Artykuł metodologiczny

Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu

DOI:

10.3791/56276

⸱

17 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje model osteolizy kalwarii mysiej poprzez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoliza wywołana cząstkami jest główną przyczyną aseptycznego rozluźnienia w przypadku niepowodzenia endoprotezoplastyki, ale podstawowy mechanizm pozostaje niejasny. Ze względu na długie okresy obserwacji niezbędne do wykrycia i sporadyczne występowanie, ocena patogenezy osteolizy indukowanej cząstkami w przypadkach klinicznych jest trudna. W związku z tym do dalszych badań potrzebne są optymalne modele zwierzęce. Mysi model osteolizy kalwaryjnej ustalony przez ekspozycję na cząstki CoCrMo jest skutecznym i ważnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu. W tym modelu cząstki CoCrMo zostały najpierw uzyskane za pomocą wysokopróżniowego prądu stałego z trzema elektrodami i ponownie zawieszone w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami w stężeniu 50 mg/ml. Następnie 50 μl powstałej zawiesiny nałożono na środek mysiej kalwarii po oddzieleniu okostnej czaszki przez ostre rozwarstwienie. Po dwóch tygodniach myszy zostały złożone w ofierze i zebrano okazy kalwarii; Oceny jakościowe i ilościowe przeprowadzono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz mikrotomografii komputerowej. Mocne strony tego modelu to prostota procedury, ilościowa ocena utraty masy kostnej, szybkość rozwoju osteolizy, potencjalne zastosowanie modeli transgenicznych lub knockout oraz stosunkowo niski koszt. Model ten nie może być jednak używany do oceny siły mechanicznej i przewlekłych skutków cząstek podczas aseptycznego poluzowywania. Mysi model osteolizy kalwarycznej generowany przez ekspozycję na cząstki CoCrMo jest idealnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami zużywającymi się a różnymi komórkami, np. makrofagami, fibroblastami, osteoblastami i osteoklastami, w aseptycznym rozluźnieniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aseptyczne rozluźnienie jest najczęstszą przyczyną niepowodzenia całkowitej endoprotezoplastyki stawu biodrowego (THA) i całkowitej endoprotezoplastyki stawu kolanowego (TKA), co wymaga operacji rewizyjnej1. Jednak podstawowy mechanizm pozostaje niejasny2. Wymagana jest długa obserwacja, aby wykryć osteolizę wywołaną cząstkami, której występowanie jest rzadkie; Dlatego trudno jest zbadać jego patogenezę w przypadkach klinicznych. W związku z tym dalsze badania koncentrujące się na złożonych mechanizmach komórkowych i tkankowych wymagają zarówno eksperymentów in vivo w modelach osteolizy indukowanej cząstkami zużycia, jak i testów in vitro w komórkach związanych z homeostazą kości3. Prawidłowy model zwierzęcy jest ważny w ujawnianiu wpływu cząstek zużycia na utratę masy kostnej, dostarczając dowodów do dalszych testów komórkowych.

Model mysiej osteolizy kalwarycznej skonstruowany przez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo jest skuteczną i ważną metodą oceny interakcji między cząstkami a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu. W tym modelu cząsteczki CoCrMo powodują osteolizę kalwarii poprzez indukcję cytokin zapalnych w makrofagach, aktywację osteoklastów, hamowanie proliferacji osteoblastów i promowanie apoptozy osteoblastów.

Stworzenie tego modelu zajmuje tylko dwa tygodnie. Osteolizę można uwidocznić i określić ilościowo za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz mikrotomografii komputerowej (mikro-CT)2. Ponadto model ten ma stosunkowo niski koszt, a transgeniczne i nokautujące modele myszy mogą być używane do badania przesiewowego dużej liczby związków w różnych dawkach3.

Procedura tworzenia i oceny tego modelu jest prosta. Najpierw cząstki CoCrMo uzyskano za pomocą wysokopróżniowego prądu stałego z trzema elektrodami i ponownie zawieszono w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stężeniu 50 mg/ml. Następnie 50 μl powstałej zawiesiny nałożono na środek mysiej kalwarii po oddzieleniu okostnej czaszki przez ostre rozwarstwienie. Myszy zostały złożone w ofierze po dwóch tygodniach i pobrano próbki z kalwarii; Przeprowadzono analizy jakościowe i ilościowe za pomocą barwienia H&E oraz mikrotomografii komputerowej.

Model mysiej osteolizy kalwaryjnej skonstruowany przez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo jest idealnym narzędziem do oceny interakcji między cząstkami CoCrMo a różnymi komórkami, takimi jak makrofagi, fibroblasty, osteoblasty i osteoklasty, podczas aseptycznego rozluźniania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Nankinie.

1. Przygotowanie cząstek CoCrMo

  1. Otrzymaj cząstki CoCrMo za pomocą wyprodukowanego trzyelektrodowego prądu stałego o wysokiej próżni4. Umieść stop CoCrMo w przyrządzie pod próżnią 10-3 Pa, argonem i wodorem 0.04 MPa 3:2 (v/v) i prądem katodowym 650 A.
  2. Zmierz średnice cząstek CoCrMo.
    1. Dodać 1 mg cząstek CoCrMo do 1,5 ml bezwodnego etanolu.
    2. Zawiesić cząstki CoCrMo w bezwodnym etanolu za pomocą wytrząsania ultradźwiękowego o częstotliwości 28 kHz i mocy 600 W przez 5 minut.
    3. Nanieść jedną kroplę (około 20 μl) powstałej zawiesiny na stół obiektywowy transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Wykonaj serię zdjęć TEM przy napięciu przyspieszenia 200 kV i rozdzielczości 0,24 nm.
    4. Użyj dostarczonego oprogramowania, aby obliczyć średnią średnicę i rozkład wielkości cząstek w mikrofotografiach TEM.
  3. Odkażanie endotoksyn
    1. Autoklawować 50 g cząstek przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 15 psi.
    2. Wykryj endotoksyny za pomocą ilościowego testu lizatu amebocytów limulusa (LAL) (<0,25% EU/ml uznano za wskazujące na brak endotoksyny)5.
  4. Zawiesić cząstki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) o stężeniu 50 mg/ml jako roztwór podstawowy6.

2. Budowa modelu osteolizy kalwarii

  1. Znieczulenie 6-tygodniowych myszy C57BL/J6 (sześć myszy na grupę) pentobarbitalem (50 mg/kg). Użyj testu szczypania, aby ocenić poziom znieczulenia. Zapobiegaj wysuszeniu oczu zwykłą solą fizjologiczną.
  2. Umieść myszy w pozycji leżącej. Usuń sierść z czaszki za pomocą golarki i zdezynfekuj skórę za pomocą wacików medycznych zawierających 75% etanolu.
  3. W przypadku lokalizacji punktów zidentyfikuj dwa punkty, w tym punkty środkowe odpowiednio między oczami i uszami. Następnie wyznacz linię między dwoma powyższymi punktami i naciąć skórę wzdłuż powyższej linii nożyczkami (Rysunek 1A).
  4. Usuń okostną czaszki z kalwarii za pomocą skalpela (Ryc. 1B)6.
  5. Zszyj skórę na obu końcach za pomocą prostego przerywanego szwu.
  6. Wykonaj linię szwu przez środek nacięcia bez zawiązywania węzłów. Przytrzymaj dwa końce linii szwów.
  7. Osadź 50 μl zawiesiny cząstek CoCrMo (50 mg/ml, w PBS) w środku kalwarii (Rysunek 1C)2.
  8. Zawiąż ostatni ścieg w prostym przerywanym szwie (Rysunek 1D).
  9. Utrzymuj myszy przez kolejne 2 tygodnie.

3. Ocena modelu osteolizy kości kalwarycznej za pomocą mikrotomografii komputerowej

  1. Poświęć myszy dwutlenkiem węgla. Odetnij głowę myszy w płaszczyźnie poziomej. Usuń tkankę mózgową wewnątrz, a skórę i sierść na zewnątrz. Zbierz kalwarię do dalszych eksperymentów.
  2. Delikatnie oczyść całą tkankę miękką na kalwarii za pomocą pęsety. Oczyszczone kalwarie utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Zanurz kalwarię w PBS 24 godziny przed badaniem mikrotomografią komputerową.
  3. Analizuj kalwarie myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości w rozdzielczości izometrycznej 18 μm i ustawieniach energii promieniowania rentgenowskiego 45 kV i 550 mA.
  4. Przeprowadzanie trójwymiarowej rekonstrukcji danych z mikrotomografii komputerowej za pomocą oprogramowania.
  5. Analiza jakościowa i ilościowa.
    1. Najpierw wybierz kwadratowy obszar wokół szwu środkowego jako obszar zainteresowania.
    2. Po drugie, zmierz gęstość mineralną kości (BMD), objętość kości/objętość całkowitą (BV/TV), liczbę beleczkową (Tb.N), grubość beleczka (Tb.Th), separację/odstępy beleczkowania (Tb.Sp) oraz procent całkowitej porowatości za pomocą dostarczonego oprogramowania do mikro-CT.
    3. Po trzecie, porównaj trzy grupy dla różnych pomiarów za pomocą jednoczynnikowej ANOVA. Do analizy wariancji post hoc należy zastosować metodę Bonferroniego2.

4. Ocena modelu osteolizy kalwarii za pomocą barwienia H&E

  1. Odwapnić próbki kalwarii w 15% kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)-PBS w temperaturze 4 °C. Zmieniaj roztwór odwapniający codziennie przez 3 tygodnie.
  2. Odwapnione próbki zanurzyć w parafinie w celu uzyskania sześcianu o wymiarach 2 cm x 1 cm x 1 cm i pokroić je na odcinki o wymiarach 2 μm w obszarze osadzania się cząstek.
  3. Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną, jak opisano wcześniej7.
  4. Uchwyć mikrofotografie ogólnego patomorfizmu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkowane przez nas nanoskalowe cząstki CoCrMo miały średnicę około 50 nm (błąd standardowy 3,56), zgodnie z ilościowym określeniem za pomocą TEM (Rysunek 2). Po ekspozycji kalwarii myszy na cząstki CoCrMo, zwierzęta (n = 6 na grupę) utrzymywano przez kolejne dwa tygodnie. W ciągu dwóch tygodni nacięcie kalwarii zostało całkowicie zagojone, a szew może spaść. Każda miejscowa infekcja lub brak zrostu może wpływać na ocenę utraty masy kostnej. Po złożeniu ofi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieją dwie główne metody osteolizy wywołanej cząstkami zużycia u myszy: model torebki powietrznej i model osteolizy kalwaryjnej. W modelu air-pouch najpierw ustala się podskórnie generowaną torebkę powietrzną, a następnie wprowadza się cząstki ścierne i implantuje się w tkance kostnej8. Ścianka torebki naśladuje okostną w aseptycznym rozluźnieniu. Jednak implantacja kości jest nienaczyniowa i nie ma aktywności biologicznej, co utrudnia ocenę bezpośrednich interakcji między cząstkami a tkanką ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81572111), Fundację Projektu Klinicznego Nauki i Technologii Prowincji Jiangsu (BL2012002), Projekt Badań Naukowych w Nankinie (201402007), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20161385) oraz Fundację Specjalną Stowarzyszenia Chińskich Lekarzy (2015COS0810).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stop CoCrMo z protezyWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IISurowiec do otrzymywania nanocząstek CoCrMo
Wytworzony trzyelektrodowy prąd stały o wysokiej próżniCollege of Materials Science & Inżynieria, Uniwersytet TechnicznySamodzielnie zaprojektowana maszyna
6-tygodniowy samiec myszy C57BL / 6JModel centrum badań nad zwierzętami Uniwersytetu w NankinieN000013
100% etanoluNanjing OdczynnikC0691514023Rozpuszczalnik nanocząstek CoCrMo do skanowania transmisyjnego mikroskopu elektronowego
1,5 ml Probówki do mikrowirówekTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Waga mikroanalitycznaShenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTDEX125DZH
Wytrząsarka ultradźwiękowaShanghai Yuhao scientific instrument co., LTDYH-200DHAby zawiesić nanocząstki CoCrMo
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEITecnai G20
SimplePCI oprogramowanieCompix Inc.Wersja 6.6Do obliczania średniej średnicy i rozkładu wielkości cząstek.
Wysoka patelnia do sterylizacjiQIULONGYIQIKYQL-100DSDo odkażania endotoksyny
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) TestCharles RiverR13025W celu wykrycia endotoksyny 
15 ml probówki do mikrowirówekTaizhou Suyi MedicalB122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBoster Biological TechnologyAR0030Rozpuszczalnik roztworu podstawowego nanocząstek CoCrMo
Pentobarbital SodiumSigmaP3761Do znieczulania myszy
Sól fizjologiczna normalnaSACKLERSR8572EP-15Aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy
75% etanoluNanjing OdczynnikC0691560275Dezynfekcja
Bawełna medycznaShuitao1278298933Golarka do dezynfekcji
KemeiKM-3018Do golenia futra
NożyczkiRWD LIFE SCIENCES12005-10Do nacinania skóry
SzewRWD LIFE SCIENCEF34001-01Do zszywania skóry
Uchwyt igłyRWD LIFE SCIENCEF33001-01Do szycia skóry
IgłaRWD LIFE SCIENCER14003-12Do szycia skóry
Kleszcze do naczyńRWD LIFE SCIENCEF22003-09Do szycia skóry
SkalpelRWD LIFE SCIENCES31010-01Do zbioru kalwarii
PęsetaRWD LIFE SCIENCEF12006-10Do zbioru calvaria
100 &mikro; Pipety LEppendorf3120000240Do osadzania zawiesiny cząstek w calvatias
100 µ L końcówki do pipetAXYGENT-200-YDo osadzania zawiesiny cząstek w calvatias
5 ml MikroprobówkiTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4% ParaformaldehydServicebioG1101Utrwalenie
Mikro tomografia komputerowa SkyScanSkyScan1176
Kwas etylenodiaminotetraoctowyServicebioG1105Odwapnianie
ParafinaServicebio#0001
Krajalnica do parafinyLeicaRM2125RTS
Szkiełko szklaneServicebioG6004
Szkło nakrywkoweServicebio200
Zestaw do barwienia HEServicebio#1-5Mikroskop świetlny do barwienia HE
NikonE200
w Nankinie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model mysianaliza mikro tomografii komputerowej mikro TKbarwienie H Ezawiesina cz steczekokostna czaszkig sto mineralna ko ciobrazowanie TEM

Powiązane artykuły