Artykuł metodologiczny

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/56274

⸱

30 października 2017

 , 
1Center for Stem Cell Biology and Engineering, University of California, Santa Barbara

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy solidną metodę kierowania różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Celem dostarczenia szczegółowego i dokładnego protokołu jest jasne zademonstrowanie każdego kroku i udostępnienie go badaczom w tej dziedzinie. Protokół ten skutkuje jednorodną warstwą RPE przy minimalnym lub zerowym ręcznym rozbiorze. Przedstawiona tutaj metoda okazała się skuteczna w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Dodatkowo opisujemy metody kriokonserwacji pośrednich banków komórek, które pozwalają na długotrwałe przechowywanie. RPE wygenerowane przy użyciu tego protokołu mogą być przydatne do modelowania choroby iPSC w naczyniu lub do zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek barwnikowy siatkówki to monowarstwa pigmentowanych komórek, która zapewnia kluczowe wsparcie dla fotoreceptorów. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pełnią wiele funkcji w widzeniu, w tym absorpcję światła, transport składników odżywczych i jonów, cykl retinoidów, fagocytozę zewnętrznego segmentu fotoreceptora i wydzielanie czynnika wzrostu1. Istnieje wiele dystrofii siatkówki, które wpływają na funkcję RPE i powodują utratę wzroku, w tym zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki. Wytwarzanie RPE z pluripotencjalnych komórek macierzystych może ułatwić badania mające na celu zrozumienie tych chorób oczu i może stanowić nieograniczone źródło RPE w terapiach komórkowych2. W rzeczywistości wiele badań klinicznych jest w toku z wykorzystaniem RPE pochodzącego z pluripotencjalnych komórek macierzystych3.

Ten protokół różnicowania został pierwotnie opisany przez Buchholz4 i był oparty na wcześniej opublikowanej metodzie Clegg5. Procedura naśladuje normalny proces rozwojowy in vivo, aby skierować niezróżnicowane pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku losu RPE poprzez manipulację insulinowymi czynnikami wzrostu (IGF), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF-2; FGF-basic), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β) i szlaki WNT4,5. Protokół został znacznie ulepszony przez dodanie agonisty szlaku WNT pod koniec protokołu, który dał 97,77% ± 0,1% komórek dodatnich w białku premelanosomowym (PMEL) i został dostosowany do warunków wolnych od kseno-xeno-the6,7. Wykazano, że uzyskane RPE wykazują ekspresję markerów RPE na poziomie transkryptu i białka, wydzielają znane czynniki wzrostu RPE o odpowiedniej polarności i przeprowadzają fagocytozę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów8. Protokół ten jest szybszy i bardziej niezawodny niż "spontaniczne" protokoły różnicowania, które polegają na prostym usunięciu podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów8. Co więcej, dane z sekwencjonowania RNA pokazują, że RPE uzyskane przy użyciu tego protokołu są bardzo podobne do tych uzyskanych przy użyciu bardziej powszechnego podejścia spontanicznego8. Metoda 14-dniowa generuje RPE, które pasują do "5 P" wymienionych przez Mazzoni9 (pigmentowany, spolaryzowany, fagocytarny, postmitotyczny, wielokątny)9. Chociaż procedura ta okazała się powtarzalna w wielu laboratoriach, pragniemy zwrócić uwagę na kilka dodatkowych metod ukierunkowanego różnicowania, które zostały opublikowane w ostatnich latach10,11,12,13.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników na dzień 0 do dnia 14 protokołu

  1. Przygotuj następujące składniki pożywki:
    1. Przygotuj 100 ml pożywki do różnicowania siatkówki (RDM), dodając 1 ml 100x suplementu N2, 2 ml 50x suplementu B27 i 1 ml 100x aminokwasu endogennego (NEAA) do 96 ml zmodyfikowanej mieszanki pożywki egzogennej i składników odżywczych F12 9 (DMEM/F12) firmy Dulbecco.
    2. Przygotować 10 ml 1 M nikotynamidu (NIC), rozpuszczając 1.221 g NIC w 8 ml sterylnej wody, wirując i doprowadzając objętość do 10 ml sterylną wodą. Sterylny przefiltrować roztwór.
  2. Przygotuj następujące czynniki wzrostu i małe cząsteczki:
    1. Rozpuść rekombinowaną mysią nogginę, ludzki inhibitor szlaku sygnałowego Dickkopf WNT 1 (DKK-1) i IGF-1 do 100 μg / ml każdy w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze buforowanym fosforanem (PBS). W razie potrzeby podsycić i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
    2. Rozpuść zasadę FGF do 10 μg/ml i rekombinowaną ludzką/myszą/szczurzą aktywinę A do 100 μg/ml każdy w 0,1% BSA w PBS. W razie potrzeby podatkować i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
    3. Rozpuść SU 5402 (inhibitor kinazy tyrozynowej swoisty dla receptora FGF) i CHIR99021 (kinazę syntazy glikogenu 3, GSK-3β, inhibitor) do 10 mM każdy w dimetylosulfotlenku (DMSO). Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C odpowiednio przez okres do 1 roku lub 6 miesięcy.
  3. Na dzień 0 i/lub dzień 14 otrzymać: 1x roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,2 g EDTA na 1 l PBS), 1x PBS -/- (PBS bez wapnia i magnezu, pH 7,4), 1x enzym dysocjacyjny podobny do trypsyny (TDE), DPBS (PBS Dulbecco), podłoże wspomagające RPE (RSM) i dichlorowodorek Y-27632 (stosować przy 10 μM).

2. Dzień 0: Dzień pasażu pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu różnicowania

  1. Hoduj kolonie komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmowiska, surowicy do około 80% konfluencji przed pasażem.
    UWAGA: Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat optymalizacji tego kroku.
  2. Pokryj 12-dołkową płytkę hydrożelem na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECMH) zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
  3. Podzielić objętość RDM i PBS -/- potrzebną na dzień 0 i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C przed dodaniem czynników wzrostu. Doprowadź EDTA do temperatury pokojowej.
  4. Dodaj czynniki wzrostu niezbędne dla dnia 0 do podgrzanego RDM z 10 mM NIC, 50 ng/ml noggin, 10 ng/mL DKK-1 i 10 ng/ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 100 μl NIC, 5 μl noggin, 1 μl DKK-1 i 1 μl IGF-1 do 10 ml RDM.
  5. Wybierz, aby usunąć wszystkie zróżnicowane kolonie na podstawie morfologii z komórek macierzystych, które będą pasażowane w celu różnicowania. Użyj końcówki pipety P10, aby ręcznie usunąć zróżnicowane komórki.
    UWAGA: Komórki fibroblastyczne między koloniami, jak również nieprzezroczyste komórki w koloniach wskazują na zróżnicowane komórki, które mają zostać usunięte. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zróżnicowanych komórek.
  6. Przejść przez pojedynczą studzienkę 6-dołkową płytki do 4 dołków 12-dołkowej płytki (1:4).
    UWAGA: Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat pasażowania komórek macierzystych na tym etapie.
    1. Odessać pożywkę z komórek macierzystych z komórek macierzystych i raz umyć studzienki 2 ml wstępnie podgrzanego PBS -/-.
    2. Odessać PBS -/- i przepłukać każdą studzienkę trzy razy 1 ml EDTA na dołek na płytce 6-dołkowej.
    3. Delikatnie przechylić płytkę i zassać EDTA. Nie należy w żaden sposób potrząsać płytką, aby uniknąć przedwczesnego podnoszenia komórek.
    4. Po trzecim praniu dodaj 1 ml EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej w kapturze przez 3-5 minut. Nie należy naruszać płytki podczas tej inkubacji.
    5. Odessać EDTA i dodać 1 ml RDM na dołek, który zostanie wysiew 0,5 ml dodatkowej pożywki. Na przykład, umyj 1 dołek z płytki 6-dołkowej 4,5 ml RDM, aby ułożyć płytkę na 4 dołkach płytki 12-dołkowej.
    6. Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie odłączyć komórki. Zbierz wszystkie komórki w stożkowej probówce i rozdziel komórki w RDM, pipetując w górę iw dół 5 razy. Dysocjuj duże skupiska komórek, ale nie dziel się na zawiesinę pojedynczej komórki. Rozprowadzić komórki równomiernie w pipecie. Wykonaj ten krok szybko, aby zapobiec ponownemu przymocowaniu do płyty.
    7. Komórki nasienne na 12-dołkowych płytkach pokrytych ECM (1 ml zawiesiny komórek na basenik).
    8. Przechyl płytkę do przodu i do tyłu, aby równomiernie rozprowadzić komórki w studzienkach. Delikatnie umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do następnej zmiany pożywki.
    9. Zanotuj dokładny czas. Zmieniaj podłoże o tej samej porze każdego dnia.

3. Dzień 1 do 14: Dodanie czynników wzrostu

  1. Dzień 1: Zmień pożywkę we wszystkich studzienkach (1 ml na studzienkę) za pomocą RDM ze składem czynnika wzrostu na dzień 0 (patrz krok 2.4).
  2. Dzień 2: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na studzienkę) z 10 mM NIC, 5 ng / ml FGF-basic, 10 ng / ml noggin, 10 ng / ml DKK-1 i 10 ng / ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodać 100 μl NIC, 5 μl FGF-basic, 1 μl noggin, 1 μl DKK1 i 1 μL IGF1 do 10 ml RDM.
  3. Dzień 4: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na dołek) ze 100 ng / ml aktywiny A, 10 ng / ml DKK-1 i 10 ng / ml IGF-1. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodać 10 μl aktywiny A, 1 μl DKK1 i 1 μl IGF-1 do 10 ml RDM.
    UWAGA: Obserwuj, że na tym etapie komórki zlewają się.
  4. Dzień 6: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na studzienkę) ze 100 ng / ml aktywiny A i 10 μM SU 5402. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 10 μl aktywiny A i 10 μl SU 5402 do 10 ml RDM.
  5. Dni 8, 10 i 12: Zmień pożywkę za pomocą RDM (1 ml na dołek) ze 100 ng/ml aktywiny A, 10 μM SU 5402 i 3 μM CHIR99021. Z zapasów opisanych w kroku 1.2 dodaj 10 μl aktywiny A, 10 μl SU 5402 i 3 μl CHIR99021 do 10 ml RDM.

4. Dzień wzbogacenia do przejścia 0 RPE

  1. Pokryj 6-dołkową płytkę czynnikiem wzrostu o obniżonym ECMH zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4 °C.
  2. Podzielić potrzebną objętość DPBS i 1 ml RDM na studzienkę wzbogacania i ogrzać w łaźni wodnej do 37 °C. Doprowadzić TDE do temperatury pokojowej i ogrzać niezbędną objętość RSM, odczynnika przeciwdrobnoustrojowego i Y-27632 do 37 °C.
  3. Dodaj odczynnik przeciwdrobnoustrojowy i Y-27632, uzyskując kompozycje odpowiednio 0,5x i 10 μM do RSM. Używaj tego podłoża przez pierwsze 4-7 dni, aby poprawić przywiązanie.
  4. Odessać zużytą pożywkę ze wszystkich studzienek i dodać 1 ml na studzienkę wstępnie podgrzanego RDM (nie są wymagane czynniki wzrostu).
  5. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ręcznie wypreparuj i zeskrob wszystkie komórki inne niż RPE za pomocą końcówki do pipety P10.
    UWAGA: Przykłady można znaleźć w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
  6. Po rozbiorze odessać RDM i wszystkie resztki komórek. Umyć dwukrotnie 1 ml wstępnie podgrzanego DPBS na studzienkę.
  7. Dodać 0,5 ml TDE do dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie usunąć komórki z płytki. Użyj pipety P1000, aby delikatnie rozprowadzić zawiesinę komórki/TDE, pipetując w górę i w dół 3-4 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
  8. Rozcieńczyć zawiesinę ogniwa/TDE w stosunku 1:10 we wstępnie podgrzanym RSM, bez Y-27632. Zawiesinę komórek wirować w temperaturze 173 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w RSM za pomocą 10 μM Y-27632 (1 ml na wzbogaconą studzienkę).
  10. Odcedź komórki za pomocą sitka z nylonowej siatki z porami 40 μm. Policz liczbę komórek w określonej objętości za pomocą hemocytometru i oblicz stężenie komórek w odcedzonym roztworze.
  11. Komórki nasienne na czynniku wzrostu zredukowały płytki pokryte ECM przy 1 x 105 komórek/cm2 w 4 ml RSM z 10 μM Y-27632.
  12. Wymień RSM na 10 μM Y-27632 48 h po wysiewie komórek i kontynuuj wymianę pożywki co 3-4 dni (np. w poniedziałki i czwartki). Nie wymieniaj 10 μM Y-27632 po 4-7 dniach.
  13. Pozostawić komórki do dojrzewania przez 28–35 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Kontynuuj wymianę RSM co 3-4 dni (np. w poniedziałki i czwartki).

5. Dojrzewanie: Przejście 1 i 2 RPE

UWAGA: objętości są wskazane dla 1 dołka płytki 6-dołkowej lub kolby T75, jak wskazano w nawiasach.

  1. Między 28 a 35 dniem pasażu 0 pokryć 6-dołkową płytkę (kolbę T75) ECMH zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Podzielić potrzebną objętość DPBS i RSM i ogrzać w łaźni wodnej do temperatury 37 °C. Doprowadzić TDE do temperatury pokojowej.
  3. Odessać zużyte podłoże ze studzienek i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 2 ml (10 ml) wstępnie podgrzanego DPBS.
    UWAGA: Nie używaj 10 μM Y-27632.
  4. Odessać DPBS i dodać 1 ml (5 ml) TDE. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Po inkubacji obejrzyj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki kurczą się i odłączają.
  5. Za pomocą skrobaka do komórek o odpowiedniej wielkości delikatnie usunąć komórki z dna studzienki lub kolby.
  6. Użyj końcówki P1000 (pipeta serologiczna 10 ml), aby delikatnie rozprowadzić zawiesinę komórki/TDE w górę iw dół 3-4 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
  7. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:10 w RSM. Zarezerwować 2 ml (5 ml) RSM do przepłukania studzienki/kolby i dodać do rozcieńczonej zawiesiny komórek.
    UWAGA: Nie pozwól, aby czas ekspozycji na enzym przekroczył 25 minut.
  8. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 173 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml (5 ml) RSM
  10. Odcedź komórki za pomocą sitka z nylonowej siatki z porami 40 μm. Policz liczbę komórek w określonej objętości za pomocą hemocytometru i oblicz stężenie komórek w odcedzonym roztworze.
  11. Komórki nasienne na płytkach pokrytych ECMH w proporcji 1 x 10 5 komórek/cm2 w 4 ml (15 ml) RSM.
  12. Pozwól komórkom dojrzeć przez 30 dni. Kontynuuj wymianę RSM co 3-4 dni.
  13. Powtórz powyższą procedurę (kroki 5.2-5.11) w 30 dniu, aby przejść komórki z przejścia 1 do 2.

6. Tworzenie pośredniego banku komórek: Kriokonserwacja przejścia 2 dzień 3-5 RPE

UWAGA: Kriokonserwuj komórki, gdy są subkonkurujące (~50%) i nie odzyskały pigmentu.

  1. Na podstawie liczby komórek oblicz objętość pożywki do kriokonserwacji z 10% DMSO potrzebnej do ponownego zawieszenia komórek w stężeniu 3x106 komórek/ml.
  2. Wykonaj kroki od 5.2 do 5.8. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do kriokonserwacji z 10% DMSO do 3 x 106 komórek/ml i przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do fiolek kriogenicznych o pojemności 1,2 ml.
  3. Umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania przeznaczonym do schładzania w temperaturze -1 °C/min i umieścić w temperaturze -80 °C na noc. Przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Te komórki będą przechodzić 3 po rozmrożeniu. Hoduj komórki jeszcze przez 30 dni przed charakterystyką. Pasaż nasion 3 RPE przy 1,5 x 105 na cm2 po rozmrożeniu. 2,4,6,7

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda prowadzi do wytworzenia jednorodnej, pigmentowanej i prostopadłościennej monowarstwy RPE. Oś czasu w Rysunek 1 odpowiada obrazom przedstawionym w Rysunek 2. Jak pokazano w Rysunek 2A, kolonie komórek macierzystych są ciasno upakowane z określonymi krawędziami i nie ma komórek fibroblastycznych między koloniami ani nieprzezroczystych komórek w koloniach. Rysunek 2B przedstawia reprezentację niedojrzałych RPE, które są subkonfluentne. Jeśli komórki są już zlewające się na tym etapie, nie mogą rozszerzyć projekcji, które są krytyczne dla procesu różnicowania. Komórki, które są mocno zlewające się, nie będą w stanie ustanowić monowarstwy i tworzyć ścisłych połączeń, charakterystycznych dla nabłonka. Szczegółowe informacje na temat optymalizacji tego zbiegu znajdują się w sekcji dyskusji. Rysunek 2C pokazuje morfologię dwóch najczęstszych typów nie-RPE, które mogą powstać podczas tego procesu różnicowania: plam nerwowych lub fibroblastycznych. Ważne jest, aby zauważyć, że te plamy nerwowe wydają się szczególnie nieprzezroczyste pod mikroskopem preparacyjnym, podczas gdy zdefiniowane, przypominające fibroblasty plamy są prawie przezroczyste pod mikroskopem preparacyjnym. Pomocne może być oznaczenie tych obszarów na płytce do hodowli tkankowej za pomocą długopisu laboratoryjnego odpornego na etanol, aby łatwiej je zidentyfikować zarówno pod mikroskopem złożonym, jak i mikroskopem preparacyjnym. Ryciny 2D-F pokazują charakterystyczne jasne obwódki, morfologię bruku i pigmentację, które wskazują na zdrową, dojrzewającą kulturę RPE. Rysunek 3 to obraz o większym powiększeniu, aby pokazać inny wygląd w pełni dojrzałego RPE przedstawionego za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii jasnego pola. W 3 dniu 30 komórki są gotowe do charakterystyki, która została opisana w poprzednich publikacjach, w tym ekspresji RNA, ekspresji białka, wydzielania czynnika wzrostu i fagocytozy2,4,6,7. Charakterystyki te pokazują, że komórki reprezentowane na tych obrazach są nie tylko pigmentowane i prostopadłościenne, ale także fagocytarne, postmitotyczne i spolaryzowane.

figure-results-1
Rysunek 1:. Harmonogram dodawania czynników wzrostu i dojrzewania RPE. Czynniki wzrostu dodaje się do płytek 12-dołkowych w dniach 0-14. Dojrzewające RPE hoduje się w 6-dołkowych płytkach lub kolbach T75 od dnia wzbogacania do 30 dni po rozmrożeniu (pasaż 3 dzień 30). Strzałki wskazują enzymatyczne pasażowanie komórek. (A-E) poniżej osi czasu odpowiadają obrazom w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywna morfologia i zbieg dojrzewających RPE. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste bezpośrednio przed pasażowaniem w celu różnicowania (A). Niedojrzałe komórki RPE zlewają się podlej w dniu 2 (B) i przed wzbogaceniem typu pick-to-remove w dniu 14; Łaty inne niż RPE (oznaczone białymi strzałkami) pojawiają się jako łaty lub nieprzezroczyste "wstążki" (C). RPE w przejściu 0, 1 i 3 w dniu 30 (D, E i F). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Dojrzały RPE w przejściu 3: Dzień 30 Morfologia prostopadłościenna przedstawiona w kontraście fazowym (A) i pigmentacja przedstawiona w jasnym polu (B). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda została zoptymalizowana przy użyciu zarówno ludzkich, embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z metody hodowli bez karmy i surowicy. Od czasu początkowej izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w 1998 r. i wyprowadzenia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w 2007 r., opracowano wiele metod hodowli komórek macierzystych 14,15,16,17. Metody te powinny być wystarczające do wytworzenia kolonii komórek macierzystych, które są podatne na to różnicowanie. Nie są znane żadne ograniczenia dotyczące możliwości zastosowania tej metody do prawidłowo uzyskanych i utrzymywanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Najbardziej krytycznymi etapami są pasażowanie komórek macierzystych do dnia 0 różnicowania (krok 2.5) oraz potencjalna potrzeba ręcznego wypreparowania w 14 dniu procesu (krok 4.5). Podczas wybierania w celu usunięcia zróżnicowanych komórek z kolonii komórek macierzystych, zapoznaj się z obrazami w Kent18. Jak wskazano, komórki fibroblastyczne między koloniami i nieprzezroczyste komórki w koloniach wskazują na zróżnicowane komórki, które należy usunąć przed rozpoczęciem tego protokołu18. Tylko niezróżnicowane, ciasno upakowane kolonie o określonych krawędziach powinny być pasażowane w celu różnicowania.

Liczba komórek macierzystych wysianych w studzience (etap 2.6.7) jest skomplikowana przez fakt, że komórki macierzyste nie mogą być rozprowadzone do zawiesiny pojedynczej komórki po pasażowaniu i nie mogą być dokładnie policzone za pomocą hemocytometru. Przybliżenie 80% zlewających się komórek macierzystych jest wskazane do przejścia 1 dołka płytki 6-dołkowej do 4 dołków płytki 12-dołkowej. Różnice między liniami komórek macierzystych, takie jak tempo wzrostu, mogą wpływać na to, jak szybko niedojrzałe RPE osiągają konfluencję między 0 a 4 dniami. Komórki macierzyste będą wytwarzać RPE niezależnie od precyzyjnej konfluencji, ale wydajność komórek będzie negatywnie naruszona, jeśli komórki są zbyt rzadkie na tym etapie. Niedojrzałe komórki RPE powinny być w około 40-50% zlewające się w 1. dniu i prawie 100% zlewające się w 4. dniu. Jeśli komórki nie wytwarzają zlewającej się monowarstwy do 4 lub 6 dnia, protokół należy powtórzyć przy większej gęstości wysiewu w dniu 0. Na przykład, jeśli 1 dołek z płytki 6-dołkowej został przepuszczony do 4 dołków płytki 12-dołkowej w dniu 0, a niedojrzałe RPE nie zlewają się w 100% w dniu 4, zmniejsz wysiew do pasażu 1:3 lub 1:2 w dniu 0 lub pozwól, aby komórki macierzyste stały się bardziej zlewające się przed pasażem. Bardzo ważne jest ustalenie stałej gęstości wysiewu podczas porównywania wielu linii komórkowych.

Etap ręcznej sekcji w 14 dniu jest konieczny tylko wtedy, gdy w hodowli obecne są komórki inne niż RPE (Figura 2C). Od czasu dodania CHIR99021 do protokołu, wiele pluripotencjalnych linii komórek macierzystych wymaga niewielkiej lub żadnej ręcznej sekcji. Niektóre preparaty mają większą częstość występowania plam nerwowych i bardzo ważne jest usunięcie tych komórek. Jeśli RPE nie są zdolne do życia w przejściu od 0 do 3, możliwe jest powtórzenie protokołu różnicowania, zabierając wystarczająco dużo czasu, aby usunąć wszystkie komórki inne niż RPE. Nie zdarza się to często, ale wspomniano tutaj, aby zauważyć, że etap sekcji w 14 dniu można zoptymalizować w razie potrzeby.

Istnieje wiele protokołów różnicowania RPE, które różnią się kosztami, a także metodami hodowli, wydajnością, kwantyfikacją i oceną funkcjonalną, z których te ostatnie zostały dokładnie przeanalizowane2. Preferujemy opisaną tutaj metodę 14-dniową ze względu na jej skuteczność, zdolność adaptacji i możliwość zastosowania do szerokiego zakresu linii komórkowych 4,7,8. Etap kriokonserwacji w tym protokole zapewnia również dużą przewagę w tworzeniu pośredniego banku komórek do wykorzystania w przyszłości, unikając zmienności między partiami w eksperymentach. Zaczynając od zaledwie 4 dołków 12-dołkowej płytki, możliwe jest rozwinięcie do 6-dołkowych płytek w przejściu 0 i kolb T75 w pasażach 1 i 2. W pasażu 2 dnia 3-5, kiedy komórki są nadal subkonfluentne i nie odzyskały pigmentu, możliwe jest kriokonserwowanie dziesiątek milionów komórek, a następnie rozmrożenie dojrzałego RPE, oznaczonego pasażem 3 dzień 30, w celu sprawdzenia ekspresji RNA, ekspresji białka, wydzielania czynnika wzrostu, fagocytozy itp. Ustaliliśmy również protokoły rozszerzające RPE na maksymalnie 13 fragmentów 19.

Patrząc w przyszłość, metoda ta będzie przydatna do modelowania iPSC choroby oka oraz do generowania RPE do terapii komórkowej. Jeśli chodzi o modelowanie choroby iPSC, protokół ten jest obecnie stosowany w laboratorium do wytwarzania RPE z linii skorygowanych za pomocą CRISPR z nieskorygowanymi kontrolami od tego samego pacjenta. Co więcej, protokół ten można dostosować do syntetycznych substratów i warunków wolnych od kseno, które są przydatne do przestrzegania dobrych praktyk produkcyjnych wymaganych w terapii komórkowej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Clegg jest współzałożycielem firmy Regenerative Patch Technologies LLC.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Garland Initiative for Vision, California Institute for Regenerative Medicine (CIRM; granty DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 i TG2-01151), The Vermont Community Foundation, The Breaux Foundation oraz Foundation Fighting Blindness Wynn-Gund Translational Research Acceleration Program.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD III z przepływem laminarnymModel BakerSG603A-HE, typ: A2, klasa: 26' Szafa bezpieczeństwa biologicznego Baker z przepływem laminarnym
Kaptur preparacyjnyLabconcoModel 3970405przepływem laminarnym
podgrzewanym stopniem
płaszczem powietrznymNikonMCO-17AIC37 oC i 5% CO2
z kontrastem odwróconych fazOlympusIX53
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media Components
DMEM/F12Gibco10565042
N2 SuplementGibco17502048
B27 SuplementGibco17504044
NEAAGibco11140050
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynniki wzrostu i odczynniki
NikotynamidSigmaN0636
Rekombinowana noggin myszyR& Systemy D1967-NG-025
Rekombinowany ludzki DKK-1R& Systemy D5439-DK-010
Rekombinowany IGF-1R& Systemy D291-G1-200
FGF-basicPeprotech100-18B
Rekombinowany człowiek/mysz/szczur Activin APeprotech120-14E
SU5402 Inhibitor FGFSanta Cruz Biotechnologysc-204308
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-FreeCorning356237zewnątrzkomórkowy hydrożel hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-qualified Matrix, LDEV-FreeCorning354277czynnik wzrostu zredukowany ECMH
strong>NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Inne odczynniki
1X Versene (EDTA)Gibco15040066
DPBSGibco14190250
1X PBS (bez wapnia, bez magnezu)Gibco10010023
TrypLE (dysocjacja trypsyna enzym, TDE)Gibco12563011
X-VIVO 10 (podłoże wspomagające RPE)LonzaBW04-743Q
Y-27632Tocris12-541-0 (1254)
CryoStor CS10BioLife Solutions210102pożywka do kriokonserwacji
1,2 ml Fiolka kriogenicznaCorning430487
Mr. Frosty (pojemnik do zamrażania)Nalgene5100-0001pojemnik do zamrażania
Odczynnik przeciwbakteryjnyNormocinInvivogenant-nr-2
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inne urządzenia
Pipet-aidDrummond4-000-101
12-dołkowa płytkahodowlana CorningCLS3516Używana podczas różnicowania.
Kolba T75Corning430641Używana podczas dojrzewania RPE.
6-dołkowa płytkahodowlana CorningCLS3513Używana podczas dojrzewania RPE.
skrobak komórkowyCorning08-771-1AUżywany podczas przejść.
sitko komórkoweFalcon352340Używany podczas przejść przed zliczeniem komórek.
: laboratoryjny mikroskop sekcyjny z Inkubator CO2 z z mikroskop <

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  3. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
  4. Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  5. Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
  6. Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
  7. Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
  8. Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
  9. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  10. Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
  11. Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
  12. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  13. Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
  15. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), New York, N.Y. 1917-1920 (2007).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
  18. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  19. Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek macierzystychpo ywka do r nicowania siatk wkiECM o zredukowanej zawarto ci czynnik w wzrostuterapia inhibitorem ROCKprotok wzbogacania kom rekpo rednie banki kriokonserwacjifunkcjonalne dojrzewanie RPEpasa owanie kom rek macierzystych

Powiązane artykuły