Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Summary

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Abstract

Systemy sensoryczne pozwalają zwierzętom wykrywać, przetwarzać i reagować na swoje otoczenie. Obfitość pożywienia jest wskazówką środowiskową, która ma głęboki wpływ na fizjologię i zachowanie zwierząt. Niedawno wykazaliśmy, że modulacja długowieczności nicieni Caenorhabditis elegans przez obfitość pożywienia jest bardziej złożona niż wcześniej sądzono. Reakcja długości życia na zmiany poziomu pożywienia jest determinowana przez określone geny, które działają poprzez kontrolowanie przetwarzania informacji w obwodzie neuronalnym. Nasze ramy łączą w sobie analizę genetyczną, wysokoprzepustowe obrazowanie ilościowe i teorię informacji. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te można wykorzystać do scharakteryzowania dowolnego genu, który ma fizjologiczne znaczenie dla szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych. W szczególności ten przepływ pracy ma na celu ujawnienie, w jaki sposób interesujący nas gen reguluje długość życia w warunkach szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych; następnie ustalenie, w jaki sposób ekspresja genu zmienia się w zależności od poziomu pokarmu; i wreszcie, aby zapewnić bezstronną kwantyfikację ilości informacji przekazywanych przez ekspresję genów na temat obfitości pożywienia w środowisku. Kiedy kilka genów jest badanych jednocześnie w kontekście obwodu neuronalnego, ten przepływ pracy może odkryć strategię kodowania stosowaną przez obwód.

Introduction

Wszystkie organizmy muszą być w stanie wyczuwać i reagować na zmiany w środowisku, aby zapewnić sobie przetrwanie. U zwierząt układ nerwowy jest głównym detektorem i przetwornikiem informacji o środowisku i koordynuje fizjologiczną reakcję na wszelkie zmiany, które mogą mieć wpływ na przetrwanie organizmu¹. Obfitość pożywienia to wskazówka środowiskowa, która jest dobrze zbadana w wielu kontekstach, która nie tylko reguluje zachowania związane z jedzeniem, takie jak żerowanie², ale także wpływa na długowieczność zwierzęcia. Modulacja długości życia przez zmiany w obfitości pożywienia jest zjawiskiem znanym jako ograniczenie dietetyczne (DR) i ma szerokie ewolucyjne zachowanie³.

Nicień Caenorhabditis elegans to potężny system modelowy do rozwiązywania fundamentalnych problemów biologicznych. Opracowano wiele technik, które pozwalają na manipulowanie genomem robaka, takich jak RNAi i techniki edycji genów in vivo. Niewielki rozmiar fizyczny robaka i jego przezroczystość optyczna umożliwiają również obrazowanie in vivo zarówno transkrypcyjnych, jak i translacyjnych reporterów fluorescencyjnych oraz użyteczność technologii o wysokiej przepustowości, takich jak mikrofluidyka⁴. Razem narzędzia te można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób obwody neuronalne kierują zachowaniem zwierząt.

C. elegans jest bakteriożercą i opublikowano kilka metod, które pozwalają na precyzyjną kontrolę obfitości pożywienia poprzez manipulowanie stężeniem bakterii^5,6,7,8. W społeczności badawczej C. elegans DR był badany w dwóch różnych kontekstach. Pierwszy z nich można nazwać "klasycznym DR", ponieważ odzwierciedla zmiany obserwowane w odpowiedzi na zmniejszający się poziom pożywienia w innych organizmach. W tym kontekście, zmniejszająca się obfitość żywności z poziomu ad libitum skutkuje wydłużeniem długości życia, aż do osiągnięcia optimum, po tym momencie długowieczność maleje wraz z dalszym zmniejszaniem ilości żywności^6,7,9. Drugim kontekstem, w którym DR badano u C. elegans, jest deprywacja żywieniowa, w której długowieczność robaków zwiększa się poprzez całkowite usunięcie wszelkich bakteryjnych źródeł pożywienia^10,11. W Entchev et al. (2015)¹² wykazaliśmy, że złożoność DR wynikająca z tych dwóch różnych paradygmatów może być badana jednocześnie w kontekście, który nazywamy "DR o szerokim zakresie". Korzystając z opisanego poniżej protokołu, zidentyfikowaliśmy nową klasę genów zaangażowanych w DR, które dwukierunkowo modulują reakcję długości życia na obfitość pożywienia i są zaangażowane w obwody neuronalne, które wykrywają food¹² (Rysunek 1).

Reakcja zwierzęcia na zmiany w środowisku integruje sekwencję procesów biologicznych, które łączą system sensoryczny ze złożonymi interakcjami regulacyjnymi, przekazując informacje środowiskowe do fizjologii. Chociaż mechanistyczne szczegóły takiego "przepływu informacji" są często nieznane, narzędzia genetyczne mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w to, jak te złożone obliczenia są zorganizowane między różnymi komponentami biologicznymi. W naszej ostatniej pracy wykazaliśmy, że daf-7 i tph-1 są zaangażowane w przekazywanie informacji środowiskowych o obfitości żywności przez obwód neuronowy wykrywający żywność, który moduluje długość życia u C. elegans^12,13. Stosując matematyczne ramy teorii informacji¹⁴, byliśmy w stanie określić ilościowo ilość informacji środowiskowych, w kategoriach bitów, które są reprezentowane przez zmiany ekspresji genów w daf-7 i tph-1 w określonych neuronach na różnych poziomach pożywienia. Na tej podstawie byliśmy w stanie odkryć strategię kodowania stosowaną przez ten obwód neuronowy i sposób, w jaki jest on genetycznie kontrolowany (Rysunek 2).

W poniższym protokole opisujemy kroki wymagane do zrozumienia, jakie są efekty działania interesujących genów wyrażanych w określonych neuronach i jak uczestniczą one w przepływie informacji o jedzeniu od środowiska do długości życia. Ogólnie rzecz biorąc, nasza struktura jest podzielona na dwa protokoły eksperymentalne i obliczeniowy przepływ pracy. Jeśli chodzi o aspekty eksperymentalne, kluczowe znaczenie ma posiadanie mutantów genów będących przedmiotem zainteresowania, które można badać w ramach szerokiego zakresu DR. Wierne reportery transkrypcyjne są również niezbędne do ilościowego określenia poziomu ekspresji genów na różnych poziomach żywności. Aby móc przeprowadzić analizę obliczeniową omówioną w naszej metodzie, zestaw danych musi mieć wystarczający rozmiar, aby zapewnić miarodajne oszacowania rozkładów wyrażeń. Mimo że udostępniamy szablonowe kody źródłowe do analiz, użytkownik musi być zaznajomiony z językiem teorii informacji, który jest szeroko stosowany w naszych ramach obliczeniowych. Kody źródłowe są napisane w językach R i C++. Dlatego wymagany jest również pewien poziom biegłości w programowaniu, aby zastosować je w sensowny sposób.

Protocol

1. Przygotowanie kultur bakteryjnych i płytek do ogólnej hodowli robaków

1. Przygotuj 100 ml bulionu lizogenicznego (LB) w szklanej butelce o pojemności 250 ml i sterylizuj w autoklawie.
2. Zaszczepić butelkę pojedynczą kolonią szczepu Escherichia coli OP50 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie przechowywać kulturę w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
3. Przygotować 5 l sterylnej pożywki do hodowli nicieni (NGM) agar¹⁵ i podwielokrotność 12 ml objętości na sterylnych plastikowych szalkach Petriego o średnicy 6 cm.
4. Pozostaw agar do zastygnięcia przez noc, a następnie przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie potrzebny.
5. Wysiewaj płytki NGM co najmniej 3 dni przed użyciem z 225 μl schłodzonej kultury OP50. Przechowywać płytki w temperaturze 20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

2. Przygotowanie kultur bakteryjnych i rozcieńczeń do eksperymentów

1. Przygotować dwie partie po 500 ml pożywki LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 l i sterylizować w autoklawie.
2. Zaszczepić każdą kolbę pojedynczą kolonią OP50 i rosnąć w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez około 14 godzin.
3. Uzupełnij kultury antybiotykiem streptomycyną do końcowego stężenia 50 μg/ml. Kontynuować wytrząsanie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie umieścić kolby na lodzie na 15 minut.
4. Przenieś 450 ml każdej kultury do oddzielnych sterylnych butelek wirówek (najlepiej butelek o pojemności 500 ml, aby uniknąć dzielenia kultur). Zachowaj resztki kultury na lodzie, ponieważ zostaną one wykorzystane do określenia stężenia bakterii.
5. Odwirować butelki w temperaturze 4500 x g w wirówce z chłodzeniem nastawionej na 4 °C przez 25 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać butelki na lodzie.
6. Rozcieńczyć 100 μl pozostałej kultury z każdej kolby w 900 μl sterylnego LB. Użyć 1 ml sterylnego LB do wyzerowania spektrofotometru, a następnie oznaczyć OD₆₀₀ w 10-krotnym rozcieńczeniu każdej kultury. Jeśli na przykład OD₆₀₀ 10-krotnego rozcieńczenia kultury nocnej wynosi 0,28, to kultura miała rzeczywisty OD₆₀₀ równy 2,8.
7. Użyj roboczego roztworu podstawowego bakterii o wymiarach 1,12 x 10¹⁰ komórek OP50 / ml, co odpowiada OD₆₀₀ 56. Dlatego, korzystając z przykładu OD₆₀₀ o wartości 2,8 od góry, ponownie zawieś osad z kultury o pojemności 450 ml w 20^jednej częściowej pierwotnej objętości, która w tym przypadku wynosi 22,50 ml. Zawiesić bakterie sterylnym roztworem podstawowym S uzupełnionym streptomycyną do 50 μg/ml (SB + paciorkowiec).
8. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości sterylnego paciorkowca SB +
.
9. Wszystkie kolejne stężenia stosowane w doświadczeniach należy ustalić z seryjnych rozcieńczeń materiału roboczego w paciorkowcu SB +, stosując współczynniki rozcieńczenia wymienione w tabeli 1.

3. Ustawianie eksperymentów z długością życia

UWAGA: Testy żywotności są wykonywane na 6 cm traktowanej kulturze tkankowej wypełnionej 12 ml agaru NGM uzupełnionego streptomycyną i karbenicyliną (NSC), oba w końcowym stężeniu 50 μg/ml. Te płytki do hodowli tkankowych dobrze nadają się do oznaczania żywotności przy braku lub bardzo niskich stężeniach bakterii, ponieważ robaki są znacznie mniej podatne na przywieranie do ścianki płytki i wysychanie. Stosowanie dwóch różnych antybiotyków zapobiega rozwojowi lekooporności szczepu OP50, co ma kluczowe znaczenie w kontrolowaniu stężenia bakterii na płytce. Ponadto, inaktywując bakterie antybiotykami, minimalizujemy wpływ infekcji patogennej na długość życia robaków¹⁶. To pozwala nam wziąć pod uwagę tylko składniki koncentracji bakterii związane z żywnością w tych eksperymentach. Wiele badań nad starzeniem się C. elegans uzupełnia płytki NGM o substancję chemiczną fluoro-2′-deoksyurydynę (FUdR), aby uczynić dorosłe osobniki bezpłodnymi. Jednak korzystanie z FUdR może być problematyczne, ponieważ jego użycie może powodować kilka problemów mylących z testami długowieczności^{17,18,19,20,21}. Entchev i in. (2015)¹² obeszli ten problem, wystawiając larwy L4 na działanie RNAi jaja-5^22,23, który hamuje przejście z oocytu do zarodka poprzez blokowanie tworzenia się skorupki jajowej zapłodnionych oocytów C. elegans, co prowadzi do ich śmierci.

1. Hodowla szczepów C. elegans, które zostaną oznaczone na płytkach NGM z nasionami w temperaturze 20 °C. Pozwól, aby płytki wygłodowały, aby zapewnić, że wszystkie zwierzęta są hodowane w jednolity sposób i potencjalnie uwzględnić wszelkie międzypokoleniowe skutki warunków rozwojowych.
2. Przenieś wygłodzone larwy L1 na nowe płytki NGM z nasionami, wycinając mały kawałek agaru (5 mm x 5 mm) z wygłodzonej płytki za pomocą sterylnego skalpela i umieszczając go na nowej płytce, proces określany jako "chunking" przez społeczność badawczą C. elegans¹⁵. Hoduj robaki, aż osiągną etap L4. Pięć larw L4 z każdego szczepu przenosi się następnie na indywidualne płytki NGM z nasionami i utrzymuje w temperaturze 20 °C. Zwierzęta te reprezentują pokolenie P0.
3. Użyj potomstwa L4 generacji P0, aby skonfigurować generację F1. Umieść pojedynczo larwy F1 L4 dzikiego szczepu N2 na 30 talerzach NGM z nasionami.
   UWAGA: W przypadku zmutowanych szczepów wymagana liczba płytek zależy od ich tempa wzrostu. Na przykład zwierzęta daf-7(ok3125) przechodzą przejściowe zatrzymanie dauera w temperaturze 20 °C. W związku z tym szczep ten wytwarza mniej larw L4 niż talerz robaków typu dzikiego N2.
4. Aby zrekompensować tę różnicę, należy ustawić płyty daf-7 (ok3125) dzień wcześniej niż płyty N2 i przy większej liczbie, dobry stosunek pracy wynosi 3:1.
5. Przenieś zsynchronizowane potomstwo w stadium L4 rodziców F1 na płytki NGM uzupełnione 1 mM IPTG i 50 μg/ml karbenicyliny (płytki RNAi), które wysiano 225 μl bakterii HT115 eksprymujących dsRNA ukierunkowanych na gen jaja-5 i utrzymywano w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. W jednym eksperymencie potrzeba co najmniej 360 robaków na szczep, utrzymywanych w zagęszczeniu 15 zwierząt na płytkę.
6. Po poddaniu działaniu RNAi jaja-5 należy przenieść robaki na płytki NSC wysiane 225 μl OP50 potraktowanej streptomycyną w stężeniu 2 x 10⁹ komórek/ml (Tabela 1) przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 20 °C. Aby uniknąć fizycznego uszkodzenia robaków podczas tego i wszystkich kolejnych transferów, delikatnie zbierz zwierzęta spod robaka za pomocą bardzo cienkiego, delikatnie zakrzywionego kilofa. Spławiaj zwierzęta z kilofa, zanurzając go w 10 μl kropli SB + paciorkowca umieszczonej na powierzchni nowej płytki.
7. Następnego dnia rozłóż robaki na talerze NSC reprezentujące każdy z poziomów żywności wymienionych w tabeli 1, a także zestaw płytek NSC, które nie zawierają bakterii. Wysiać wszystkie płytki NSC 225 μl odpowiedniego stężenia bakterii i wysiać wolne od bakterii płytki NSC 225 μl SB + paciorkowcem. Utrzymuj zagęszczenie robaków w zagęszczeniu 15 zwierząt na talerz, co daje co najmniej cztery płytki na stan żywności na szczep. Przesuń płytki do żądanej temperatury eksperymentalnej.
8. Przenieść robaki na świeże płytki NSC obsiane odpowiednim stężeniem pokarmu zgodnie z harmonogramem przedstawionym w tabeli 2.
9. Oceń zwierzęta za ruch, delikatnie szturchając je drucianym kilofem. Brak odpowiedzi jest traktowany jako śmierć. Zdobywaj zwierzęta za śmierć w każdym punkcie transferowym, a następnie codziennie po ostatnim punkcie transferowym.

4. Ustawianie eksperymentów z obrazowaniem

UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji są wystarczające do wygenerowania wystarczającej ilości robaków na szczep do zobrazowania jednego eksperymentalnego stanu żywności w danej temperaturze. Protokół ten można skalować w celu dopasowania do liczby warunków, które będą obrazowane w danym dniu. Jednakże w projekcie doświadczenia należy zachować ostrożność w celu zapewnienia, że ramy czasowe są rozsądne i że różnice wieku zwierząt z różnych szczepów nie są większe niż 12 godzin w dniu obrazowania. Zdecydowanie zaleca się, aby obrazowane reportery transkrypcyjne były transgeniczne z pojedynczą kopią, ponieważ będzie to bardziej przypominać natywną regulację genu. Protokół opisany poniżej i podsumowany w Tabeli 3 zapewnia również uproszczoną metodę uzyskiwania dużych synchronicznych populacji szczepów dopasowanych do wieku, które można wykorzystać w innych eksperymentalnych przepływach pracy.

1. Hodowla zwierząt w doświadczeniach obrazowych na 10-centymetrowych płytkach do hodowli tkankowych poddanych działaniu metody hodowli w celu umożliwienia większej gęstości robaków (∼100 zwierząt na płytkę) niż w testach długości życia.
2. Napełnij 10-centymetrowe płytki 30 ml płytek agarowych NGM i wysiewaj nasiona pięcioma podwielokrotnościami 225 μl schłodzonej kultury OP50 w układzie krzyżowym.

5. Początkowa hodowla szczepów reporterowych

1. Hodowla szczepów C. elegans, które zostaną oznaczone na płytkach NGM z nasionami w temperaturze 20 °C. Pozwól, aby płytki wygłodowały, aby zapewnić, że wszystkie zwierzęta są hodowane w jednolity sposób i potencjalnie uwzględnić wszelkie międzypokoleniowe skutki warunków rozwojowych.
2. Pokrój wygłodzone larwy L1 na płytki z nasionami NGM i rosnąć, aż osiągną stadium L4. Przenieść trzy larwy L4 z każdego szczepu na dwie płytki NGM z nasionami w temperaturze 20 °C. Zwierzęta te reprezentują pokolenie P0.
3. Użyj potomstwa L4 generacji P0, aby skonfigurować generację F1. Umieść larwy F1 L4 dzikiego szczepu reporterowego na 4 płytkach NGM z nasionami. W przypadku zmutowanych szczepów wymagana liczba płytek zależy od ich tempa wzrostu. Korzystając z poprzedniego przykładu daf-7 (ok3125), szczepy reporterowe w tym kontekście wymagają trzykrotnie większych tablic rejestracyjnych i muszą być ustawione dwa dni przed szczepami reporterowymi typu dzikiego, aby uwzględnić różnice w tempie wzrostu.

6. Zbieranie jaj i synchronizacja szczepów reporterowych

UWAGA: Niektóre geny będące przedmiotem zainteresowania społeczności badawczej zajmującej się starzeniem się C. elegans powodują wady wzrostu i składania jaj po mutacji, co utrudnia generowanie dużych synchronicznych populacji zwierząt o różnych genotypach. Na przykład mutacja daf-7 (ok3125) powoduje poważną wadę składania jaj w porównaniu z dzikim szczepem N2. W związku z tym, uzyskanie wystarczającej liczby synchronicznych larw L4 różnych szczepów do eksperymentów obrazowania ilościowego wymaga bardziej solidnej metodologii niż ręczne pobieranie robaków. Z tego powodu transkrypcyjne szczepy reporterowe poddano działaniu roztworu podchlorynu sodu (NaClO)/wodorotlenku sodu (NaOH) u ciężarnych dorosłych osobników, aby rozbić zwierzęta i uwolnić ich jaja, proces powszechnie określany jako "bielenie" przez społeczność badawczą C. elegans¹⁵.

1. Weź pod uwagę różnice w tempie wzrostu między szczepami i oblicz, kiedy płytki każdej odmiany powinny zostać zebrane i wybielone. Przykład, kiedy szczepy reporterowe typu dzikiego i daf-7(ok3125) są bielone, znajduje się w tabeli 3.
2. Kolejno zmyj robaki danego szczepu z płytek, w odpowiednim dniu, używając 15 ml SB i zbierz do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Pozwól zwierzętom naturalnie się uspokoić, a następnie dostosuj objętość płynu do 7 ml.
3. Dodać 2 ml 5% NaClO i 1 ml 5 M NaOH do probówki zawierającej ciężarne dorosłe osobniki. Delikatnie kołysz mieszaniną w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 3 minuty. NaClO zabija bakterie i robaki, podczas gdy NaOH powoduje, że robaki rozpadają się, uwalniając wszelkie zapłodnione jaja, które zawierają, do płynu. Chitynowa skorupka jaja wokół zarodków chroni je przed skutkami zabiegu, o ile czas ekspozycji pozostaje stosunkowo krótki. Po 3-minutowej inkubacji należy wirować rurkę przez ~30 s, aby ułatwić dalszy rozpad tusz robaków.
4. Po 3-minutowej inkubacji odwirować mieszaninę o masie 1,000 x g przez 1 minutę, aby otoczkować jaja. Odessać większość supernatantu za pomocą sterylnej szklanej pipety podłączonej do kolby próżniowej, pozostawiając ~0,5 ml w każdej probówce, aby nie naruszyć jaj.
5. Zawiesić osad w 9,5 ml SB, a następnie powtórzyć etap wirowania i etapy ponownego zawieszania dodatkowo dwa razy, tak aby jaja zostały umyte SB w sumie trzy razy.
6. Po ostatnim umyciu jaja należy ogranulować przez odwirowanie, a następnie wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 0,5 ml supernatantu. Ponownie zawiesić jaja w pozostałych 0,5 ml SB, a następnie podzielić 100 μl na trzy 10-centymetrowe płytki NGM z nasionami. Rozprowadź 100 μl równomiernie na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych na każdej płytce. W przypadku szczepów dzikich jaja nie powinny być składane w zagęszczeniu większym niż 200 na płytkę.
   1. Przechowywać płytki w temperaturze 20 °C przez 48 godzin i uzyskać wysoce jednorodną populację larw L4. W przypadku odmian o fenotypach opóźnionego wzrostu zaleca się złożenie jak największej liczby jaj i wydłużenie czasu inkubacji. Na przykład, szczepy reporterowe zawierające daf-7 (ok3125) należy przechowywać w temperaturze 20 °C przez ~ 64 godziny, aby umożliwić jajom wyklucie się i osiągnięcie stadium L4.

7. Leczenie szczepów reporterowych za pomocą jaja-5 RNAi

1. Kolejno zmyj robaki z trzech płytek za pomocą 15 ml SB i zbierz płyn do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Pozwól larwom L4 naturalnie się osadzać, a następnie odessaj wszystko oprócz ~0,5 ml płynu. W przypadku szczepów reporterowych typu dzikiego etap ten usuwa wszelkie larwy młodsze niż L4. W zmutowanych tłach ten krok pomaga w usunięciu wszelkich zatrzymanych larw, takich jak dauery w przypadku daf-7 (ok3125).
2. Ponownie zawiesić robaki za pomocą 9 ml SB. Ponownie monitoruj szybkość sedymentacji larw L4, a następnie odessaj wszystko oprócz ~ 0,5 ml supernatantu, gdy większość larw L4 zostanie ogarnięta. Powtórz ten proces jeszcze raz. Następnie odessać całość oprócz ~0,5 ml płynu, gdy większość larw L4 już się uspokoi.
3. Dodać 10 μl sterylnego S baseal uzupełnionego 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) do płynu zawierającego larwy L4. Działa to jak środek powierzchniowo czynny i zapobiega przywieraniu larw do wewnętrznej powierzchni plastikowych końcówek pipet.
   1. Delikatnie ponownie zawieś larwy za pomocą końcówki pipety P200 o niskiej retencji, a następnie podaj 150 μl na trzy 10-centymetrowe płytki RNAi, które są wysiewane 5 x 225 μl bakterii RNAi jaja-5. Upewnij się, że robaki są równomiernie rozmieszczone na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych.
4. Gdy płyn wchłonie się do agaru, usuń z płytek wszelkie larwy inne niż L4, które nie zostały wyeliminowane przez procedurę mycia, poprzez ręczne ich zrywanie. Następnie przechowywać płytki w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.

8. Inicjacja DR o szerokim zasięgu

UWAGA: Po 24-godzinnym leczeniu jajkiem-5 RNAi, larwy L4, które pierwotnie zostały złożone na płytkach, staną się dorosłymi osobnikami w wieku 1 dnia.

1. Na tym etapie należy usunąć wszystkie młode larwy, które uniknęły wcześniejszego ręcznego usunięcia, pozostawiając na talerzach tylko jednodniowe dorosłe osobniki.
2. Dla każdego szczepu umyj 1-dniowe dorosłe osoby z trzech płytek 15 ml sterylnego paciorkowca SB + do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól robakom naturalnie się osadzić, a następnie odessaj wszystko oprócz 0,5 ml supernatantu. Ponownie zawiesić robaki za pomocą 9,5 ml paciorkowca SB + i powtórzyć etapy sedymentacji i mycia.
3. Po ostatnim płukaniu pozwól robakom się osadzić, a następnie odessaj wszystko oprócz 0,5 ml supernatantu. Dodać 10 μL SB + Plu i delikatnie zawiesić larwy za pomocą końcówki pipety P200, a następnie podwielokrotność 100 μL na płytkę NSC wysianą 5 x 225 μL bakterii w stężeniu 2 x 10⁹ komórek/ml.
   1. Rozprowadź 100 μl równomiernie na wszystkich pięciu trawnikach bakteryjnych. Pod mikroskopem oszacuj liczbę zwierząt obecnych na talerzu: celem jest posiadanie od 100 do 150 robaków na talerzu.
   2. Określić objętość cieczy wymaganą do osiągnięcia gęstości ślimaków w tym zakresie, a następnie podzielić na dwie dodatkowe płytki. Dostosuj liczbę robaków na pierwszej płytce, aby również mieściła się w tym zakresie, a następnie przechowuj płytki w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
4. Następnego dnia zbierz 2-dniowe dorosłe osobniki i rozprowadź je na nowych płytkach NSC obsianych pożądanym eksperymentalnym stężeniem pokarmu (Tabela 1), ponownie wykorzystując metody opisane w krokach 2 i 3. Gdy ciecz zostanie wchłonięta przez agar, przesunąć płytki do żądanej temperatury doświadczalnej na 24 godziny.
5. Następnego dnia zbierz 3-dniowe dorosłe osobniki i rozprowadź je na świeżych płytkach NSC obsianych tym samym eksperymentalnym stężeniem pokarmu, ponownie wykorzystując metody opisane w krokach 8.3 i 8.4. Gdy ciecz zostanie wchłonięta przez agar, należy przywrócić płytki do temperatury doświadczalnej na 48 godzin.
6. Zebrać 5-dniowe dorosłe osobniki i rozprowadzić na świeżych płytkach NSC obsianych tym samym eksperymentalnym stężeniem pokarmu, ponownie wykorzystując metody opisane w krokach 8.3 i 8.4. Gdy ciecz zostanie wchłonięta przez agar, należy przywrócić płytki do temperatury doświadczalnej na 24 godziny.

9. Obrazowanie mikroprzepływowe szczepów reporterowych

1. W 6 dniu dorosłości zobrazuj zwierzęta za pomocą niestandardowej platformy mikroprzepływowej^24,25. Fizycznie oderwij zwierzęta z trzech płytek i zawieś je w probówce kriogenicznej o pojemności 5 ml zawierającej 4,5 ml paciorkowca SB +.
   1. Gdy robaki się osadzą, odessać wszystko oprócz ~ 0,5 ml supernatantu i ponownie zawiesić zwierzęta w 4 ml SB + paciorkowca. To mycie usuwa nadmiar bakterii, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać obrazowanie. Robaki są wprowadzane do niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego za pomocą sterowanego ciśnieniem flow^24,25. Wewnątrz urządzenia poszczególne robaki są kierowane i zatrzymywane w kanale obrazowania bramkowanym przez zawory na chipie sterowanym ciśnieniem²⁶ pod kontrolą niestandardowego oprogramowania.
2. Gdy robak zostanie uwięziony głową w dół w kanale obrazowania, zbierz fluorescencyjny stos z 50 sekcjami w krokach co 2 μm, używając standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem olejowym 40X (1,3 NA) i kamerą. Zbieraj czerwone i zielone obrazy fluorescencyjne dla każdego z reporterów transkrypcyjnych jednocześnie za pomocą rozdzielacza emisji i przechowuj je do analizy. Akwizycja obrazu jest zautomatyzowana za pomocą niestandardowego oprogramowania.
3. Przetwarzaj obraz automatycznie przy użyciu niestandardowych skryptów MATLAB²⁷ (dostępny pod adresem https://github.com/meizhan/SVMelegans). Stosy Z są ładowane do MATLAB i analizowane w celu identyfikacji par neuronów i ich lokalizacji w płaszczyźnie obrazowania. Następnie obliczane są maksymalne projekcje, a algorytm progowania jest wykorzystywany do lokalizacji poszczególnych komórek fluorescencyjnych. Identyfikacja komórki jest następnie obliczana na podstawie względnych odległości i lokalizacji w głowie robaka.
4. Aby określić ilościowo fluorescencję reporterową, wyodrębnij trójwymiarową objętość wokół każdej lokalizacji komórkowej ze stosu z. Zintegruj intensywność ze stałą liczbą najjaśniejszych pikseli, które we wszystkich przypadkach w pełni obejmują całą komórkę.
5. Aby wyeliminować zakłócenia wynikające ze zmian w autofluorescencji jelit każdego zwierzęcia specyficznych dla warunków doświadczalnych lub szczepu, należy obliczyć intensywność tła dla par komórek znajdujących się najbliżej jelita (ADF i ASI) poprzez oszacowanie sposobu rozkładu intensywności w objętości wokół neuronu. Odejmij tę wartość intensywności tła od zintegrowanej fluorescencji, aby uzyskać końcowy wynik.

10. Gromadzenie danych

UWAGA: Intensywności fluorescencji wszystkich neuronów analizowanych przez oprogramowanie do przetwarzania obrazów są łączone w pliku danych z filtrowaną ekspresją (FED), który służy do szacowania profili dystrybucji ekspresji genów (szablony R i C++ są dostępne pod adresem https://github.com/giovannidiana/templates).

1. Ręcznie sprawdź każdy przetworzony obraz, aby potwierdzić poprawną identyfikację wszystkich komórek. Obrazy z błędną identyfikacją komórek muszą być zapisane w pliku wykluczeń. W Diana et al. (2017)¹³ plik wykluczenia składa się z tabeli binarnej z "0" dla poprawnej i "1" dla nieprawidłowej identyfikacji komórki. Liczba wierszy w tabeli jest równa liczbie robaków zobrazowanych z kolumną dla każdej zobrazowanej komórki (tj. ASI, ADF i NSM).
2. Wygeneruj plik FED:
   1. Uruchom skrypt bash "gen_data+time", aby wygenerować pliki specyficzne dla komórki, łączące wartości wyrażeń uzyskane z każdego obrazowanego robaka przefiltrowanego przy użyciu pliku wykluczającego. Dla każdego folderu wygenerowanego przez oprogramowanie do przetwarzania obrazu, skrypt bash odczytuje plik adnotacji _EXP.txt w celu wyodrębnienia warunków eksperymentalnych i pliku wykluczeń _X.csv w celu wybrania tylko poprawnie zidentyfikowanych neuronów. Wartości wyrażeń są odczytywane z plików _data_.csv.
   2. Połącz wszystkie pliki w "FED_split.dat" i posortuj je według kodu partii eksperymentu, etykiety robaka i tożsamości komórki.
   3. Uruchom "sort" (program C++, użycie: ./sort FED_split.dat FED_merged.dat), aby wybrać wpisy o niezerowej fluorescencji dla każdej komórki i połączyć je w pojedyncze wiersze w FED_merged.dat.

11. Szacowanie zakodowanych informacji

UWAGA: Poniższa procedura opisuje, jak określić ilościowo informacje o konkretnych warunkach środowiskowych zakodowanych przez zestaw ekspresji genów. W Diana i wsp. (2017)¹³, zbadano zakodowane informacje o obfitości żywności w środowisku, jednak sama metoda ma zastosowanie do dowolnej dyskretnej liczby stanów środowiska. Podstawowym składnikiem do ilościowego określenia zmiennych teorii informacji, takich jak entropia informacyjna lub redundancja, jest łączny rozkład prawdopodobieństwa odpowiedzi neuronalnych pod wpływem rozważanych określonych bodźców środowiskowych. Aby przeprowadzić takie oszacowanie, kluczowe jest posiadanie wystarczającej próbki odpowiedzi w różnych populacjach robaków. Rozkłady Gaussa można oszacować na podstawie stosunkowo małych próbek; Jednak ważne jest, aby mieć pojęcie o oczekiwanym kształcie rozkładu ekspresji, aby określić ilościowo odpowiednią wielkość próby w celu wiarygodnego oszacowania gęstości. Ze względu na nieuniknioną zmienność między różnymi badaniami, konieczne jest sprawdzenie, czy centralne wartości rozkładów uzyskane z różnych powtórzeń tego samego eksperymentu nie są systematycznie przesuwane lub czy którakolwiek z cech statystycznych rozkładu ekspresji nie jest znacząco zmieniona w różnych próbach. W przypadku, gdy zmienność między próbami jest zgodna ze zmiennością w ramach każdego badania, kluczowe znaczenie ma zrównoważenie liczby prób w stosunku do liczby robaków w próbach, aby uśrednić te czynniki środowiskowe/biologiczne, które wpływają na zmienność między próbami. Niedostateczne próbkowanie tych czynników może mocno zniekształcić analizę informacyjno-teoretyczną.

1. Ponieważ skrypt języka R "code3D.R" udostępnia szablon do generowania gęstości trójwymiarowych na podstawie pliku "FED_merged.dat", zmodyfikuj ten szablon zgodnie z określonym formatem nagłówka FED. Lista "HeaderNames" reprezentuje nazwy każdego pola w pliku FED, podczas gdy "RONames" jest listą odczytów. Skrypt używa pakietu języka R "ks'^28,29do oszacowania rozkładów wielowymiarowych w siatce hipersześciennej z przedziałami GS w każdym wymiarze, dzieląc zakres między wartościami minimalnymi i maksymalnymi w zestawie danych dla każdego odczytu. Gdy zmienna wewnętrzna "group" jest ustawiona na 0, wszystkie dane są używane do szacowania gęstości. Gdy etykieta "grupa" mieści się w przedziale od 1 do 5, zbiór danych jest dzielony na 5 rozłącznych zbiorów, a gęstości wyrażeń są szacowane na podstawie 80% danych wynikających z wykluczenia jednego z pięciu zbiorów. Ta funkcja jest później używana do szacowania niepewności.
   UWAGA: Użycie code3D.R: Rscript code3D.R gdzie GT reprezentuje genotyp, food to warunki środowiskowe, outfolder to istniejący folder, w którym będą przechowywane dystrybucje, label to prefiks nazwy pliku, a frac to ułamek użytego zestawu danych.
2. Dla każdego warunku środowiskowego wygeneruj rozkłady wielowymiarowe o różnych rozmiarach siatki GS (np. 20,30,40 pojemników). Aby zmniejszyć obciążenie obliczeniowe, preferowane są mniejsze wartości GS, gdy dokładniejsze rozdzielczości nie zmieniają znacząco szacowania informacji. Dystrybucja wyrażeń genowych jest zapisywana w folderze określonym podczas uruchamiania code3D.R jako jednokolumnowe pliki tekstowe ze strukturą nazw plików ___GS_group.dat.
   UWAGA: Poprzednie kroki zapewniają oszacowanie warunkowych rozkładów prawdopodobieństwa gdzie g oznacza wektor wszystkich odczytów, a f oznacza warunki środowiskowe. Jednak, aby obliczyć wzajemną informację między ekspresją genów a środowiskiem^30,31.
   
   Potrzebujemy rozkładu danych wejściowych które również określa (wejściowo) uśrednioną ekspresję genu . Gdy dystrybucja wejściowa nie jest bezpośrednio dostępna, znaczącą wielkością do scharakteryzowania cech kodowania jest pojemność kanału, którą można uzyskać poprzez maksymalizację wzajemnych informacji we wszystkich możliwych dystrybucjach wejściowych.
3. Korzystając z rozkładu ekspresji genów, zastosuj algorytm Arimoto-Blahut³² do oszacowania pojemności kanału systemu i rozkładu danych wejściowych środowiska, które maksymalizują informacje. Przykład implementacji algorytmu można znaleźć w programie "Ccap3D.cpp" języka C++ dla trójwymiarowego kodu ekspresji genów analizowanego w Diana et al. (2017)¹³. Przykład: jeśli rozkłady z genotypu GT123 są uzyskiwane z 80% danych (grupa 3) o rozmiarze siatki równym 30 i przechowywane w folderze "./pdf/" z prefiksem label="PDF". Polecenie do obliczenia informacji zakodowanych w tle GT123 to ./Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
   UWAGA: Na oszacowanie informacji zakodowanych przez system ma wpływ wiele źródeł niepewności, w tym wybór algorytmu szacowania gęstości i błąd systematyczny związany z wielkością próby. Kroki 11.1-11.2 należy powtórzyć przy użyciu różnych metod szacowania gęstości w celu oceny wielkości systematycznego odchylenia wprowadzonego przez każdy algorytm.
4. Aby oszacować niepewność wynikającą z wielkości próby, należy ponownie obliczyć informacje z kroków 11.1–11.2 z grupami od 1 do 5. Zmienność w tych pięciu niezależnych próbkach 80% danych będzie odzwierciedlać wpływ wielkości próby na szacowanie informacji.
5. Oblicz informacje, wykonując kroki 11.1–11.2 na rosnącej części danych (jak w kroku 5), aby skorygować odchylenie dotyczące wielkości próbki (metoda scyzoryka)³³.

12. Obliczanie redundancji, szumu i korelacji sygnału

1. Użyj optymalnych rozkładów wejściowych uzyskanych z oszacowania maksymalnej informacji, aby obliczyć wzajemną informację między danymi wejściowymi a odpowiedzią ekspresji genów każdego neuronu N. Plik źródłowy C++ "GetMI1D.c" to przykładowy program do uzyskiwania marginalnych wzajemnych informacji ze wspólnych rozkładów prawdopodobieństwa.
2. Oblicz redundancję, biorąc sumę wzajemnych informacji dla każdego neuronu uzyskanego powyżej, a następnie odejmij pojemność kanału.
3. Oblicz termin informacyjny "shuffle" ^13,34. Plik źródłowy szablonu języka C++ można znaleźć w pliku "GetShuffle.c".
4. Użyj terminu "shuffle", aby obliczyć korelację sygnału i szumu. Dla korelacji sygnału mamy a dla korelacji szumu mamy .
5. Niepewności dotyczące redundancji, uzyskać korelację szumu i sygnału jak dla całkowitej informacji (krok 11.3 poprzedniej sekcji) z wielokrotnego próbkowania 80% danych i biorąc pod uwagę odchylenie standardowe.

Results

Przeprowadzając eksperymenty na długości życia mutantów interesujących genów wraz z dzikim szczepem N2, można ustalić, czy te geny odgrywają rolę w odpowiedzi pokarmowej na DR o szerokim zakresie. Odpowiedź typu dzikiego powinna być porównywalna do tej przedstawionej w Rysunek 1A. Każda modulacja tej odpowiedzi przez mutanty, odzwierciedlona przez niejednorodny efekt w różnych warunkach żywieniowych, wskazuje, że geny te wpływają na zdolność robaka do prawidłowego reagowania na zmiany w obfitości pokarmu, w którym to momencie uzasadnione są dalsze badania odpowiedzi ekspresyjnych tych genów na DR o szerokim zakresie. Jeśli jednak reakcja długowieczności mutantów nie różni się znacząco od typu dzikiego, to geny nie odgrywają żadnej roli w transdukowaniu skutków DR o szerokim zasięgu, przynajmniej na poziomie średniej długości życia. Jeśli mutacje powodują równomierne przesunięcie odpowiedzi na całą długość życia, oznacza to, że geny mają niezależny od żywności wpływ na długowieczność. Nie wyklucza to możliwości, że ekspresja genów będących przedmiotem zainteresowania reaguje na pokarm, w którym to przypadku informacja przenoszona przez te geny nie jest przekazywana na całe życie.

Następnym etapem protokołu jest określenie, jak zmieniają się poziomy ekspresji w szerokim zakresie DR dla interesujących genów. W Rysunek 1B, ilustrujemy to za pomocą poziomów ekspresji reportera transkrypcyjnego daf-7, który pokazuje reakcję na zmiany poziomu pokarmu w neuronach czuciowych ASI. W mutancie daf-7(-) odpowiedź ekspresyjna reportera transkrypcyjnego jest zmieniona. Jeśli interesujące nas geny są naprawdę wrażliwe na pokarm na poziomie długości życia, można się spodziewać, że ich ekspresja również zmieni się wraz z jedzeniem. W związku z tym, reporter transkrypcyjny w tle mutanta powinien mieć zmieniony profil ekspresji w odpowiedzi na DR o szerokim zakresie. Jednak możliwe jest również, że reporter transkrypcyjny interesującego genu na tle typu dzikiego nie wykazuje żadnych zmian w ekspresji reagujących na pokarm. W tej sytuacji może to wskazywać na potranskrypcyjny efekt regulacyjny, który wykracza poza zakres tego protokołu.

W Diana et al. (2017)¹³ wyodrębniliśmy wartości wyrażeń dla daf-7 w ASI i tph-1 w ADF i NSM. W Rysunek 2A, ilustrujemy oszacowanie rozkładu wyrażeń w ASI i ADF dla danego poziomu żywności. Posiadanie wielu odczytów z obrazów pojedynczych robaków pozwala nam analizować nie tylko ilość informacji zakodowanych niezależnie przez każdy neuron, ale także informacje kombinatoryczne całego obwodu neuronalnego (Rysunek 2B-2C). Połączenie tych dwóch miar teorii informacji pozwala nam scharakteryzować system pod względem strategii kodowania stosowanej przez neurony do przekazywania informacji o jedzeniu. Wielkość redundancji w obwodzie można uzyskać, biorąc sumę wzajemnych informacji dla każdego neuronu i odejmując wspólną wzajemną informację (pojemność kanału) uzyskaną przez uwzględnienie kombinatorycznych odczytów obwodu. Dodatnia wartość takiej różnicy oznacza nadmiarowy charakter strategii kodowania, ponieważ skumulowana informacja między częściami jest większa niż rzeczywista informacja zakodowana przez cały obwód. I odwrotnie, wartość ujemna odzwierciedla strategię synergiczną, ponieważ zakodowana prawdziwa informacja jest większa niż suma jej składników (Rysunek 2B). Informacje i redundancja mogą być porównywane w różnych genotypach w celu zbadania możliwych ról regulacji genów wyższego rzędu, na przykład w Diana i wsp. (2017)¹³ efekt mutacji DAF-7 zmienia strategię kodowania z nadmiarowej na synergiczną (Rysunek 2C-2D).

Rysunek 1: Reakcja długości życia i ekspresji genów w szerokim zakresie DR. (A) Średnia długość życia dzikiego szczepu N2 (linia) wykazuje złożoną odpowiedź na DR o szerokim zakresie. Wielkość tej odpowiedzi jest osłabiona w mutancie zerowym genu daf-7 (czerwona linia). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej, zbiorcze dane z Entchev i wsp. (2015)¹². (B) Średnie poziomy ekspresji reportera transkrypcyjnego dla genu daf-7 na tle typu dzikiego (linia) również wykazują złożoną, niemonotoniczną odpowiedź na DR o szerokim zasięgu. W tle genetycznym daf-7(-) ekspresja tego reportera transkrypcyjnego jest silnie osłabiona i wykazuje niewielką reakcję na zmiany poziomu pokarmu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej, dane z pojedynczego badania w Entchev et al. (2015)¹². Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Metodologia obliczeniowa. (A) Ilustracja dwuwymiarowego oszacowania gęstości wyrażenia tph-1 w ADF i wyrażenia daf-7 w ASI, uzyskanego z pakietu R "ks" przy użyciu wymiaru siatki 30 x 30. (B) Wizualizacja informacji zakodowanej przez łączną ekspresję tph-1 i daf-7 (cały) i indywidualnie (suma części) dla neuronów ADF, ASI i NSM. Nadmiarowe i synergiczne znaki kodowania są reprezentowane przez różnicę między wysokością ułożonych w stos pasków po prawej stronie a informacją zakodowaną przez pełny obwód. (C) Porównanie informacji o żywności zakodowanych przez zwierzęta typu dzikiego i mutantów daf-7(-). (D) Ograniczeniu wzajemnej informacji obserwowanemu u mutantów towarzyszy przejście na kodowanie synergiczne. Panele B-D są adaptacją Diana et al. (2017)¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stężenie bakterii (komórki/ml) Gęstość optyczna (600nm) Współczynnik rozcieńczenia (z poprzedniego) 1.12E+10 TGL 56.000 jedni 0,00 2.00E+09 10.000 OSÓB Godzina 5,60 6.32E+08 3,160 3,16 6.32E+07 0,316 pkt. godz. 10.00 2.00E+07 0,100 pkt. 3,16 0 (S podstawowe) 0,000 nie

Tabela 1: Poziomy żywności i współczynniki rozcieńczenia stosowane w szerokim zakresie DR. Stężenia bakterii (komórki/ml) stosowane w protokole DR o szerokim zakresie, wraz z odpowiednimi pomiarami OD₆₀₀ i współczynnikiem rozcieńczenia wymaganym do osiągnięcia każdego stężenia z poprzedniego.

Eksperymentalna temperatura życia dzień 12,5°C 15°C 17,5°C 20°C 22,5°C 25°C 27,5°C -12 pkt. Pokrój wszystkie szczepy na świeże talerze NGM i utrzymuj w temperaturze 20°C -11 pkt. -10 pkt. Ustaw generację P0 szczepów daf-7(-) i utrzymuj ją w temperaturze 20°C (1 L4 na płytkę, 5 płytek) -9 pkt. Ustaw generację P0 dzikich szczepów i utrzymuj ją w temperaturze 20°C (1 L4 na płytkę, 5 płytek) -8 pkt. -7 pkt. -6 pkt. -5 pkt. Ustaw generację F1 szczepów daf-7(-) i utrzymuj ją w temperaturze 20°C (1 L4 na płytkę, 90 płytek) -4 szt. Ustaw generację F1 dzikich szczepów i utrzymuj je w temperaturze 20°C (1 L4 na płytkę, 30 płytek) -3 Szt. -cyfra arabska -1 szt. 0 Wybierz larwy F2 L4 do >jaja-5 płytek RNAi i utrzymuj w temperaturze 20°C (15 L4 na płytkę, 24 płytki) 1 Przenieś 1-dniowych dorosłych na płytki NSC z 2.0E+9 komórek/ml poziomu pokarmu i utrzymuj w temperaturze 20°C cyfra arabska Przenieś 2-dniowe dorosłe osobniki na płytki NSC z eksperymentalnymi warunkami żywieniowymi i do eksperymentalnej temperatury 3 przelać przelać przelać przelać przelać przelać przelać 4 5 przelać przelać przelać przelać przelać przelać przelać 6 7 przelać przelać przelać przelać przelać przelać przelać 8 9 przelać przelać przelać przelać przelać przelać przelać 10 11 przelać przelać przelać przelać przelać przelać 12 13 14 przelać przelać przelać przelać 15 16 17 Rozdział 18 przelać przelać Rozdział 19 20 21 22 Rozdział 22 przelać

Tabela 2: Harmonogram długości życia przeprowadzany w różnych temperaturach. Schematyczny zarys kroków potrzebnych do skonfigurowania eksperymentów o długości życia DR o szerokim zakresie w różnych temperaturach na przykładzie szczepów daf-7(-) i typu dzikiego. Liczba transferów na świeże talerze każdego eksperymentalnego poziomu żywności zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. Ma to na celu uwzględnienie faktu, że zwierzęta w wyższych temperaturach starzeją się szybciej, a zatem są bardziej podatne na uszkodzenia fizyczne podczas przenoszenia.

Dni Potok obrazowania -14 pkt. Szczepy Chunk Reporter w tle daf(-). Przechowywać w temperaturze 20 °C. -13 pkt. Szczepy Chunk Reporter na tle typu dzikiego. Przechowywać w temperaturze 20 °C. -12 pkt. Skonfiguruj generację P0 szczepów reporterowych daf-7(-). Użyj 3 larw L4 na 10 cm płytkę NGM. Użyć 2 płytek i utrzymywać w temperaturze 20 °C. -11 pkt. -10 pkt. Skonfiguruj generację P0 dzikich szczepów reporterskich. Użyj 3 larw L4 na 10 cm płytkę NGM. Użyć 2 płytek i utrzymywać w temperaturze 20 °C. -9 pkt. -8 pkt. Skonfiguruj generację F1 szczepów reporterowych daf-7(-). Użyj 3 larw L4 na 10 cm płytkę NGM. Użyć 12 płytek i utrzymywać w temperaturze 20 °C. -7 pkt. -6 pkt. Skonfiguruj generację F1 dzikich szczepów reporterskich. Użyj 3 larw L4 na 10 cm płytkę NGM. Użyć 4 płytek i utrzymywać w temperaturze 20 °C. -5 pkt. -4 szt. -3 Szt. Szczepy reporterowe daf-7(-) wybielać po południu (~ 17) i składać jaja na 3 10-centymetrowych płytkach NGM i utrzymywać w temperaturze 20 °C. -cyfra arabska Wybielaj szczepy reporterowe typu dzikiego rano (~ 10 rano) i składaj jaja na 3 10-centymetrowych płytkach NGM i utrzymuj w temperaturze 20 °C. -1 szt. 0 Umyj L4 do 10 cm jajko - 5 płytek RNAi. Użyj 3 płytek na szczep i utrzymuj w temperaturze 20 °C. 1 Umyj dorosłe osobniki w ciągu 1 dnia na płytkach NSC wysianych komórkami 2,0E+9/ml. Użyj 3 płytek na szczep i utrzymuj w temperaturze 20 °C. cyfra arabska Umyj 2-dniowe dorosłe osobniki na płytkach NSC z eksperymentalnymi poziomami pokarmu. Użyj 3 płytek na szczep i przejdź do temperatury eksperymentalnej. 3 Przenieś na świeże talerze NSC. Użyj 3 płytek na szczep i utrzymuj w temperaturze eksperymentalnej. 4 5 Przenieś na świeże talerze NSC. Użyj 3 płytek na szczep i utrzymuj w temperaturze eksperymentalnej. 6 Zbieraj zwierzęta z talerzy i przygotuj się do obrazowania.

Tabela 3: Harmonogram procesu obrazowania. Schematyczny zarys kroków potrzebnych do skonfigurowania eksperymentów obrazowania DR o szerokim zakresie przy użyciu fluorescencyjnych transkrypcyjnych szczepów reporterowych na tłach daf-7 (-) i dzikich w różnych temperaturach jako przykłady.

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy nową metodę ograniczania diety, która obejmuje znacznie szerszy zakres stężeń żywności niż wcześniej opublikowane protokoły. Metoda ta łączy dwa wcześniej odrębne zjawiska obserwowane w literaturze DR C. elegans , deprywację bakteryjną i klasyczne ograniczenia dietetyczne, co pozwala na badanie obu efektów dietetycznych w ramach jednego protokołu. Korzystając z nowego paradygmatu DR o szerokim zakresie, przedstawiamy ogólne ramy badania ekspresji genów w pojedynczej komórce w odpowiedzi na określony sygnał środowiskowy i określania, w jaki sposób ta komórka koduje informacje. Nasza struktura składa się z dwóch protokołów eksperymentalnych, które ilustrują, jak wykonywać odpowiednio długość życia i obrazowanie ilościowe w ramach szerokiego zakresu DR. Dane z tych protokołów eksperymentalnych można następnie badać za pomocą analiz obliczeniowych dostarczonych w tych ramach w celu ilościowego określenia informacji zakodowanych przez zmiany w poziomach ekspresji genów lub długości życia w różnych warunkach żywnościowych.

Eksperymenty dotyczące długości życia z wykorzystaniem paradygmatu DR o szerokim zakresie obejmują sześć różnych poziomów żywności (Tabela 1). Wymaga to bardziej pracochłonnego podejścia niż badanie długowieczności przy mniejszej liczbie poziomów pożywienia, takich jak deprywacja dietetyczna^10,11 lub wykorzystanie tła genetycznego eat-2 ³⁵. Jednak badanie długości życia w jednym warunku może ograniczyć interpretacje roli genu w DR. Na przykład niedawno wykazaliśmy, że mutanty daf-7 mają dwukierunkowe osłabienie odpowiedzi na stężenie pokarmu w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego¹² (Figura 1A). W przypadku braku pożywienia mutanty daf-7 wykazują skrócenie długości życia w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Gdybyśmy wzięli pod uwagę tylko deprywację żywieniową, zinterpretowalibyśmy, że gen daf-7 jest niezbędny tylko do wydłużenia życia, podczas gdy w rzeczywistości rola daf-7 jest bardziej złożona. Dlatego kluczowym wynikiem tej części protokołu jest ustalenie, czy gen będący przedmiotem zainteresowania jest zaangażowany w modulowanie ogólnej odpowiedzi długości życia na zmiany w obfitości pożywienia.

Jedną z głównych zalet tego protokołu w porównaniu z innymi metodami jest to, że wykorzystuje on nowatorską metodę do eliminacji produkcji potomstwa u zwierząt poddawanych analizie długości życia. W większości badań stosuje się lek FuDR w celu zahamowania proliferacji linii zarodkowej u dorosłych, czyniąc ich bezpłodnymi. Jednak ostatnie badania wykazały, że leczenie FuDR może mieć wpływ na długość życia w zależności od stanu i genu 17,18,19,20,21, co stawia pod znakiem zapytania jego ogólne zastosowanie. W tym protokole eliminacja produkcji potomstwa osiąga się poprzez 24-godzinne traktowanie zwierząt RNAi ukierunkowanym na gen jaja-5, który hamuje tworzenie się chitynowej skorupki jajowej zapłodnionych oocytów C. elegans, powodując ich śmierć^22,23. Zaletą tej metody jest to, że działa bardzo późno, a więc nie ingeruje w linię zarodkową, która jest głównym regulatorem długowieczności C. elegans.

Jednym z potencjalnych zastrzeżeń związanych z szeroko zakrojonym protokołem DR jest jego zależność od stosowania antybiotyków w celu kontrolowania namnażania się bakterii w celu zapewnienia ścisłej kontroli stężenia bakterii. Wiadomo, że namnażanie się bakterii w jelitach robaka jest główną przyczyną śmierci C. elegans¹⁶. Tak więc stosowanie antybiotyków bakteriostatycznych, takich jak karbenicylina, w agarze NGM zapobiega namnażaniu się bakterii i wydłuża życie robaków w porównaniu z kontrolami bez antybiotyków¹⁶. Wykazano, że niektóre rodzaje antybiotyków, takie jak ryfampicyna³⁶ i członkowie rodziny tetracyklin ^37,38, wydłużają życie C. elegans niezależnie od ich wpływu na proliferację bakterii. Jednak w literaturze nie ma dowodów na to, że zarówno karbenicylina, jak i streptomycyna mogą zwiększać długowieczność niezależnie od ich wpływu na namnażanie się bakterii.

Długość życia może być postrzegana jako wynik złożonych obliczeń, w których informacje środowiskowe, kierowane przez ekspresję genów w sieciach neuronalnych, są przekazywane do fizjologii. Nasz protokół zapewnia metodologię pozwalającą zrozumieć, w jaki sposób określone geny wpływają na ten przepływ informacji o środowisku. Aby odpowiedzieć na to pytanie, potrzebujemy niezawodnego przetwarzania obrazu, aby określić rozkład odpowiedzi ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Możliwość oszacowania nie tylko średniej odpowiedzi ekspresji genów na zmiany w obfitości żywności, ale także pełnego rozkładu statystycznego w dużych populacjach stanowi ważny wymóg dla możliwości zastosowania naszej metody. Ten dokładny opis reakcji ekspresji genów na obfitość pożywienia pozwala na zastosowanie teorii informacji do ilościowego określenia informacji kodowanych przez określone neurony, a także strategii kodowania stosowanej przez obwód neuronalny.

Obrazowanie i aspekty obliczeniowe metod opisanych w niniejszym protokole mają zastosowanie do szerszego zestawu kontekstów biologicznych. W naszej pracy skupiliśmy się na małej sieci neuronowej zaangażowanej w wykrywanie żywności, jednak analizy cech przetwarzania informacji nie ograniczają się do konkretnego typu komórki lub określonych sygnałów środowiskowych. W przyszłości metodologie te mogą zostać potencjalnie rozszerzone na większą różnorodność zmiennych wejściowych, wpływając na wszelkie wyniki fizjologiczne. Podejścia te przyczynią się do lepszego zrozumienia, w jaki sposób sieci regulacyjne genów kodują, przetwarzają i przesyłają informacje.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Karbenicylina Sól disodowa	Sigma-Aldrich	C1389-5G	Antybiotyk
Streptomycyna Sól siarczanowa	Sigma-Aldrich	S6501-50G	Antybiotyk
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758-10G	Induktor do płytek RNAi
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	71380-1KG-M	Stosowany w bazie S i agarze NGM
di-Wodorofosforan potasu (K2HPO 4)	Sigma-Aldrich	1.05104.1000	Stosowany w bazie S i agarze NGM
Di-wodorofosforan potasu (KH2PO4 )	Sigma-Aldrich	P9791-1KG	S basal i NGM agar
(MgSO4)	Sigma-Aldrich	M2643-1KG	Stosowany w agarze
NGMChlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G	Stosowany w agarze NGM
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	71687-500G	Używany do wybielania
Pluronic-F127	Sigma-Aldrich	P2443-1KG	Stosowany w obrazowaniu
Podchloryn sodu (NaClO)	Sigma-Aldrich	1.05614.2500	Służy do wybielania
LB Bulion	Invitrogen	12780052	Służy do hodowli bakterii
Adavanced TC 6 cm Płytki do kultur tkankowych	Greiner Bio-One	628960	Płytki do
hodowli tkankowych CellStar 10cm	Greiner Bio-One	664160	Płytki do obrazowania
Końcówki P200 o niskiej retencji	Brandt	732832	Wskazówki dotyczące obchodzenia się z robakami w płynie
Agar	BD	214510	Agar do płytek NGM, RNAi i NSC
Bactoo-pepton	BD	211820	Pepton do płytek NGM, RNAi i NSC