocą transkryptów odf3b i α-tubuliny w 24 zarodkach zebry zebry hpf. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zaleca się stosowanie świeżo utrwalonych i przygotowanych zarodków. Można wykorzystać zarodki, które zostały utrwalone i były przechowywane w MeOH lub Hyb+ w temperaturze -20 °C przez okres dłuższy niż jeden tydzień, ale prawdopodobieństwo niepożądanego zabarwienia tła wzrasta wraz z czasem, w którym zarodki są przechowywane w magazynie.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów związanych z tą techniką są konieczne, aby dostosować tę metodę do innych zestawów poszczególnych markerów, np. innych rybosond antysensownych i innych przeciwciał. Wiele metod dostosowywania parametrów etapów w procesie hybrydyzacji całego montażu in situ zostało wcześniej udokumentowanych przez naszą grupę i innych 31,34,36,38,39. Podobnie, każde przeciwciało białkowe będzie wymagało pewnego rozwiązywania problemów pod względem czasu barwienia, a przybliżone zakresy rozcieńczeń i czasów inkubacji dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego najlepiej oszacować na podstawie oceny udokumentowanych wyników28,35. W przypadku zarodków młodszych niż 24 hpf leczenie pK powinno być krótsze niż 2 min, podczas gdy zarodki starsze niż 24 hpf powinny być leczone pK dłużej niż 2 min. Również zarodki starsze niż 24 hpf powinny zostać wybielone z pigmentu przed leczeniem pK.

Po barwieniu roztworem do barwienia fluorescencyjnego bardzo ważne jest usunięcie wszelkich pozostałych plam, przeciwciał i peroksydaz poprzez wykonanie serii płukań metanolem i nadtlenkiem wodoru. Bezpośrednie płukanie PBS jest niezbędne do usunięcia nadmiaru metanolu z zarodków. Co ważne, przed przystąpieniem do badania przeciwciał IF stwierdziliśmy, że płukanie acetonem i wodą dejonizowaną sprawia, że zarodki są mniej skłonne do przylegania do siebie i/lub probówek wirówkowych. Z naszego doświadczenia wynika, że przeciwciała przeciwko specyficznym czynnikom transkrypcyjnym i innym genom, chociaż mogą działać skutecznie w zachodnich plamach, nie działają dobrze w przypadku IF u danio pręgowanego. Jednak wysoce konserwatywne i obfite białka, takie jak α-tubulina i β-katenina, działają dobrze u danio pręgowanego na IF16,37.

Dzięki FISH możliwa jest wizualizacja transkryptów RNA genów, które nie mają jeszcze specyficznych przeciwciał u danio pręgowanego. Łącząc FISH z IF, jak wykazano w tym protokole, kolokalizację transkryptów RNA i białka można zaobserwować in vivo (ryc. 2). Elastyczny charakter protokołu umożliwia szybkie rozwiązywanie problemów związanych z wizualizacją różnych transkryptów i białek RNA w wielu tkankach i punktach czasowych. W połączeniu z już szanowanymi cechami zarodków danio pręgowanego, ten protokół FISH + IF stanowi kolejne narzędzie do badania ekspresji genów i białek ważnych dla regulacji szlaku rozwojowego.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant R01DK100237 dla R.A.W. oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship No. DGE-1313583 do A.N.M. Dziękujemy również College of Science Summer Undergraduate Research Fellowship Program za wsparcie dla M.U. Chcielibyśmy podziękować Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre Dame za ich oddaną opiekę nad naszym danio pręgowanym. Chcielibyśmy również podziękować Wydziałowi Nauk Biologicznych, a także członkom naszego laboratorium za całe ich wsparcie i cenne spostrzeżenia.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
niespecyficzny roztwór mieszaniny proteazRoche11459643001, pronaza ze Streptomyces griseusRozcieńczyć w E3 bez błękit metylenowy, aby otrzymać roztwór podstawowy 50 mg/ml; przechowywać w temperaturze -20° Roztwór
E3Rozcieńczyć 50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 w wodzie destylowanej) w wodzie destylowanej; dodać 1 x 10-5 M błękitu metylenowego (sigma M9140) w celu zahamowania zanieczyszczenia
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian)FlukaA5040-250GAby przygotować 0,2% roztwór podstawowy, rozpuść 1 g proszku tricainy w 10 ml Tris, pH 9,5 i woda destylowana do 500 ml
Naczynia z zarodkamiVWR351029
szklane fiolki o pojemności 5 mlWheaton225012
jednorazowe plastikowe pipety PasteuraVWR414004-004
4% roztwór paraformaldehydu (PFA)Usługi mikroskopii elektronowej19210Rozpuść 4% PFA w 1X PBS i doprowadź do wrzenia pod wyciągiem. Ostudzić i podwielokrotnić, a następnie przechowywać w temperaturze -20& stopni Celsjusza. Nie zamrażać ponownie po rozmrożeniu do użycia.
10X PBSAmerican BioanalyticalAB11072Rozcieńczyć w wodzie destylowanej, aby uzyskać 1X
zapas Tween-20Amerykański AB02038 BioanalitycznyZrób 0,1% bulion Tween-20, rozcieńczając go w wodzie destylowanej.
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami z 0,1% Tween 20 (PBST)SigmaP94160,1% Tween-20 w 1X PBS
metanol (MeOH)Sigma34860-4L
proteinaza KRoche3115879001Rozpuść w wodzie destylowanej, aby uzyskać zapas 10 mg / ml; porcji i przechowywać w temperaturze -20° C
probówki do mikrowirówek z płaskim dnemVWR87003-300; 87003-298
formamidAmerykański AB00600 bioanalitycznyprzechowywać w temperaturze -20°
Roztwór do hybrydyzacji C (HYB+)50% formamidu, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg / ml RNA toruli drożdżowej, 50 μ g/μ Heparyna L; przechowywać w temperaturze -20°
Piec do hybrydyzacjiFisher Scientific13-247-10Q
20X roztwór buforowy soli i cytrynianu sodu (SSC)American BioanalyticalAB13156rozcieńczyć w wodzie destylowanej, aby uzyskać 2X i 0,2X zapasy blokujące
roztwór odczynnikaRoche11096176001rozcieńczyć w buforze kwasu maleinowego, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy; przechowywać w temperaturze 4°
Roztwór buforowy kwasu maleinowegoC SigmaM0375 i S7653150mM kwas maleinowy, 100mM NaCl (pH 7,5)
anty-Digoxigenin-POD, fragmenty FabRoche11207739910przechowywać w 4° C
Cy3 fluorescencyjny roztwór barwiącyPerkinElmer, Inc.NEL744001KT, sklep systemowy TSA Plus Cyanin3w 4° C; przygotować świeży roztwór barwiący, rozcieńczając odczynnik TSA (rozpuszczony w 60 μl DMSO) w roztworze buforowym zestawu
Nadtlenek wodoru (H2O2)SigmaH1009-500mLprzechowywać w temperaturze 4° C
destylowana klasy molekularnej (ddH2O)Mediatech25-055-CM
acetonAmerican BioanalyticalAB00636-01000przechowuj podwielokrotność w temperaturze -20° C
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10438-034podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° C
monoklonalny antyacetylowany klon tubuliny 6-11B-1Sigma-AldrichT6793podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20& stopni; Przeciwciało
anty-γ-tubulinowe C produkowane w podwielokrotności królikaSigma-AldrichT5192i przechowywane w temperaturze -20& deg; C
odf3b klon cDNA MGC: 63985OpenBiosystemsIMAGE: 6792478przechowywać zapas glicerolu bakteryjnego w temperaturze -80° C
NaCLAmerican BioanalyticalAB01915-05000
Mąka Alexa 647 kozia anty-królik IgGLife TechnologiesA21245sklep pod adresem 4° C; chronić przed światłem
Alexa fluor 488 koza anty-mysz IgGLife TechnologiesA11029sklep pod adresem 4° C; chronić przed światłem
DAPILife TechnologiesD1306podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20& deg; C
szkiełkoszklane Thermo-Fisher4445
szkiełko nakrywkoweThermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
drobne kleszczeRobozRS-1050Dumont Pęseta wzór #55
nośnikmontażowy Polysciences, Inc.18606, sklep Aqua-Poly/Mountpod adresem 4°
Mikroskop konfokalny C i związane z nim oprogramowanieUżywamy mikroskopu konfokalnego Nikon C2plus z elementami NIS Wahacz oprogramowania
AR Bio-Rad1660710EDU
C C woda

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).">Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).">Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  3. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).">Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).">Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).">Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).">Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).">Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).">Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).">Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).">Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).">Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).
  14. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).">Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).">Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).">Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).">Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).">Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).">Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).">Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).">Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).">Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).">Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).">Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).">Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).">Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).">Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).">Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).">Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).">Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).">Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).">Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).">Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).
  36. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).">Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).">Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).">Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).">Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).
  40. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).">Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiciliated CellsZebrafish EmbryoWhole Mount FISHImmunofluorescence ProtocolRNA Protein Co localizationConfocal MicroscopyODF3BAcetylated Alpha TubulinGamete TubulinPronephros Imaging

Related Articles