Optyczne badania przesiewowe nowych sond specyficznych dla bakterii na ludzkiej tkance płucnej ex vivo za pomocą konfokalnej endomikroskopii laserowej

Podsumowanie

Ta technika opisuje efektywny proces przesiewowy do oceny specyficznych dla bakterii środków obrazowania optycznego w tkance płuc ex vivo ludzkiej, za pomocą światłowodowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w celu szybkiej identyfikacji kandydatów na sondy chemiczne o małym potencjale translacyjnym.

Streszczenie

Poprawa szybkości i dokładności wykrywania bakterii jest ważna dla stratyfikacji pacjentów i zapewnienia właściwego stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych. Aby osiągnąć ten cel, konieczne jest opracowanie technik diagnostycznych umożliwiających rozpoznawanie obecności bakterii w czasie rzeczywistym w miejscu opieki nad pacjentem. Obrazowanie optyczne do bezpośredniej identyfikacji bakterii w organizmie gospodarza jest atrakcyjnym podejściem. Przeprowadzono kilka prób zaprojektowania i walidacji sond chemicznych, jednak żadna z nich nie została jeszcze pomyślnie przeniesiona do praktyki klinicznej. W tym miejscu opisujemy metodę walidacji ex vivo specyficznych dla bakterii sond do identyfikacji bakterii w dystalnym płucu, obrazowaną za pomocą światłowodowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (FCFM). W naszym modelu wykorzystaliśmy ludzką tkankę płucną ex vivo i klinicznie zatwierdzoną platformę konfokalnej endomikroskopii laserowej (CLE) do badań przesiewowych nowych związków obrazowania specyficznych dla bakterii, ściśle naśladując warunki obrazowania, które można napotkać u pacjentów. W związku z tym badania przesiewowe związków za pomocą tej techniki dają pewność potencjalnej wykonalności klinicznej.

Wprowadzenie

Ta technika opisuje szybki proces przesiewowy do oceny specyficznych dla bakterii środków obrazowania optycznego w ludzkiej tkance płucnej ex vivo za pomocą CLE przy użyciu FCFM do szybkiej identyfikacji związków o potencjalnej użyteczności klinicznej do wizualizacji bakterii w dystalnym płucu in situ.

Istnieje pilna globalna potrzeba racjonowania przepisywania leków przeciwbakteryjnych w erze rosnącej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe¹. W tym celu bardzo poszukiwane są opracowania metod diagnostycznych, które działają w celu identyfikacji infekcji bakteryjnej z wysoką swoistością, czułością i w czasie rzeczywistym². Obecne techniki potwierdzania rozpoznania zapalenia płuc u pacjentów w stanie krytycznym, takich jak pacjenci na oddziałach intensywnej terapii (OIOM), często opierają się na interpretacji niespecyficznych cech klinicznych lub radiologicznych wraz z technikami hodowli bakteryjnej z aspirowanych płynów/tkanek, co może zająć do 3 dni, aby uzyskać wyniki. Co więcej, posiew bakteryjny z płynu wkraplanego do dystalnego płuca i pobranego jest podatny na zakażenie z bliższych dróg oddechowych³ i często jest ujemny z powodu jednoczesnej terapii przeciwbakteryjnej lub złych technik pobierania próbek. Ponadto techniki molekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy, są zbyt czułe, gdy są stosowane na zasysanych płynach, co grozi nadmiernym leczeniem pacjentów. Coraz powszechniejszym podejściem diagnostycznym jest molekularne obrazowanie optyczne, które umożliwia molekularną patologię tkanek in situ; Konieczne jest jednak opracowanie i walidacja związków do obrazowania optycznego. Niemniej jednak, bezpośrednia wizualizacja bakterii za pomocą aktywowanych sond optycznych jest potencjalnie bardzo potężną metodą umożliwiającą badanie obecności i ewolucji zapalenia płuc u pacjenta, a co ważne, może być wykorzystana do badania interakcji gospodarz-patogen w odpowiedzi na terapie w czasie rzeczywistym in situ.

CLE jest uznaną procedurą badawczą w wielu chorobach⁴, w tym w dziedzinach gastroenterologii5, oncology6^,7, oraz do badania dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych8^,9. Umożliwia obrazowanie strukturalne chorej tkanki w miejscu opieki nad chorą tkanką za pomocą wiązki do obrazowania włókien, która przechodzi przez kanał roboczy endoskopu klinicznego i tworzy bezpośredni kontakt z powierzchnią tkanki, która ma być obrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak jednym ograniczeniem, które pozostaje, jest konieczność stosowania generycznych środków kontrastowych. W związku z tym zastosowanie sond specyficznych dla choroby, takich jak określone czynniki bakteryjne, może znacznie rozszerzyć użyteczność tej metody poprzez bezpośrednią wizualizację bakterii w miejscu podejrzenia infekcji. Środki optyczne mają wiele zalet w porównaniu z innymi technikami, umożliwiając obrazowanie w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości z potencjałem diagnostycznym. Co więcej, sondy optyczne oferują perspektywę multipleksowania w celu przesłuchiwania wielu celów, a wszystko to osiągane przy stosunkowo niskich kosztach. W tym celu opracowywanych jest wiele środków optycznych, jednak żaden z nich nie został jeszcze pomyślnie wdrożony w clinic¹⁰. Zsyntetyzowaliśmy bibliotekę małocząsteczkowych sond chemicznych ze specyficznością w stosunku do bakterii i opracowaliśmy szybki, skuteczny potok do oceny funkcji sondy do wykrywania bakteryjnego zapalenia płuc in situ¹¹.

Aby zidentyfikować odpowiednich kandydatów na sondę, następujące warunki musiały być spełnione przed badaniem sondy na ludzkiej tkance płucnej ex vivo przez FCFM: i) rozpuszczalność w wodzie, ii) specyficzność i selektywność do szybkiego znakowania klinicznie istotnych bakterii, iii) wysoki stosunek sygnału do szumu, oraz iv) odporność na degradację w środowisku płuc. Ten ostatni oceniano za pomocą płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) od pacjentów z zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), który jest stanem charakteryzującym się środowiskiem proteolitycznym i zapalnym w płucach na OIT. Co więcej, sondy musiały być wyposażone w odpowiedni fluorofor do wykrywania przez klinicznie zatwierdzone urządzenie do obrazowania optycznego CLE w tkance wyrostka płucnego człowieka.

Potok do przesłuchania każdego z tych warunków wstępnych wyglądał następująco (na każdym etapie, tylko sondy, które przeszły, były przenoszone do następnego): (1) zsyntetyzowano bibliotekę sond do zbadania; (2) każda sonda została dodana do panelu żywych bakterii do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) w celu zapewnienia znakowania bakteryjnego; (3) selektywność znakowania bakteryjnego na komórkach ssaków w kokulturach z pierwotnymi ludzkimi neutrofilami została ustalona przez CLSM; (4) stabilność i skuteczne znakowanie bakterii w obecności pacjenta z ARDS BALF określono za pomocą spektrometrii mas CLSM i spektrometrii mas MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight); (5) optymalne stężenie kandydatów określono za pomocą CLSM, zapewniając utrzymanie selektywności dla bakterii w stosunku do komórek ssaków; (6) kandydaci zostali zobrazowani za pomocą FCFM w zawiesinie i na ludzkiej tkance pęcherzyków płucnych ex vivo w celu zapewnienia stabilności i tego, że stosunek sygnału do szumu był odpowiedni do wykrycia. Krok 6 jest szczegółowo opisany w tym protokole. Metodologia dla kroków od 1 do 5 została już wcześniej zgłoszona¹¹.

Protokół

Wszystkie ludzkie tkanki płucne zostały pobrane po uzyskaniu świadomej zgody, a badanie zostało zatwierdzone przez Regionalny Komitet Etyczny.

1. Przygotowanie próbek biologicznych

1. Przygotowanie sond
   1. Uzupełnić 1 mM roztwór podstawowy każdej sondy (np. Calcein AM, UBI-3, UBI-10 itd.) w sterylnym dH₂O, używając drobnej wagi do zważenia liofilizowanego związku sondy¹¹. Obliczyć objętość dH₂O do dodania na podstawie zważonej masy i masy cząsteczkowej sondy.
2. Przygotowanie kultur bakteryjnych
   UWAGA: W tej metodzie jako wzorcowy szczep użyto Staphylococcus aureus. Można wybrać dowolny odpowiedni szczep bakterii. Każdy komercyjny barwnik, który znakuje bakterie odpowiednimi widmami wzbudzenia i emisji, może być wybrany tak, aby pozytywnie oznaczyć bakterie.
   1. Wybierz pojedynczą kolonię pożądanego szczepu bakteryjnego ze świeżej płytki agarowej Lysogeny Broth (LB) za pomocą sterylnej pętli. Zaszczepić kolonię w 10 ml LB w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, zanurzając koniec pętli w pożywce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C, 250 obr./min przez 16 godzin (lub przez noc).
   2. Oznaczyć OD₅₉₅ w hodowli nocnej, dodając 100 μl kultury przez noc do 900 μl LB w kuwecie o pojemności 1 ml. Zmierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 595 nm (używając kuwety z 1 ml LB jako ślepą próbą) w spektrofotometrze. Pomnóż otrzymany OD przez 10, aby uzyskać OD dla kultury przez noc.
   3. Subkultura kultura z dnia na dzień. Zrób to, dostosowując gęstość optyczną przy 595 nm (OD₅₉₅) do 0,1 w 10 ml świeżego LB. Oblicz wymaganą objętość nocnej hodowli, którą należy dodać do 10 ml świeżego LB, aby dostosować OD₅₉₅ do 0,1. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 250 obr./min, aż kultura osiągnie fazę środkowego logarytmu (OD₅₉₅ 0,6 - 0,8), około 4 godzin.
   4. Zmierzyć gęstość optyczną kultury (krok 1.2.2) i zebrać 1 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU) (OD₅₉₅ ~ 1-1 x 10⁸ CFU/ml) kultury bakteryjnej do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml (np. jeśli kultura bakteryjna ma OD₅₉₅ 0,6, zebrać 1,67 ml). Odwirować kulturę przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby osadzać bakterie. Przepłukać osad dwukrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) poprzez ponowne zawieszenie (ostrożne pipetowanie w górę i w dół) osadu w 1 ml PBS, odwirowanie jak powyżej, odrzucenie supernatantu i powtórzenie. Należy uważać, aby nie usunąć osadu bakteryjnego podczas usuwania supernatantu. Zawiesić ostatnią osadkę w 1 ml PBS.
      UWAGA: Przygotuj tyle próbek, ile jest wymagane dla każdej procedury etykietowania. W tym miejscu protokół można wstrzymać na maksymalnie 1 godzinę, a następnie wykonać krok 1.2.5.1, 1.2.5.2 lub 1.2.5.3.
   5. Barwienie bakteryjne
      1. Aby oznaczyć bakterie preparatem Calcein AM, należy dodać barwnik do końcowego stężenia 1 μM do przemytej kultury bakteryjnej. Inkubować kulturę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 300 obr./min. Przemyć przeciwstawną zawiesinę bakteryjną w PBS 3 razy przez odwirowanie, jak w kroku 1.2.4, w celu usunięcia nadmiaru barwnika. Zawiesić w 1 ml PBS, rozcieńczyć 100 μL 1:1 w PBS, aby uzyskać 200 μL OD₅₉₅ 0,5 bakterii barwionych kalceiną AM. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do 1 godziny.
      2. Aby oznaczyć bakterie za pomocą sond testowych (np. UBI-3 lub UBI-10), rozcieńczyć 100 μl kultury bakteryjnej w stosunku 1:1 w PBS, aby uzyskać OD₅₉₅ 0,5 w 200 μL PBS. Dodać jedną z sond do końcowego stężenia 10 μM. Odwrócić mikroprobówkę kilka razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie bakterii i sondy.
         UWAGA: Obrazowanie należy wykonać natychmiast po dodaniu sondy, aby naśladować scenariusz kliniczny.
      3. W celu przygotowania kontrolnych niebarwionych próbek bakteryjnych należy rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:1 PBS, aby otrzymać 200 μl niebarwionej próbki OD₅₉₅ 0,5.
3. Przygotowanie ex vivo ludzkiej tkanki płucnej
   UWAGA: Próbki ludzkiej tkanki płucnej pobrano od pacjentów poddawanych chirurgicznej resekcji z powodu raka płuc. Cała tkanka użyta do obrazowania została uzyskana z próbek normalnej tkanki płucnej z dala od narośli nowotworowej. Próbki pobierano świeżo z sali operacyjnej i przechowywano w mikroprobówkach lub probówkach wirówkowych w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
   1. Bezpośrednio przed obrazowaniem należy wyjąć próbkę ludzkiej tkanki płucnej z zamrażarki na suchym lodzie. W temperaturze pokojowej pozwól tkance lekko się rozmrozić; Wystarczy go pokroić skalpelem na² sekcje 1 x 4 mm.
      UWAGA: Ważny jest poziom rozmrażania; zbyt zamrożone i chusteczka nie pokroi się bez odprysków, zbyt rozmrożona, a tkanka jest zbyt miękka, aby ją pokroić.
   2. Za pomocą kleszczy umieść pokrojoną ludzką tkankę płucną w dołkach 96-dołkowej przezroczystej płytki do hodowli tkanek o płaskim dnie. Niewykorzystaną ludzką tkankę płucną należy niezwłocznie umieścić z powrotem w pojemniku do przechowywania i umieścić na suchym lodzie w celu transportu z powrotem do zamrażarki w temperaturze -80 °C.
   3. Dodać 100 μl PBS do każdej próbki tkanki płucnej za pomocą pipety. Użyj końcówki pipety, aby upewnić się, że cała tkanka jest pokryta PBS (i nie przykleja się do ścianek studzienki). Tkanka lekko pęcznieje i może unosić się na wodzie. Pozostawić PBS na próbce na kilka minut, aby umożliwić wypłukanie krwi z tkanki do roztworu. Usuń jak najwięcej PBS. Tkanka może zablokować koniec końcówki pipety; Spróbuj ustawić płytkę/końcówkę pod kątem, aby temu zapobiec.
   4. Odpipetować 100 μl niebarwionych bakterii znakowanych kalceiną AM lub sondą testową do każdej studzienki zawierającej tkankę płucną. Skonfiguruj również kontrole z tkanką płucną i 100 μl PBS. Do tych studzienek kontrolnych można dodać sondy bez bakterii w celu pomiaru wzrostu fluorescencji tła i/lub niespecyficznej aktywacji sondy przez samą tkankę płucną. Należy również dołączyć studzienkę z tkanką płucną i PBS.

2. Obrazowanie za pomocą urządzenia CLE z FCFM

1. Konfiguracja CLE device
   UWAGA: Przygotuj system CLE 20 minut przed kalibracją, aby laser mógł się rozgrzać.
   1. Naciśnij włącznik/wyłącznik z tyłu transformatora systemu i włącz wyznaczony komputer. Naciśnij przycisk włączania/wyłączania z przodu modułu skanowania laserowego (LSU). Potwierdź pojawienie się zielonego światła, wskazującego, że urządzenie jest włączone.
   2. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania CLE. Wprowadź dane logowania i poczekaj na inicjalizację LSU (10 - 30 s).
   3. W przypadku korzystania z nowych światłowodów do obrazowania FCFM konieczna jest instalacja za pomocą dołączonej płyty CD. Włóż instalacyjną płytę CD do napędu CD komputera i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
   4. Wyczyść złącze światłowodowe do obrazowania FCFM za pomocą środka do czyszczenia światłowodów. Przetrzyj złącze na wstążce czyszczącej ruchem do przodu, aby usunąć kurz/brud. Zdejmij żółtą nasadkę ochronną z przodu LSU.
   5. Przygotuj piastę LSU, delikatnie obracając srebrną piastę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż się zatrzyma. Włóż złącze światłowodowe do obrazowania FCFM do koncentratora płaską stroną złącza skierowaną do góry. Przytrzymaj włókno na miejscu i obróć srebrną piastę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż kliknie dwa razy. Zakończ połączenie, obracając srebrną piastę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o kolejne 45°.
      UWAGA: Jeśli światłowód nie zostanie rozpoznany, sprawdź, czy światłowód obrazujący FCFM został zainstalowany i podłączony we właściwej orientacji.
   6. Postępuj zgodnie z instrukcjami, które zostaną wyświetlone, aby zakończyć kalibrację światłowodu do obrazowania FCFM. Istnieją 3 kroki: (1) test światłowodu obrazowania FCFM (kroki 2.1.7 - 2.1.8), (2) akwizycja tła (krok 2.1.9), (3) wykrywanie światłowodu (krok 2.1.10).
   7. Naciśnij przycisk "uruchom laser" na ekranie. Laser zostanie wyśrodkowany.
   8. Wybierz świeże fiolki (żółty: kalibruj; czerwony: czysty; niebieski: wypłukać) z zestawu kalibracyjnego i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie: umieść dystalny koniec światłowodu do obrazowania FCFM w żółtej fiolce i obserwuj wzrost fluorescencji na monitorze, a następnie umieść końcówkę włókna w czerwonej fiolce (bez mieszania). Poczekaj, aż fluorescencja (jak pokazano na monitorze komputera) zniknie. Na koniec przepłukać końcówkę z włókna w niebieskiej fiolce.
      UWAGA: Jeśli fluorescencja nie zniknie, wyczyść światłowód obrazowania FCFM za pomocą 8% H₂O₂ i chusteczek do czyszczenia soczewek i zacznij od nowa. Powtarzaj proces, aż do uzyskania zadowalających rezultatów (jakość obrazu jest wyraźna i nie są widoczne żadne ślady po zabrudzeniach).
   9. Umieść światłowód obrazujący FCFM w niebieskiej fiolce. Naciśnij "uruchom laser", a następnie "oblicz", gdy stanie się to opcją.
   10. Umieścić światłowód do obrazowania FCFM w żółtej fiolce. Naciśnij "uruchom laser", a następnie "oblicz", gdy stanie się to opcją.
   11. Podczas automatycznej kalibracji należy oczyścić dystalny koniec światłowodu do obrazowania FCFM, umieszczając go w czerwonej fiolce na >10 s, a następnie w niebieskiej fiolce na >4 s, zgodnie ze wskazaniami oprogramowania.
2. Zbieranie danych za pomocą CLE
   1. Po konfiguracji otworzy się okno wyboru lokalizacji przechowywania i prefiksu pliku. Wybierz żądany folder do przechowywania danych i odpowiednio nazwij prefiks.
   2. Umieść pedały nożne tak, aby operator miał do nich łatwy dostęp. Lewy pedał: laser wł./wył.; pedał środkowy: pauza; Prawy pedał: Record/Stop.
      UWAGA: Dostęp do elementów sterujących lasera można również uzyskać za pomocą elementów sterujących na ekranie.
   3. Kliknij "start" na ekranie lub naciśnij lewy pedał, aby włączyć laser. Spowoduje to rozpoczęcie akwizycji i uzyskiwania obrazów przy użyciu 100% mocy lasera i szybkości 12 klatek/s (ustawienia domyślne).
      UWAGA: W przypadku innych aplikacji ustawienia te można w razie potrzeby zmienić na ekranie, w zależności od typu próbki.
   4. Zobrazuj każdą z próbek zawiesiny bakteryjnej.
      1. Włóż dystalny koniec światłowodu do obrazowania FCFM i powoli przesuwaj włókno przez zawiesinę, aby zbadać próbkę.
      2. Nagrywaj filmy o dowolnej długości (do 10 minut), naciskając prawy pedał nożny lub wybierając elementy sterujące nagrywaniem na ekranie, ponieważ światłowód powoli porusza się wokół próbki.
      3. Oczyść dystalny koniec światłowodu obrazowego FCFM za pomocą 8% H₂O₂ i chusteczek do czyszczenia soczewek między próbkami.
         UWAGA: Typowe długości filmów wynoszące od 10 do 30 s są wystarczające do obrazowania in vitro.
   5. Zobrazuj każdą z próbek tkanki płucnej.
      1. Włóż dystalny koniec światłowodu do obrazowania FCFM do próbki, upewniając się, że następuje bezpośredni kontakt między końcem włókna a tkanką. Delikatnie przesuń koniec światłowodu obrazowego, aby zbadać próbkę.
         UWAGA: Odciągnięcie końca włókna od tkanki spowoduje usunięcie tkanki z płaszczyzny ogniskowej; Można to jednak wykorzystać do zobrazowania oznakowanych bakterii, które nie przylegają do tkanki.
      2. Nagrywaj filmy o dowolnej długości (do 10 minut), naciskając prawy pedał nożny lub wybierając elementy sterujące nagrywaniem na ekranie, ponieważ światłowód powoli porusza się wokół próbki.
         UWAGA: Zazwyczaj długość filmu wynosząca 30 s jest wystarczająca do obrazowania ex vivo tkanki.
      3. Oczyść dystalny koniec światłowodu obrazowego FCFM za pomocą chusteczek do czyszczenia soczewek i 8% H₂O₂ między próbkami.
3. Wyłączanie systemu
   1. Wyłącz laser, naciskając lewy pedał nożny lub klikając przycisk na ekranie.
   2. Odłącz światłowód obrazujący FCFM od urządzenia CLE, obracając srebrną piastę LSU w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż się zatrzyma. Odłącz światłowód obrazujący FCFM od koncentratora LSU, delikatnie pociągając złącze światłowodowe od LSU.
   3. Oczyść i zdezynfekuj włókno obrazowe FCFM za pomocą 8%_H2O₂ i chusteczek do czyszczenia soczewek. Umieść nasadki ochronne z powrotem na bliższym końcu światłowodu obrazowania FCFM i z przodu jednostki LSU. Delikatnie umieść włókno w pudełku do przechowywania.
   4. Zamknij oprogramowanie do przechwytywania danych i skopiuj wszystkie zapisane pliki na zewnętrzne urządzenie USB. Wyłącz komputer i wyłącz urządzenie LSU, naciskając we/wy na panelu przednim przez 3 sekundy, aż zniknie zielone światło.
   5. Ludzką tkankę płucną i bakterie należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.

3. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj pliki do analizy, wybierając odpowiedni katalog na komputerze za pomocą ikony "Idź do" na pulpicie nawigacyjnym oprogramowania. Alternatywnie pliki można przeciągać i upuszczać na pulpicie nawigacyjnym oprogramowania.
2. Kliknij dwukrotnie każdy plik wideo, aby go otworzyć. Filmy będą automatycznie odtwarzane ze zoptymalizowaną tabelą wyszukiwania kolorów (LUT) i dostosowaniem tabeli kolorów. Wyłącz automatyczne skalowanie intensywności, klikając przycisk różdżki nad paskiem skali intensywności. Ta funkcja jest wyłączona, gdy wokół przycisku nie ma czarnego cieniowania.
   UWAGA: Automatyczne skalowanie intensywności musi być wyłączone, aby zapobiec ciągłemu zwiększaniu kontrastu w każdym filmie, co uniemożliwia porównywanie i analizowanie filmów z tego samego zestawu danych.
3. Wybierz żądane skalowanie intensywności, przesuwając paski minimum i maksimum, aby uzyskać najlepszy kontrast. Użyj narzędzia histogramu podczas wybierania skalowania intensywności, aby upewnić się, że uchwycony jest najszerszy zakres dynamiki.
   UWAGA: Upewnij się, że zakres dynamiczny jest taki, że obrazy nie są nasycone (tj. ogranicz białe obszary obrazu, które wskazują na nasycenie), aby nie pominąć funkcji o niskiej intensywności.
4. Po osiągnięciu żądanego skalowania kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk menu rozwijanego wymieniony jako "Domyślny (zielony)". Wybierz opcję, aby zapisać tablicę LUT. Zapisz tablicę LUT w żądanej lokalizacji.
5. Dla każdego innego filmu w zestawie danych zastosuj tę samą tabelę LUT, klikając prawym przyciskiem myszy menu rozwijane "Domyślne (zielone)" i wybierając opcję "Załaduj LUT". Wybierz odpowiedni plik, aby zastosować spójne skalowanie intensywności do wszystkich filmów w zestawie danych.
6. Eksportuj przetworzone filmy, klikając przycisk "rolka filmu". Wybierz żądany format wideo, np. "do celów prezentacji", który spowoduje utworzenie pliku .mpg. Naciśnij "Eksportuj" i wybierz lokalizację pliku, aby zapisać plik wideo. Migawki pojedynczych klatek można eksportować, klikając przycisk "aparat". Możliwe jest zapisanie pliku .png, .bmp lub .jpg. Wybierz miejsce docelowe pliku i naciśnij save.
   UWAGA: Filmy można następnie zaimportować do dowolnego oprogramowania w celu przygotowania prezentacji lub dalszej kwantyfikacji. Oznaczone bakterie są wizualizowane na filmie jako zielone "" kropki. Struktura tkanki płucnej będzie widoczna jako uporządkowane pasma fluorescencyjne, z przestrzenią pęcherzyków płucnych wydającą się czarną.

Wyniki

W niniejszym badaniu zaprezentowaliśmy metodę szybkiego przesiewania nowych sond specyficznych dla bakterii w modelu infekcji tkanki pęcherzykowej płuc człowieka ex vivo przy użyciu zatwierdzonego klinicznie urządzenia CLE.

Metoda CLE z wykorzystaniem FCFM jest odpowiednia do pozyskiwania informacji strukturalnych z dystalnych części płuc, ponieważ region ten (ze względu na wysoką zawartość elastyny i kolagenu) wykazuje naturalnie silną fluorescencję przy wzbudzeniu laserem o długości fali 488 nm⁸. Z kolei przestrzeń pęcherzyków płucnych nie fluorescuje, co pozwala na wizualizację wysokiego kontrastu między strukturą tkanki a przestrzenią powietrzną (Rysunek 1).

Dodanie sond związanych z chorobą lub środków kontrastowych, takich jak sondy specyficzne dla bakterii, powinno umożliwić uzyskanie w czasie rzeczywistym informacji funkcjonalnych o procesach chorobowych. Opisaliśmy wcześniej syntezę oraz wstępne przesiewanie in vitro biblioteki sond specyficznych dla bakterii¹¹; określono w niej specyficzność bakteryjną, stabilność proteolityczną oraz retencję w błonie bakteryjnej w czasie. W ramach badania zidentyfikowano obiecującą sondę specyficzną dla bakterii (UBI-10), a także sondę wykazującą słabą retencję w błonie komórkowej bakterii (UBI-3). Zostały one porównane z kontrolą w postaci komercyjnego barwnika przeciwstawnego (Calcein AM), którego użyto do znakowania S. aureus.

Niebarwione oraz barwione Calcein AM, UBI-3 i UBI-10 S. aureus obrazowano w zawiesinie za pomocą FCFM przy 100% mocy lasera 488 nm i częstotliwości klatek 12 frames/s (Ryc. 2). W przypadku obrazowania niebarwionych bakterii w PBS nie wykryto sygnału fluorescencyjnego. Jest to przeciwieństwo wyników uzyskanych podczas obrazowania bakterii barwionych. Podczas obrazowania zawiesin bakteryjnych z UBI-3 lub UBI-10 za pomocą FCFM zauważono, że ogólna fluorescencja tła roztworu była podwyższona w porównaniu do kontroli z samym PBS; wynika to z faktu, że NBD (fluorofor sondy) emituje niewielki sygnał fluorescencyjny w roztworze wodnym, jednak w całym roztworze wyraźnie widoczne są jasne, punktowe kropki, bez konieczności przeprowadzania etapu płukania. Jest to spowodowane wzrostem sygnału fluorescencji emitowanego przez NDB w środowisku polarnym, i.e., w błonie bakteryjnej. Calcein AM nie jest sondą aktywowalną, dlatego po barwieniu bakterii konieczny był etap płukania w celu usunięcia wysokiego tła fluorescencyjnego niezwiązanej sondy w roztworze. Podobnie jak w przypadku bakterii barwionych UBI-3 i UBI-10, bakterie barwione Calcein AM były wykrywane w roztworze przez FCFM jako jasne, zielone, punktowe kropki. Ponieważ dane są zbierane w formacie wideo, kropki te wydają się „mrugać”, przemieszczając się między rdzeniami oraz wchodząc i wychodząc z ogniskowania, co jest charakterystyczną cechą obrazowania barwionych bakterii tą metodą.

Oznakowane bakterie dodano następnie do małych plasterków ex vivo ludzką tkanką płucną i ponownie obrazowano za pomocą FCFM (Rysunek 3). W przypadkach, gdy stosowano wyłącznie PBS lub nieoznaczone S. aureus dodano do tkanki płucnej, wykryto jedynie autofluorescencyjną strukturę tkanki płucnej (widoczną jako jasne zielone pasma kolagenu i elastyny oraz ciemne obszary przestrzeni pęcherzyków płucnych). W tych warunkach kontrolnych nie stwierdzono obecności punktowych kropek. Podobnie, w przypadku tkanki płucnej z, uwidoczniono jedynie strukturę tkanki płucnej (bez punktowych kropek). S. aureus plus UBI-3; co wskazuje, że sonda ta nie została stabilnie zatrzymana w błonie komórkowej bakterii t. j.zostało wypłukane i/lub uległo degradacji w obecności natywnych enzymów proteolitycznych w tkance płucnej (jak wykazano wcześniej¹¹).

Niemniej jednak, jasne punkty kropkowe były widoczne zarówno w próbce kontrolnej pozytywnej S. aureus znakowanej Calcein AM, jak i w próbce S. aureus z najbardziej obiecującą sondą specyficzną dla bakterii (UBI-10). „Mrugające” punkty były widoczne mimo silnej autofluorescencji tkanek (Rycina 3). Zatem wyniki uzyskane za pomocą FCFM były zgodne z wstępnym przesiewem panelu sond specyficznych dla bakterii in vitro wykonanym przy użyciu CLSM i wykazały klinicznie istotną metodę detekcji do obrazowania infekcji w czasie rzeczywistym.

Przedstawione tutaj wyniki wykazują, że płuca są odpowiednim układem narządowym do obrazowania metodą FCFM ze względu na ich charakterystyczną autofluorescencję. Jasne, charakterystyczne struktury pozwalają operatorowi CLE stwierdzić, że znajduje się w przestrzeni pęcherzyków płucnych. Regiony te, w połączeniu z ciemnymi pęcherzykami powietrznymi, stanowią idealne tło do obrazowania znakowanych fluorescencyjnie bakterii z wysokim kontrastem.

Choć detekcja bakterii przedstawiona w niniejszym badaniu odbywa się jakościowo poprzez wizualizację jasnych punktów, możliwe byłoby ilościowe określenie liczby tych punktów w każdej klatce za pomocą dodatkowego oprogramowania, aby w dalszym stopniu scharakteryzować biblioteki sond.

Rysunek 1: Statyczny obraz autofluorescencji tkanki płuc człowieka. Obraz z konfokalnej laserowej endomikroskopii (CLE) przedstawiający ex vivo ludzka tkanka płucna z wykorzystaniem włóknistej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (FCFM), przy wzbudzeniu 488 nm, 100% mocy lasera i 12 klatkach/s. Elastyna i kolagen wykazują silną fluorescencję (kolor zielony – sztucznie nadany), podczas gdy przestrzeń pęcherzykowa nie fluorescuje i widoczna jest jako obszary czarne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Akrama i wsp..¹¹ Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Obraz z konfokalnej endomikroskopii laserowej (CLE) znakowanych S. aureus w zawiesinie. Do obrazowania uprzednio znakowanych bakterii wykorzystano światłowodową konfokalną mikroskopię fluorescencyjną (FCFM) przy wzbudzeniu 488 nm, 100% mocy lasera i szybkości 12 klatek/s. Znakowane bakterie widoczne są jako silnie fluorescencyjne kropkowate punkty (kolor zielony jest sztuczny). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Akram et al.¹¹ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Obraz z konfokalnej laserowej endomikroskopii (CLE) tkanki płuca człowieka ex vivo z oznakowanymi S. aureus. Do obrazowania tkanki płuca człowieka ex vivo oraz oznakowanych S. aureus wykorzystano włóknistą konfokalną mikroskopię fluorescencyjną (FCFM) przy wzbudzeniu 488 nm, 100% mocy lasera i 12 klatkach/s. Oznakowane bakterie widoczne są jako silnie fluorescencyjne kropki (fałszywie kolorowane na zielono) wewnątrz próbki tkanki płucnej po oznakowaniu Calcein AM lub UBI-10. Najwyższy kontrast obserwuje się w miejscach, gdzie bakterie obrazowane są w przestrzeni pęcherzyków płucnych. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Akram et al.¹¹  Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Infekcje dolnych dróg oddechowych stanowią drugie co do wielkości obciążenie chorobami na świecie^12,13 i odnotowano znaczny wzrost liczby zakażeń przypisywanych bakteriom opornym na środki przeciwdrobnoustrojowe¹⁴. Zapalenie płuc pozostaje częstą przyczyną hospitalizacji. Na oddziałach intensywnej terapii rozwój zapalenia płuc jest spotęgowany niepewnością diagnostyczną i wiąże się z niezwykle wysoką śmiertelnością¹⁵. Na początku zapalenia płuc bakterie namnażają się w przestrzeni pęcherzykowej dystalnego płuca, obszarze, który jest stosunkowo sterylny, z minimalną mikrobiotą w zdrowiu.

Metoda ta opisuje stosunkowo późny etap walidacji ex vivo sond do obrazowania optycznego specyficznych dla bakterii¹¹, ale projektowanie, synteza i ocena sondy przed rozpoczęciem tego etapu walidacji są konieczne, jak wykazano wcześniej¹¹.

CLE to nowa technika kliniczna służąca do badania stanów chorobowych in situ w czasie rzeczywistym. Ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami badania podejrzenia patologii płuc, które mogą obejmować biopsję i pobranie płynu z płukania. Biopsje są inwazyjne i mogą powodować zachorowalność i śmiertelność u pacjentów wentylowanych, a pobrany płyn z płukania jest często zanieczyszczony bakteriami z górnych dróg oddechowych. Zastosowanie CLE w wykrywaniu zapalenia płuc jest jednak nieco ograniczone ze względu na słabą dostępność kompatybilnych sond obrazowych, które mogą dostarczyć funkcjonalnych informacji o chorobie, pomimo wielu skoordynowanych wysiłków¹⁰. Połączenie CLE ze środkami optycznymi daje perspektywę szybszego i mniej inwazyjnego diagnozowania zapalenia płuc w porównaniu z obecną standardową praktyką.

Kluczowymi krokami tego protokołu są przygotowanie próbki i konfiguracja platformy CLE. Ważne jest również uzyskanie tkanki ludzkiej istotnej dla końcowego zastosowania klinicznego, takiej jak ludzka tkanka płucna, jak wykazano w tym badaniu. Konieczne jest użycie tkanki ludzkiej, ponieważ zakres autofluorescencji tkanek wykazuje dużą zmienność międzygatunkową, a zatem może zmylić czułość obrazowanej sondy bakteryjnej. Ponadto niezbędne jest uzyskanie etyki w zakresie pobierania i wykorzystywania ludzkiej tkanki płucnej. Z technicznego punktu widzenia, prawidłowe czyszczenie, przymocowanie światłowodu obrazowania do platformy LSU do obrazowania i kalibracja są niezbędne dla dobrej rozdzielczości i spójnego obrazowania, podobnie jak zapewnienie równoważnej liczby bakterii dodanych do każdej próbki tkanki płucnej. Aby jeszcze bardziej rozszerzyć użyteczność tej metody do badań przesiewowych paneli sond, konieczne jest powtórzenie procedury z szeregiem patogenów, takich jak te, które mogą być czynnikami wywołującymi zapalenie płuc.

Największym ograniczeniem tej techniki jest to, że klinicznie zatwierdzone urządzenie CLE ma tylko jeden laser (488 nm). Dlatego obecnie wybór fluoroforu do projektowania sond jest ograniczony do użytku z tym systemem, chociaż istnieją klinicznie zatwierdzone urządzenia jednokolorowe o długości fali wzbudzenia 660 nm i bliskiej podczerwieni. Wysoce pożądane jest zainstalowanie drugiej linii laserowej w tym samym urządzeniu, aby umożliwić opracowanie sondy z wyraźnie różniącym się spektralnie fluoroforem w celu poprawy czułości sondy bakteryjnej na poziomie autofluorescencji tkanek. Chociaż dwukolorowe urządzenia CLE są w fazie rozwoju, albo nie są zatwierdzone klinicznie, albo ich koszt jest znaczny¹⁶.

CLE in vitro z wykorzystaniem bakterii chorobotwórczych i ludzkiej tkanki płucnej ex vivo do badań przesiewowych potencjalnych sond wypełnia lukę między konwencjonalnymi technikami in vitro , takimi jak cytometria przepływowa i CLSM, a użytecznością kliniczną. Ten krok daje pewność przy wyborze obiecujących związków do przeniesienia w celu połączenia z klinicznym obrazowaniem CLE; i dostarczy wskazówek, czy badana sonda zachowuje swoistość docelową, czy wykazuje jakiekolwiek znakowanie poza celem, takie jak wiązanie bezpośrednio z tkanką, lub wykazuje niestabilność z enzymami proteolitycznymi gospodarza. Istotne byłoby również dodanie każdej z aktywowanych sond bezpośrednio do próbek ludzkiej tkanki płucnej i bakterii, aby w pełni scharakteryzować szybkość wiązania i aktywacji sondy w czasie rzeczywistym.

Wierzymy, że nasze prace nad szybkimi badaniami przesiewowymi nowych sond specyficznych dla bakterii w celu oceny ich potencjału do obrazowania w dystalnym płucu pacjentów zaowocują znacznie szybszym przeniesieniem do kliniki. Dzieje się tak głównie dlatego, że specyficzna dla bakterii sonda może być dostarczana miejscowo do płuc przez cewnik wprowadzany do kanału roboczego bronchoskopu, co oznacza, że można dostarczyć ilości mikrodawek (<100 μg). W związku z tym ogólnoustrojowe dostarczanie i biodystrybucja związku nie stanowi problemu, jak ma to miejsce w przypadku wielu innych celów infekcji w organizmie lub w przypadku obrazowania jądrowego. Co więcej, dostarczenie sondy obrazowej w tak małej dawce zmniejsza ryzyko powikłań związanych z toksycznością (chociaż do translacji wymagane byłoby badanie przesiewowe toksyczności). Po wkropleniu sondy, cewnik może zostać zastąpiony włóknem FCFM i tym samym obszarem płuca badanym przez CLE, w taki sam sposób, w jaki wykonaliśmy tę metodę. Obrazowanie należy wykonać szybko po zainstalowaniu sondy, zanim sonda zostanie zmyta do niewykrywalnych stężeń.

Należy również zauważyć, że badania przesiewowe sond identyfikujących chorobę za pomocą tej techniki nie powinny ograniczać się do środków do obrazowania bakterii, ale mogą również obejmować walidację sond z alternatywnymi celami, takimi jak stan zapalny. Podejście to powinno być również możliwe do dostosowania do innych lokalizacji chorobowych w organizmie, w których obrazowanie za pomocą FCFM jest dopuszczalne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Mała mikrowirówka stołowa
96-dołkowa Corning		3370	Płytka testowa
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Komercyjny barwnik fluorescencyjny
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Konfokalne laserowe urządzenie do endomikroskopii
Cletop-S Cletop		14110601	Środek do czyszczenia włókien
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	1,5 ml probówka do mikrofuge
Eppendorf Research Plus	Fisher Scientific	11568663	Mikropipety
Falcon (50 mL)	Scientific Lab Supplies	352070	50 ml probówka wirówkowa
Gibco Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - media myjące
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Oprogramowanie do zbierania i przetwarzania danych do badań System CellVizio 488 nm
Incu-Shake midi	Sciquip	SQ-4020	Inkubator wytrząsający stojący na podłodze
Rosół lizogenny	Sigma Aldrich (Miller)	L3522	LB Pożywka wzrostowa do niestandardowych badań S. aureus
AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Włóknisty światłowód do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Zestaw kalibracyjny do systemu CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Szczep bakteryjny wykorzystany w tym badaniu
Kuweta półmikrospektrofotometryczna	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Do spektrofotometrii
Komfort termomiksera	Eppendorf	41102422	Grzejnik stołowy z wytrząsaniem
UV 1101 Fotometr biotechnologiczny	Spektrofotometr	Biochrom WPA