Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowano liczne techniki śledzenia postępu replikacji DNA w fazie S cyklu komórkowego. Większość z tych technik została ukierunkowana na wyjaśnienie miejsca i czasu rozpoczęcia duplikacji genomu, a nie jej zakończenia. Jednak bardzo ważne jest, abyśmy zrozumieli regiony genomu, które jako ostatnie zakończyły replikację, ponieważ regiony te cierpią z powodu podwyższonego poziomu pękania chromosomów i mutacji, a także są związane zarówno z chorobami, jak i starzeniem się. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób rozszerzyliśmy technikę, która została wykorzystana do monitorowania inicjacji replikacji, aby zamiast tego zidentyfikować te regiony genomu, które jako ostatnie zakończyły replikację. Podejście to opiera się na połączeniu cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu tej techniki do drożdży, podejście to można zastosować do dowolnych komórek, które można posortować w cytometrze przepływowym zgodnie z zawartością DNA.
Wprowadzenie
Replikacja genomu eukariotycznego jest inicjowana w wielu odrębnych miejscach, zwanych początkami replikacji, z których widełki replikacyjne rozchodzą się w obu kierunkach (recenzowane w Fragkos et al., 20151). Początki różnią się zarówno pod względem czasu, jak i skuteczności wypalania, a także opracowano kilka technik monitorowania aktywności początkowej replikacji i wyjaśnienia przyczyn tej zmienności. Aktywność poszczególnych źródeł można wywnioskować na podstawie poziomów jednoniciowego DNA2, który tworzy się wokół aktywnego pochodzenia, lub za pomocą elektroforezy żelowej 2D do monitorowania określonych produktów pośrednich replikacji3, z których oba można wykryć za pomocą sond radioaktywnych. Obie te techniki są łatwiejsze do zastosowania w komórkach S. cerevisiae niż w komórkach ssaków, ponieważ pochodzenie jest ograniczone do określonych znanych sekwencji w tych pierwszych. Wraz z pojawieniem się mikromacierzy stała się możliwa globalna ocena pochodzenia odpalania. Najpierw dokonano tego poprzez znakowanie DNA ciężkimi izotopami, uwalnianie komórek z bloku G1 do pożywki zawierającej lekkie izotopy, a następnie monitorowanie tworzenia ciężkiego i lekkiego hybrydowego DNA w całym genomie4. Wprowadzenie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości umożliwiło podobne monitorowanie aktywności pochodzenia w całym genomie bez konieczności kosztownego znakowania izotopowego. Komórki posortowano w cytometrze przepływowym według zawartości DNA, a ich DNA poddano głębokiemu sekwencjonowaniu. Ponieważ pokrycie sekwencji przebiega od 1x do 2x w trakcie fazy S, względny czas replikacji można ocenić, porównując głębokości odczytu komórek w fazie S z głębokościami w G1 lub G25,6. Techniki te, szczególnie zastosowane w przypadku drożdży, doprowadziły do głębszego zrozumienia, w jaki sposób sekwencja DNA, struktura chromatyny i białka replikacji DNA regulują czas pochodzenia i wydajność.
Wierne przekazywanie informacji genetycznej podczas proliferacji komórkowej wymaga nie tylko udanego zainicjowania replikacji DNA, która ma miejsce na początku procesu, ale także pomyślnego zakończenia replikacji, która ma miejsce tam, gdzie spotykają się widełki replikacyjne. Podobnie jak w przypadku rozpoczęcia replikacji, czas zakończenia replikacji różni się w zależności od genomu, przy czym niektóre regiony pozostają niereplikowane nawet pod koniec cyklu komórkowego. Takie regiony mogą być szczególnie odległe od źródeł aktywnej replikacji lub mogą zawierać sekwencje lub struktury chromatyny, które utrudniają polimerazy DNA. Późno replikujące się regiony mogą objawiać się jako delikatne miejsca, które są związane z pękaniem chromosomów i wyższymi wskaźnikami mutacji, a także są związane z rakiem i starzeniem się7,8,9. Jednak pomimo znaczenia prawidłowego zakończenia replikacji DNA w utrzymaniu stabilności genomu, nasze zrozumienie tego, gdzie i jak to się dzieje, pozostaje daleko w tyle za początkiem replikacji. I chociaż pojedyncze geny, których późna replikacja była związana z chorobą, były badane na przykład za pomocą qPCR10, brakowało globalnych badań ukierunkowanych na wyjaśnienie lokalizacji i przyczyn późnej replikacji. Tutaj opisujemy technikę, którą nazywamy "sekwencją G2", w której łączymy cytometrię przepływową z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości, aby rzucić światło na zakończenie replikacji genomu w drożdżach11. Przy niewielkich zmianach protokół ten można dostosować do dowolnych komórek, które można sortować przepływowo według zawartości DNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek do sortowania metodą cytometrii przepływowej
- Zaszczepić 15 ml probówek zawierających po 8 ml bulionu YEPD w taki sposób, aby kultury osiągnęły gęstość 5 x 10 6 do 1,5 x 107 komórek na ml po nocnym wzroście (patrz uwaga do dyskusji 1).
- Odwirować komórki drożdży (1 400 x g, w temperaturze pokojowej lub 4 °C) w probówce wirówkowej z zakrętką o pojemności 15 ml na 5 minut, ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml 70% etanolu i przenieść do probówki do mikrofugi o pojemności 1,6 ml, pozostawiając ją na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub co najmniej 3 godziny na lodzie (może być przechowywana w nieskończoność w temperaturze 4 °C) (patrz punkt dyskusji (2)).
- Odwirować komórki drożdży w mikrofrakcji (14 000 x g, 4 °C) przez 1 minutę, ponownie zawiesić w 1 ml 50 mM cytrynianu sodu o pH 7,2, odwirować (14 000 x g, 4 °C) przez 1 minutę, odessać supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml 50 mM cytrynianu sodu o pH 7,2, zawierającym 0,25 mg/ml roztworu RNAzy na 1 godzinę w temperaturze 50 °C lub przez noc w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej.
- Dodać 50 μl roztworu proteinazy K (20 mg/ml zawieszony w 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% wagowo do objętości glicerolu) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
- Odwirować komórki (14 000 x g, 4 °C), ponownie zawiesić komórki w 1 ml 50 mM cytrynianu sodu, pH 7,2, odwirować (14 000 x g, 4 °C), odessać supernatant z próżnią, ponownie zawiesić w 1 ml 1 μM szczepu zielonego kwasu nukleinowego zawieszonego w 50 mM cytrynianu sodu, pH 7,2 i inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, Sonicate 2x przez 2 s każdy (moc wyjściowa 2 waty).
2. Sortowanie komórek
- Korzystając z sortera komórek, posortuj komórki według zawartości DNA na fazy G1, S, "wczesne G2" i "późne G2", zbierając co najmniej 1,6 miliona haploidalnych komórek z każdej fazy cyklu komórkowego, jak w Rysunek 1 (patrz punkt dyskusji (3)).
- Przenieść komórki do probówek do mikrofuge i odwirowywać komórki przez 20 minut przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C w mikrofugach i odsysać supernatant za pomocą próżni (osad może być przechowywany w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony; patrz punkt dyskusji (4)).
3. Ekstrakcja DNA i przygotowanie bibliotek sekwencjonowania
UWAGA: Poniższe kroki są oparte na "protokole I" w zestawie do ekstrakcji genomowego DNA drożdży (patrz Tabela materiałów).
- Dodać 120 μl "Digestion Buffer", opatentowanego buforu, który umożliwia enzymowi litycznemu drożdży trawienie ściany komórkowej, oraz 5 μl enzymu litycznego drożdży, zawiesić ponownie przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 - 60 minut.
- Dodaj 120 μl "Lysis Buffer", opatentowanego buforu zawierającego detergent i wiruj na twardo przez 10 - 20 s.
- Dodać 250 μl chloroformu - dokładnie mieszać przez 1 min.
- Wirować z maksymalną prędkością w mikrofugach przez 2 minuty.
- Załadować supernatant na kolumnę wiążącą DNA i odwirować z maksymalną prędkością w mikrofugach przez 1 minutę.
- Dodaj 300 μl "DNA Washing Buffer", zastrzeżonego buforu zawierającego etanol, i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością w mikrofudze. Odrzuć przepływ, dodaj 300 μl buforu do płukania DNA i powtórz proces mycia.
- Przenieś kolumnę wirową do świeżej probówki do mikrofuge, dodaj 60 μl wody (nie TE) - odczekaj 1 - 3 minuty, a następnie odwiruj przez 10 sekund w celu wymycia DNA.
- Zmierz stężenie, dodając 5 μl DNA do 195 μl odczynnika dsDNA o wysokiej czułości, który został rozcieńczony w stosunku 1:200 w buforze dsDNA o wysokiej czułości, a następnie zmierz fluorescencję we fluorometrze, używając 10 μl dostarczonych wzorców do kalibracji; spodziewaj się od 10 do 50 ng całkowitej wydajności DNA.
- Sonicate (Peak Incident Power 450, Duty Factor 30%, Cycles per Burst 200, Treatment Time 60 s, Water Level 6) w celu rozbicia DNA na fragmenty o długości 250 - 350 pz.
- Przygotuj bibliotekę, korzystając z zestawu do przygotowywania próbek DNA i zsekwencjonuj ją (co najmniej 10 milionów odczytów pojedynczych końcówek 50 pz) na instrumencie do sekwencjonowania DNA w trybie szybkim (patrz nota do dyskusji (5)).
4. Analiza danych sekwencjonowania i generowanie profili replikacji
- Dopasuj sekwencje do genomu Saccharomyces cerevisiae sacCer3 za pomocą Gsnap12 (patrz notatka do dyskusji (6)).
- Określ głębokość odczytu dla każdej pary zasad za pomocą oprogramowania "genomeCoverageBed" firmy Bedtools13.
- Usuń artefakty w głębokości odczytu, jeśli występują (patrz notatka do dyskusji (7)).
- Płynne odczytywanie głębokości według chromosomów przy użyciu median w oknie przesuwnym 20 kb za pomocą funkcji "runMean" w pakiecie R "caTools" (patrz notatka do dyskusji (8)).
- Wykreśl głębokości odczytu w fazie S, wczesnym G2 i późnym G2 jako procent całkowicie zreplikowanych głębokości odczytu (patrz nota do dyskusji (9)).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana powyżej procedura została przez nas wykorzystana do zidentyfikowania późno replikujących się miejsc u drożdży pączkujących. Testowanie tego podejścia z wykorzystaniem znanej późno replikującej się sekwencji na sztucznym chromosomie potwierdziło dokładność i niezawodność tej techniki. Nasze wyniki wykazały również biologiczne znaczenie terminowego zakończenia replikacji, wykazując, że późno replikujący się region na chromosomie 7, który zidentyfikowaliśmy jako późno replikujący na ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż ta technika jest solidna i stosunkowo prosta, szczególną uwagę należy zwrócić na następujące kwestie:
(1) Zalecamy, aby kultury rosły przez co najmniej 12 godzin, zanim osiągną fazę logarytmiczną, ponieważ różnice ujawniają się w rozkładach cykli komórkowych, jeśli kultury są zbierane po osiągnięciu pożądanej gęstości zaledwie 4 godziny po inokulacji. Zakładamy, że rozkład cyklu komórkowego, który osiągnął względnie stabilną równowagę, lepiej reprezentuje "rzeczywisty" rozkład fazy log...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant NIH GM117446 dla A.B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw YeaStar Genomic DNA | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µ M SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | zawiesić w 50 mM cytrynian sodu, pH |
| 7,2 50 mM roztwór cytrynianu sodu, pH 7,2 | |||
| RNazy (0,25 mg / ml) | Sigma | R6513 | 0,25 mg / ml RNaza A zawieszona w 50 mM cytrynianu sodu, pH 7,2, gotować roztwór RNazy przez 10 minut tylko przed pierwszym użyciem, a następnie przechowywać w temperaturze -20° |
| roztwór proteinazy K (20 mg / ml) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | zawiesić w 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% glicerolu, przechowywać w temperaturze -20° C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Kolumny Zymo-spin III | Zymo Research | C1005 | |
| Zestaw testowy Qubit dsDNA HS | ThermoFisher | Q32851 | |
| Fluorometr Qubit 3.0 | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Skoncentrowany ultrasonograf | Covaris | 500219 | |
| Zestaw do przygotowania próbek Illumina TruSeq DNA LT | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY– 401– Oprogramowanie open source 2501 | |
| gsnap do wyrównywania | / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
Bibliografia
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
