G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Summary

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

Abstract

Opracowano liczne techniki śledzenia postępu replikacji DNA w fazie S cyklu komórkowego. Większość z tych technik została ukierunkowana na wyjaśnienie miejsca i czasu rozpoczęcia duplikacji genomu, a nie jej zakończenia. Jednak bardzo ważne jest, abyśmy zrozumieli regiony genomu, które jako ostatnie zakończyły replikację, ponieważ regiony te cierpią z powodu podwyższonego poziomu pękania chromosomów i mutacji, a także są związane zarówno z chorobami, jak i starzeniem się. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób rozszerzyliśmy technikę, która została wykorzystana do monitorowania inicjacji replikacji, aby zamiast tego zidentyfikować te regiony genomu, które jako ostatnie zakończyły replikację. Podejście to opiera się na połączeniu cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu tej techniki do drożdży, podejście to można zastosować do dowolnych komórek, które można posortować w cytometrze przepływowym zgodnie z zawartością DNA.

Introduction

Replikacja genomu eukariotycznego jest inicjowana w wielu odrębnych miejscach, zwanych początkami replikacji, z których widełki replikacyjne rozchodzą się w obu kierunkach (recenzowane w Fragkos et al., 2015¹). Początki różnią się zarówno pod względem czasu, jak i skuteczności wypalania, a także opracowano kilka technik monitorowania aktywności początkowej replikacji i wyjaśnienia przyczyn tej zmienności. Aktywność poszczególnych źródeł można wywnioskować na podstawie poziomów jednoniciowego DNA², który tworzy się wokół aktywnego pochodzenia, lub za pomocą elektroforezy żelowej 2D do monitorowania określonych pr....

Protocol

1. Przygotowanie komórek do sortowania metodą cytometrii przepływowej

1. Zaszczepić 15 ml probówek zawierających po 8 ml bulionu YEPD w taki sposób, aby kultury osiągnęły gęstość 5 x 10 6 do 1,5 x 10⁷ komórek na ml po nocnym wzroście (patrz uwaga do dyskusji 1).
2. Odwirować komórki drożdży (1 400 x g, w temperaturze pokojowej lub 4 °C) w probówce wirówkowej z zakrętką o pojemności 15 ml na 5 minut, ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml 70% etanolu i przenieść do probówki do mikrofugi o pojemności 1,6 ml, pozostawiając ją na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub co najmniej 3 godziny na lodzie (może być przechowywana w nieskończonoś....

Results

Użyliśmy opisanej powyżej procedury do identyfikacji miejsc późnej replikacji w pączkujących drożdżach. Przetestowanie tego podejścia przy użyciu znanego regionu późnej replikacji na sztucznym chromosomie dowiodło, że technika ta jest dokładna i wiarygodna. Nasze wyniki wykazały również biologiczne znaczenie terminowego zakończenia replikacji, pokazując, że późny region replikujący na chromosomie 7, który zidentyfikowaliśmy jako późną replikację na podstawie naszych wyników G2-seq, był tr.......

Discussion

Chociaż ta technika jest solidna i stosunkowo prosta, szczególną uwagę należy zwrócić na następujące kwestie:

(1) Zalecamy, aby kultury rosły przez co najmniej 12 godzin, zanim osiągną fazę logarytmiczną, ponieważ różnice ujawniają się w rozkładach cykli komórkowych, jeśli kultury są zbierane po osiągnięciu pożądanej gęstości zaledwie 4 godziny po inokulacji. Zakładamy, że rozkład cyklu komórkowego, który osiągnął względnie stabilną równowagę, lepiej reprezentuje "rzeczywisty" rozkład fazy log.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw YeaStar Genomic DNA	Genesee Scientific	11-323
1 µ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	zawiesić w 50 mM cytrynian sodu, pH
7,2 50 mM roztwór cytrynianu sodu, pH 7,2
RNazy (0,25 mg / ml)	Sigma	R6513	0,25 mg / ml RNaza A zawieszona w 50 mM cytrynianu sodu, pH 7,2, gotować roztwór RNazy przez 10 minut tylko przed pierwszym użyciem, a następnie przechowywać w temperaturze -20°
roztwór proteinazy K (20 mg / ml)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	zawiesić w 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50% glicerolu, przechowywać w temperaturze -20° C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Kolumny Zymo-spin III	Zymo Research	C1005
Zestaw testowy Qubit dsDNA HS	ThermoFisher	Q32851
Fluorometr Qubit 3.0	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Skoncentrowany ultrasonograf	Covaris	500219
Zestaw do przygotowania próbek Illumina TruSeq DNA LT	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY– 401– Oprogramowanie open source 2501
gsnap do wyrównywania	/ Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap