Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56275

⸱

20 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences, Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 5Life Science Institute, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Streszczenie

Kompletny genom suma kanałowego, Ictalurus punctatus, został zsekwencjonowany, co prowadzi do większych możliwości badania funkcji genów suma kanałowego. Nokaut genów został wykorzystany do badania tych funkcji genów in vivo. Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) jest potężnym narzędziem wykorzystywanym do edycji sekwencji genomowego DNA w celu zmiany funkcji genów. Podczas gdy tradycyjne podejście polegało na wprowadzaniu mRNA CRISPR/Cas9 do zarodków jednokomórkowych poprzez mikroiniekcję, może to być powolny i nieefektywny proces u sumów. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodków suma kanałowego białkiem CRISPR/Cas9. Krótko mówiąc, pobrano komórki jajowe i plemniki, a następnie przeprowadzono sztuczne zapłodnienie. Zapłodnione jaja przeniesiono na szalkę Petriego zawierającą roztwór Holtfretera. Objętość wstrzyknięcia skalibrowano, a następnie prowadzące RNA/Cas9 ukierunkowane na gen cząsteczki adaptera zawierającego domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM 1) i gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) zostały mikrowstrzyknięte do żółtka zarodków jednokomórkowych. Nokaut genu zakończył się sukcesem, ponieważ indele zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA. Przewidywane zmiany sekwencji białek spowodowane tymi mutacjami obejmowały przesunięcie ramki odczytu i skrócone białko z powodu przedwczesnych kodonów stop.

Wprowadzenie

Mikroiniekcja jest powszechną techniką laboratoryjną używaną do dostarczania niewielkiej ilości substancji, takich jak DNA, RNA, białko i inne makrocząsteczki do komórek lub zarodków przez szklane naczynia włosowate1. Mikroiniekcja jest wykonywana przy użyciu specjalnego zestawu sprzętu, w tym mikrowtryskiwacza, mikromanipulatora i mikroskopu2. Technika ta została wykorzystana przez naukowców do genetycznej modyfikacji wielu organizmów poprzez generowanie transgeników, nokautów genów i terapii genowej, w celu zrozumienia dynamiki składników wewnątrzkomórkowych3,4,5.

Sum kanałowy (Ictalurus punctatus) jest najpopularniejszym gatunkiem suma w akwakulturze i rybołówstwie rekreacyjnym w Stanach Zjednoczonych. Istnieje rosnąca potrzeba badania genomiki funkcjonalnej suma kanałowego, a sekwencjonowanie pełnego genomu suma kanałowego zwiększa użyteczność najnowszych osiągnięć w narzędziach do edycji genomu6,7. Zrozumienie funkcji genów nie tylko wzbogaciłoby badania prowadzone na sumach, ale mogłoby również doprowadzić do bardziej skutecznych programów doskonalenia genetycznego w celu wzmocnienia przemysłu sumowego. Po zidentyfikowaniu genów krytycznych dla danej cechy zainteresowania, można je wykorzystać do genetycznego ulepszenia produkcji sumów poprzez edycję genomu w celu wygenerowania korzystnych alleli, selekcji dla tych alleli, tłumienia szkodliwych alleli, przenoszenia korzystnych alleli poprzez transgenezę lub pewną kombinację tych opcji. Połączenie najlepszych genów dla różnych komercyjnie korzystnych cech różnych gatunków w jednej rybie znacznie poprawiłoby produktywność i rentowność operacji produkcji ryb8.

Nokaut genów to bezpośrednia metoda badania funkcji genów in vivo. Mutacje na poziomie DNA będą dziedziczone przez przyszłe pokolenia, co ułatwi badanie ich skutków w różnych pokoleniach. Opracowano różne narzędzia do edycji genomu, w tym nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) oraz system regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9)9,10,11,12.

System CRISPR/Cas9 to potężne, wydajne narzędzie, które zostało użyte do edycji sekwencji genomowego DNA, w tym nokautu genów u ryb, poprzez kontrolowane przez RNA rozszczepienie DNA specyficzne dla miejsca5,13. System składa się z przewodnika RNA (gRNA), który określa docelową sekwencję w genomie oraz enzymu endonukleazy DNA, Cas9. System CRISPR/Cas9 może być zaprojektowany tak, aby był ukierunkowany na dowolną sekwencję w genomie, co ma kilka zalet w porównaniu z ZFN i TALEN: (1) niższy koszt, (2) łatwiejsza inżynieria, (3) bardziej specyficzne wiązanie przewodnika RNA z sekwencją docelową i zmniejszone mutacje poza celem, (4) wiele sekwencji może być ukierunkowanych na różne gRNA w tym samym czasie, (5) wysoki wskaźnik mutagenezy w genach, które nie mogą być zmutowane przez TALEN, oraz (6) poprawiono szybkość transmisji mutacji w linii zarodkowej nawet 6-krotnie w porównaniu z ZFN i TALENs14,15,16,17,18.

Główną alternatywną metodą mikroiniekcji jest elektroporacja, w której impulsy elektryczne są stosowane do zarodków lub komórek w celu zwiększenia przepuszczalności błony i pobierania cząsteczek biologicznych19,20. Za pomocą elektroporacji wygenerowano kilka transgenicznych ryb, takich jak medaka (Oryzias latipes), danio pręgowany (Danio rerio), łosoś chinook (Oncorhynchus tshawytscha), sum kanałowy, dorada (Sparus sarba) i karp pospolity (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporacja została użyta do dostarczenia plazmidowego DNA, RNA i białka Cas9 do nokautowania genów. W komórkach ssaków plazmidowe DNA Cas9 / gRNA, Cas9 mRNA / gRNA i kompleksy białko Cas9 / gRNA były dostarczane za pomocą elektroporacji, a wskaźniki mutagenezy były najwyższe przy użyciu kompleksów białko Cas9 / gRNA dla większości testowanych warunków elektroporacji 27. U strunowca puchacza (Ciona intestinalis) konstrukty wykazujące ekspresję TALEN-ów zostały elektroporowane do zapłodnionych jaj w celu wywołania nokautu wielu genów28. ZFN eksprymujące konstrukty plazmidowe zostały poddane elektroporacji w celu wyeliminowania hormonu luteinizującego w kanale catfish29. Jednak po wprowadzeniu do komórki konstrukty plazmidowe będą musiały zostać przepisane na RNA i przetłumaczone na funkcjonalne białka, zanim będą mogły celować w pożądaną sekwencję DNA, co prawdopodobnie opóźniłoby czas mutagenezy w porównaniu z mikroiniekcją RNA / białka. W miarę rozwoju zarodka opóźniona mutageneza zwiększa mozaikowość założycieli, którym wstrzyknięto zastrzyk. Ponadto jest mało prawdopodobne, aby ekspresja transgeniczna osiągnęła poziom ekspresji możliwy przy mikroiniekcji, co obniża skuteczność mutagenezy.

Jako sposób na wprowadzenie narzędzi do edycji genomu do komórek, mikroiniekcja ma kilka zalet w porównaniu z elektroporacją. Cząsteczki edytujące genom mogą być niezawodnie wprowadzane do komórek lub zarodków za pomocą mikroiniekcji30. Potrzeba mniej materiału iniekcyjnego. Łatwo jest określić ilość wtryskiwanego materiału. Można osiągnąć wyższe wskaźniki mutacji z niskim mozaicyzmem u ryb założycielskich, co poprawiłoby transmisję mutacji do F1 w linii zarodkowej. Mniej ryb założycielskich musi być analizowanych w celu wytworzenia pierwszego pokolenia, ze względu na wyższy wskaźnik mutacji. W elektroporacji należy przeanalizować więcej ryb założycielskich, co zwiększy koszty. Jednak przeżywalność zarodków z mikrowstrzyknięciem suma kanałowego jest niższa niż w przypadku zarodków poddanych elektroporacji, chociaż można to przezwyciężyć poprzez wstrzyknięcie większej liczby zarodków31,32. U sumów kanałowych przeżywalność zarodków z mikrowstrzyknięciem żółtka wahała się od 16 do 55%, w zależności od docelowych genów i dawki białka gRNA/Cas932.

Regularne mikrowstrzykiwanie zarodków sumów jest technicznie wymagające i czasochłonne, jednak dla zarodków sumów kanałowych przedstawiono szybki i skuteczny protokół mikroiniekcji białka CRISPR/Cas9. Protokół ten wymaga mniej czasu i wiedzy specjalistycznej, ponieważ roztwór białka CRISPR/Cas9 jest wstrzykiwany do żółtka zarodków jednej komórki. Setki zapłodnionych komórek jajowych można wstrzyknąć w ciągu 1 godziny (mniej więcej tyle czasu potrzebnego do wystąpienia pierwszego podziału komórkowego). Aby potwierdzić słuszność protokołu, u sumów kanałowych wyeliminowano dwa geny związane z podatnością na choroby: gen cząsteczki adaptera zawierającego domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM1) oraz gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL). TICAM 1 bierze udział w szlaku sygnałowym inicjowanym przez receptor toll-podobny (TLR) 3. U suma kanałowego TICAM 1 został znacznie podwyższony po prowokacji bakteryjnej Edwardsiella ictaluri, podczas gdy został obniżony u suma niebieskiego, gatunku odpornego na E. ictaluri33. RBL odgrywa ważną rolę we wczesnym zakażeniu Flavobacterium columnare, czynnikiem wywołującym chorobę kolumnową, w której stwierdzono ostrą i silną regulację w górę u szczepu suma kanałowego podatnego na columnaris w porównaniu ze szczepem odpornym na columnaris34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten eksperyment został przeprowadzony w Jednostce Badawczej Genetyki Ryb, Centrum Badawczym Rybołówstwa E. W. Shell, Auburn University, AL. Wszystkie protokoły eksperymentalne użyte w tym eksperymencie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Auburn (AU-IACUC) przed rozpoczęciem eksperymentu. Listę sprzętu i materiałów użytych w tym eksperymencie można znaleźć w Tabeli Materiałów. Poniżej przedstawiono kroki i procedury przygotowania i mikroiniekcji jednokomórkowych zarodków suma kanałowego, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.

1. Selekcja stada czerwiowego i tarło

  1. Wybierz zdrowe stado lęgowe sumów kanałowych ze szczepu lub linii genetycznej, która Cię interesuje. Samce i samice suma kanałowego powinny wykazywać dobre drugorzędowe cechy płciowe.
  2. Wybierz samce, które mają szeroką, muskularną głowę, która jest szersza niż reszta ich ciała, z dobrze rozwiniętą brodawką narządów płciowych. Ciemny kolor, blizny i rany po walkach terytorialnych są również oznakami gotowości seksualnej. Wybierz samice, które mają głowy węższe niż reszta ciała i miękki, wyczuwalny, dobrze zaokrąglony brzuch. Dla dokładności i uniknięcia stresowania ryb podczas początkowego obchodzenia się, przestań karmić samice na 2-3 dni przed sprawdzeniem ich gotowości do tarła.
  3. Z rybami obchodzić się szybko, ale ostrożnie. Aby zmniejszyć stres związany z obsługą, wszystkie procedury wymagające obchodzenia się z samicami należy wykonywać podczas trzymania ryb w workach tarłowych (oczko o rozmiarze 32 mm).
  4. Tuż przed wstrzyknięciem hormonu w celu wywołania owulacji zmierz masę ciała samic.
  5. Zawieś worki tarłowe z samicami w środku w zbiorniku przepływowym z ciągłym przepływem wody i odpowiednim napowietrzeniem.
  6. W aseptyce należy załadować implantatora wyposażonego w igłę 14 G implantem 85 μg/kg analogu hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRHa). Przed wstrzyknięciem przepłukać miejsce wstrzyknięcia (mięśnie grzbietowe) 0,9% jałowym roztworem soli fizjologicznej. Włóż implanter pod kątem 45° i zwolnij implant. Wyjąć igłę i przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym uprzednio 70% etanolem.
  7. Umieść worek tarłowy w zbiorniku retencyjnym tak, aby ryba była całkowicie zanurzona w wodzie 15-20 cm poniżej powierzchni wody. Odpowiednie napowietrzenie (powyżej 5 ppm rozpuszczonego tlenu) i dobra jakość wody są ważne dla owulacji wysokiej jakości jaj
    8. .
  8. Przewiduj czas owulacji na podstawie temperatury wody, korzystając z relacji stodogodzina (h)35. Czas reakcji w stopniach h = czas między wstrzyknięciem hormonu a owulacją (h) * temperatura wody (°C). Na przykład, przy czasie reakcji stopnia h wynoszącym 900-1000, oczekuje się, że samica pojawi się w ciągu 36-40 godzin od wstrzyknięcia hormonu w temperaturze 25 °C. Zwykle pierwsze sprawdzenie jaj odbywa się po około 36 godzinach od wstrzyknięcia hormonu, a następnie w odstępie 4 godzin.
  9. Aby sprawdzić owulację, delikatnie unieś torbę tarłową nad powierzchnię wody, szukając jaj, które są przyczepione w torbie tarłowej. Zobaczenie co najmniej 10 jaj wskazuje, że ta samica ma owulację i jest gotowa do ręcznego rozbierania.

2. Przygotowanie nasienia

UWAGA: Nasienie można przygotować na kilka godzin przed spodziewanym czasem owulacji.

  1. Poddaj mężczyzn eutanazji poprzez uderzenie w głowę bez znieczulenia, ponieważ znieczulenie może mieć negatywny wpływ na ruchliwość plemników.
  2. Zbierz jądra na małą szalkę, usuń wszelkie tkanki i umyj je 50 ml 0,9% soli fizjologicznej, aby usunąć krew, jeśli to konieczne. Dobrze rozwinięte jądra są białe z wieloma wypustkami kosmkowymi ( Rysunek 2).
  3. Określ wagę jąder.
  4. Aby przygotować roztwór plemnika do zapłodnienia komórki jajowej, przenieś jądra do środka siatki o długości 100 cm2 100 μm za pomocą kleszczy. Złóż siatkę z jądrami w środku, zmiażdż jądra i przefiltruj plemniki do probówki o pojemności 50 ml. Można to zrobić, wywierając nacisk na jądra wewnątrz siatki na krawędź rurki zbiorczej za pomocą kciuka. Użyj 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby przepłukać plemniki z siatki do probówki zbiorczej. Roztwór soli fizjologicznej można dodać do 10 ml/g jąder.
  5. Określ stężenie plemników, sprawdź ruchliwość i żywotność.
    UWAGA: Stężenie można określić, licząc plemniki w znanej rozcieńczonej objętości mleka za pomocą hemocytometru. Alternatywnie, gęstość plemników można oszacować, oceniając gęstość optyczną mleka za pomocą spektrofotometru. W tej metodzie absorpcja przy długości fali 505 nm jest porównywana z wykresem kontrolnym, który został wcześniej przygotowany do absorpcji różnych stężeń plemników36. Ruchliwość plemników można sprawdzić pod mikroskopem jako czas od aktywacji plemnika do ustania ruchu plemników (zwany czasem trwania ruchliwości)37. Żywotność plemników można określić, barwiąc plemniki selektywnymi barwnikami, takimi jak błękit trypanowy, który barwi tylko niezdolne do życia plemniki, podczas gdy żywotne plemniki pozostaną niezabarwione. Jednak w przypadku tych procedur mikroiniekcji nie jest to konieczne, jeśli jądra są dobrze rozwinięte.
  6. Przechowywać nasienie w 0,9% soli fizjologicznej z kroku 2.5 w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 24 godzin po przygotowaniu.

3. Pobieranie i zapłodnienie komórek jajowych

  1. Nałóż bardzo cienką warstwę tłuszczu warzywnego na czystą, suchą miskę tarłową o średnicy 20 cm.
  2. Umieść samicę w roztworze znieczulającym zawierającym 100 ppm buforowanego sulfonianu metanu trikainy z wodorowęglanem sodu (pH roztworu końcowego powinno wynosić 7,0), aż ryba zostanie całkowicie znieczulona38.
    UWAGA: Sulfonian metanu trikainy może działać drażniąco w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę.
  3. Ostrożnie wyjmij rybę z torby tarłowej i zanurz ją w 0,9% soli fizjologicznej, aby zmyć roztwór znieczulający. Całkowicie osusz rybę czystym ręcznikiem, unikając usuwania warstwy śluzu z powierzchni ciała ryby.
  4. Nałóż tłuszcz warzywny na obszar wokół otworu wentylacyjnego, w tym płetwy brzuszne, aby zapobiec przyczepianiu się jaj podczas ręcznego strippingu.
  5. Ręcznie rozbieraj jaja do natłuszczonej miski tarłowej, delikatnie naciskając na jajniki. Dobre jaja powinny swobodnie płynąć, mieć złocistożółty kolor i mieć minimalne lub żadne grudki lub skrzepy krwi (Rysunek 2). Unikaj kontaktu jaj z wodą przed zapłodnieniem, ponieważ woda może stymulować zamykanie mikropyli.
  6. Aby zapłodnić jaja do mikroiniekcji, przenieś 200–300 jaj do natłuszczonej szalki tarłowej. Natłuszczone plastikowe etykiety na rośliny mogą być używane jako łyżka do przenoszenia jaj do natłuszczonej szalki tarłowej. Dodaj 1-2 ml roztworu nasienia (z kroku 2.5) do komórek jajowych i delikatnie wymieszaj. Stosunek plemników do komórki jajowej powinien wynosić około 11 000 plemników / komórkę jajową.
  7. Dodaj słodką wodę do jaj, aby aktywować plemniki i jaja. Dodaj tyle wody, aby lekko przykryć jajka. Delikatnie obracaj jajka przez 30 sekund. Zapłodnienie powinno nastąpić w ciągu 1–2 minut. Ważne jest, aby zapłodnić jaja, które są ułożone w jednej warstwie. Jaja sumów przylegają do siebie, co utrudnia mikrowstrzykiwanie wielu warstw zarodków.
  8. Dodaj więcej słodkiej wody do zapłodnionych jaj i pozwól im stwardnieć przez 10–15 minut.
  9. Przykryj miskę tarłową zawierającą pozostałe niezapłodnione jaja mokrym ręcznikiem, aby zapobiec wysuszeniu i nawożeniu przez kilka godzin. Zapłodnienie może odbywać się w sposób rozłożony w czasie, na przykład jedna partia 200–300 komórek jajowych może być zapładniana co 30–60 minut, aby zapewnić ciągłe dostarczanie zarodków na jednym etapie komórkowym do mikroiniekcji i kontrolować zarodki bez iniekcji. Unikaj kontaktu mokrego ręcznika z jajkami, ponieważ jajka mogą przylegać do mokrego ręcznika, utrudniając ich usunięcie. W tym protokole jaja zapłodnione w ciągu 2–3 godzin po strippingu były skutecznie mikroiniekowane i odnosiły podobne sukcesy jak jaja zapłodnione bezpośrednio po strippingu.

4. Ciągnięcie i ładowanie igły

  1. Przeciągnij kapilarnę ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm do 2 igieł (Rysunek 3). Przechowuj igły w papierowym pudełku z kawałkiem gąbki, w którym wykonano kilka nacięć. Aby uniknąć złamania igły, średnica gąbki powinna być mniejsza niż długość trzpienia igły.
  2. Otwórz końcówkę igły, łamiąc mały kawałek najcieńszego obszaru igły za pomocą ostrego przedmiotu. Alternatywnie otwórz igłę, ściskając najcieńszy obszar końcówki kleszczami pod mikroskopem.
  3. Przygotować roztwór do wstrzykiwań, mieszając gRNA z białkiem Cas9. Inne rodzaje RNA lub białka mogą być również wstrzykiwane za pomocą tej samej procedury. W tym protokole gRNA zostały zaprojektowane tak, aby celować w dwa geny związane z odpornością suma kanałowego, gen cząsteczki adaptacyjnej zawierającej domenę toll / interleukiny 1 (TICAM1) i gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) i przygotowane zgodnie z Shah i wsp. z wykorzystaniem polimerazy Taq o wysokiej wierności32,39. Celami genomowymi dla gRNA były 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' dla genu TICAM 1 (Figura 4) i 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' dla eksonu 1 genu RBL z podkreśloną sekwencją motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (Ryc. 6).
    1. BLAST kieruje cele RNA względem sekwencji genomu suma kanałowego i wybiera te, które nie mają potencjalnych miejsc poza celem.
    2. Dodaj czerwień fenolową, aby zabarwić mieszankę białek gRNA/Cas9 do jednej trzeciej całkowitej objętości.
    3. Dostosuj końcowe stężenie mieszanki białek gRNA/Cas9 wodą wolną od nukleaz tak, aby każdemu zarodkowi wstrzyknięto 50 nL zawierające około 2,5 ng gRNA i 7,5 ng białka Cas9. Przed użyciem inkubować mieszaninę przez 10 minut na lodzie.
  4. Za pomocą mikroładowarki załaduj 5–10 μl mieszaniny gRNA/Cas9 do igły iniekcyjnej, wkładając mikroładowarkę do trzpienia igły i powoli usuwając mieszaninę, jednocześnie chowając końcówkę mikroładowarki (Rysunek 3). Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza w środku.
  5. Przymocuj igłę do uchwytu mikropipety i upewnij się, że jest ona szczelnie podłączona, a następnie przymocuj uchwyt do mikromanipulatora. Zapewnij swobodny, stabilny ruch. Zastosować ciśnienie do mikroiniekcji, otwierając butlę z azotem i regulując regulator ciśnienia.
    UWAGA: Na objętość wstrzyknięcia może mieć wpływ ciśnienie, średnica otworu igły i czas trwania wstrzyknięcia. Aby określić objętość do wstrzyknięcia, należy wstrzyknąć do kropli oleju mineralnego umieszczonej na hemocytometrze. W razie potrzeby ciśnienie, czas wstrzyknięcia i średnicę igły można dostosować w celu zwiększenia lub zmniejszenia objętości wstrzyknięcia. Wstrzyknąć wielokrotnie do oleju mineralnego, aby zapewnić stałą objętość.

5. Mikroiniekcja zarodków sumów

  1. Nałóż bardzo cienką warstwę tłuszczu warzywnego na czystą 100 mm szalkę Petriego.
  2. Za pomocą natłuszczonej plastikowej etykiety na rośliny przenieś 50–100 jaj z szalki do nawożenia na szalkę Petriego i przykryj je roztworem Holtfretera (tabela materiałów). Ułóż jajka względem siebie w jednej warstwie. To wyrównanie powinno utrzymać jaja na miejscu podczas procesu mikroiniekcji.
  3. Umieść szalkę Petriego z jajkami na stoliku mikroskopu i przytrzymaj ją jedną ręką. Opuść igłę drugą ręką (Rysunek 3), aż przebije kosmówkę i żółtko jednym płynnym ruchem. Końcówka igły powinna znajdować się jak najbliżej blastodysku przed podaniem materiału do wstrzykiwań.
    1. Wcisnąć pedał, aby wprowadzić materiał do wstrzykiwań do żółtka. Jeśli blastodysk nie jest wyraźnie widoczny, materiał do wstrzykiwań można rozprowadzić w różnych miejscach w żółtku. Aby to zrobić, igła jest wprowadzana do drugiego końca żółtka, a następnie wciskanie pedału i wyjmowanie igły odbywa się jednocześnie, aby rozprowadzić materiał do wstrzykiwania przez różne obszary żółtka. Do żółtka zarodków suma kanałowego można wstrzyknąć do 50 nanolitrów, jednak ilość białka gRNA/Cas9 musi być zoptymalizowana dla każdego genu, aby osiągnąć najlepsze wyniki w zakresie szybkości mutacji i przeżywalności zarodka32.
  4. Wycofaj igłę płynnie, aby nie uszkodzić jajka. Przesunąć szalkę Petriego, aby wstrzyknąć kolejne jajo zgodnie z tą samą procedurą. Należy unikać przesuwania szalki Petriego podczas wstrzykiwania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórki jajowej lub złamanie igły. Usuń jaja, które są pęknięte lub uszkodzone w wyniku mikroiniekcji. Iniekcję można rozpocząć po 15–20 minutach od zapłodnienia i kontynuować tak długo, aż zarodki są jeszcze w fazie jednokomórkowej (do około 60-90 minut po zapłodnieniu).
  5. Umieść wstrzyknięte zarodki z powrotem w roztworze Holtfretera z 10 ppm doksycykliny i ciągłym delikatnym napowietrzaniem przez 6-7 dni, aż do wyklucia40. Zmieniaj roztwór codziennie i usuwaj martwe zarodki.

6. Wykrywanie mutacji

  1. Losowo zbierz kilka wstrzykniętych zarodków po 72 godzinach od zapłodnienia, usuń żółtko i wyekstrahuj genomowe DNA. Do grupy kontrolnej należy włączyć 3–5 zarodków bez wstrzyknięć.
    UWAGA: Genomowe DNA można wyekstrahować z zarodków po usunięciu skorupek jaj i materiału żółtkowego za pomocą trawienia proteinazy K i wytrącania etanolu32.
  2. Amplifikuj segment DNA flankujący cele genomowe dla gRNA każdego genu, w którym spodziewane są mutacje, używając polimerazy Taq o wysokiej wierności32. W przypadku TICAM 1 do amplifikacji 750 pz użyto starterów 5'GCTGCTGAATGTCTGATGATG 3' (do przodu) i 5'GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (do tyłu), podczas gdy do wzmocnienia RBL użyto starterów 5'TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (do przodu) i 5'AGAGATTAGTCACACATTATT 3' (do tyłu) (do przodu) i 5' do amplifikacji segmentu 375 pz z genu RBL.
    1. Użyj następującej reakcji PCR: do 20 μl wody klasy PCR; 1x bufor reakcyjny enzymu Taq o wysokiej wierności z MgCl2, 0,2 mM mieszaniny dNTP, 0,4 μM dla każdego startera do przodu i do tyłu tego samego zestawu, 100-300 ng genomowego DNA i 1,25 jednostki mieszanki enzymów Taq o wysokiej wierności. Przeprowadzić warunki cykliczne PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty; 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 55 s dla TCAM i 40 s dla RBL, przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 min/kb; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
  3. Wykryj zmutowane zarodki za pomocą metody wykrywania mutacji, takiej jak sekwencjonowanie oczyszczonych produktów PCR, test wykrywania mutacji geodewody, test mobilności heterodupleksowej, utrata miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego lub jakakolwiek inna metoda wykrywania mutacji, która jest odpowiednia dla celu. W tym protokole wykrywaj zmutowane zarodki za pomocą testu wykrywania mutacji geodezyjnych dla TICAM 1 i utraty miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego SapI, a także sekwencjonowania oczyszczonych produktów PCR dla genu RBL.
  4. Aby zidentyfikować zmutowane allele, klonuj produkty PCR i wektory sekwencyjne z poszczególnych kolonii. Zmutowane allele przedstawione w Rycina 4 i Figura 6 pochodziły z wstrzykniętych zarodków. Produkty PCR z sześciu mikrowstrzykniętych i 3 kontrolnych zarodków dla każdego genu połączono w dwóch oddzielnych probówkach, jednej dla zarodków z mikrowstrzyknięciem, a drugiej dla zarodków kontrolnych, szybko klonowanych i zawierających 86 wektorów dla TICAM 1 i 48 wektorów dla genu RBL, w tym 8 reakcji sekwencjonowania z 3 kontrolnych zarodków bez wstrzyknięcia dla każdego genu.
  5. Aby zidentyfikować różne zmutowane allele, porównaj sekwencje ze zmutowanych zarodków z sekwencją typu dzikiego za pomocą dowolnego narzędzia do dopasowywania sekwencji DNA, takiego jak BLAST lub T-COFFEE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować wydajność protokołu mikroiniekcji, przeprowadzono mikroiniekcję gRNA zaprojektowanych do celowania w gen cząsteczki adapterowej zawierającej domenę receptora toll/interleukiny 1 (TICAM1) oraz gen lektyny wiążącej ramnozę (RBL) u suma kanałowego.

TICAM 1
Sekwencjonowanie DNA wektorów z poszczególnych kolonii pochodzących z puli sklonowanych produktów PCR ujawniło indukowane mutacje typu i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodków suma kanałowego w celu uzyskania nokautu genu. Wstrzyknięcie białka CRISPR/Cas9 do żółtka jest znacznie prostsze, oszczędza czas i nie wymaga intensywnego szkolenia w porównaniu z mikrowstrzykiwaniem blastodysku zarodka jednokomórkowego, co jest powszechną techniką transferu i edycji genów u ryb30,42. Obecny protokół okazał się skuteczny w indukowaniu indeli w genach TICAM 1 i RBL suma kanałowego. Te nieza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez USDA-NIFA award 2015-67015-23488 dla Rogera Cone. Autorzy dziękują dr Ronaldowi Phelpsowi za opis kryteriów selekcji stad lęgowych w filmie. Ahmed Elaswad i Karim Khalil chcieliby podziękować Egipskiemu Biuru Kultury i Edukacji w Waszyngtonie za sfinansowanie ich badań doktoranckich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Implant ReproboostCenter of Marine BiotechnologyAnalog hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LHRHa) do indukcji owulacji u samic suma kanałowego
TRICAINE-SWestern Chemical. Inc.Do uspokojenia ryb hodowlanych podczas wstrzykiwania hormonów i usuwania jaj
Czerwień fenolowaSigma-AldrichP02900,5%, sterylny filtrowany
Mikroskop stereoskopowyOlympus213709Do wizualizacji jaj podczas mikroiniekcji
MikroiniektorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MPPI-3Do dostarczania materiału iniekcyjnego do zarodków
MikromanipulatorASI-Applied Scientific Instrumentation Model MM33 Do trzymania i kontrolowania ruchu igły iniekcyjnej.
Eppendorf MicroloaderEppendorf5242956.003Do ładowania roztworu do wstrzykiwań do igieł do mikroiniekcji.
Pionowy ściągacz igiełDavid Kopf InstrumentsModel 720Do wyciągania igieł do mikroiniekcji
Cas9 białkoPNA Bio Inc. CP01Rekombinowane białko Cas9 ze Streptococcus pyrogenes.
Rozwiń system PCR High FidelityPLUS  Roche Diagnostics, USADo PCR i amplifikacji matryc DNA do stosowania w preparacie gRNA
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientifico średnicy zewnętrznej 1 mm (OD), do wytwarzania igieł do mikroiniekcji.
Szalka PetriegoVWR25384-302Do przytrzymywania zarodków podczas mikroiniekcji.
CriscoThe J.M. Smucker CompanyTłuszcz warzywny do powlekania patelni tarłowych i szalek Petriego. 
Roztwór HoltfreteraHome Made59 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 0,76 mM CaCl2, 1,67 mM MgSO4 do inkubacji mikrowstrzykniętych zarodków do wyklucia.
Hykulan doksycykliny USP (monohydrat)Letco Medical690904Antybiotyk dodawany do roztworu Holtfretera w ilości 10 ppm w celu zapobiegania infekcjom bakteryjnym.
.

Bibliografia

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191(2017).
  8. Dunham, R. A. Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , 2nd, CABI. (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841(1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N. Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. Pinkert, C. A. , Elsevier BV. Amsterdam. 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , Auburn University. AL. Ph.D. thesis (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. Anesthetics in aquaculture. , Southern Regional Aquaculture Center Publication 3900. Stoneville, Mississippi. (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055(2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  44. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, Elsevier. 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622(2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genetics. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5'splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nokaut genuprotok mikroiniekcjiiniekcja embrion wgen TICAM1gen RBLprzewodz ca RNAroztw r Holtfretera
Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.