Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

Summary

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Abstract

Choroba wieńcowa (CAD) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Miażdżyca, główna przyczyna choroby wieńcowej, jest inicjowana przez transmigrację wrodzonych monocytów immunologicznych do miejsc zapalnych zdeponowanych lipidów zwanych smugami tłuszczowymi, które są obecne w ścianach tętnic średnich i dużych tętnic. Kluczową cechą patogenną zmian w tym wczesnym stadium miażdżycy jest dojrzewanie monocytów, które migrują do tętnic, tworząc komórki piankowate lub makrofagi obciążone lipidami. Wiele dowodów potwierdza hipotezę, że ryzyko miażdżycy zwiększa przewlekłe stany zapalne towarzyszące chorobom takim jak reumatoidalne zapalenie stawów i HIV, a także ogólne starzenie się, a ryzyko to jest przewidywane przez aktywację monocytów. Podczas gdy modele mysie stanowią dobrą platformę do badania roli monocytów w miażdżycy in vivo, wymagają one genetycznej zmiany naturalnego metabolizmu cholesterolu i drastycznej zmiany normalnej diety myszy oraz mają ograniczoną przydatność do badania aterogennych wpływów chorób współistniejących u ludzi. To zmotywowało nas do opracowania ludzkiego modelu in vitro do pomiaru potencjału miażdżycowego monocytów wyizolowanych od osób o określonych stanach chorobowych. Obecnie ludzkie modele in vitro są ograniczone, ponieważ oceniają transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowatych w izolacji. Tutaj opisujemy protokół, w którym monocyty wyizolowane z krwi pacjenta transmigrują przez ludzkie komórki śródbłonka do macierzy kolagenowej typu 1 i mierzona jest ich skłonność do dojrzewania do komórek piankowatych w obecności lub braku egzogennego lipidu. Protokół został zatwierdzony do stosowania ludzkich monocytów oczyszczonych z osób zakażonych wirusem HIV i osób w podeszłym wieku niezakażonych wirusem HIV. Model ten jest wszechstronny i umożliwia ocenę transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej, a także umożliwia ocenę czynników aterogennych obecnych w surowicy lub osoczu.

Introduction

Transmigracja monocytów jest kluczowym krokiem w rozwoju blaszki miażdżycowej, która może prowadzić do zakrzepicy, udaru mózgu i zawału mięśnia sercowego. Blaszki miażdżycowe rozwijają się ze smug tłuszczowych, zwykle obecnych w miejscach o niskim oscylacyjnym przepływie krwi w średnich i dużych tętnicach, gdzie zdeponowany lipid przyczynia się do aktywacji śródbłonka i miejscowego stanu zapalnego¹. Monocyty są rekrutowane do komórek śródbłonka w smugach tłuszczowych za pośrednictwem białek chemotaktycznych monocytów (takich jak CCL2) i transmigrują do intima². Po transmigracji monocyty mogą tworzyć aterogenne, obciążone lipidami makrofagi zwane komórkami piankowatymi w wyniku wychwytu lipidów, syntezy lipidów, regulacji w dół wypływu cholesterolu lub kombinacji powyższych czynników. Monocyty mogą również gromadzić lipidy w krążeniu i mieć "pienisty" fenotyp, co może predysponować komórki do tworzenia komórek piankowych^3,4. Komórki piankowate są cechą charakterystyczną smug tłuszczowych i blaszek miażdżycowych we wczesnym stadium, a na ich powstawanie mają wpływ zarówno mediatory lipidowe, jak i zapalne⁵. Alternatywnie, monocyty mają zdolność do odwrotnej transmigracji z tętnicy do krwiobiegu⁶, usuwając w ten sposób lipid z błony wewnętrznej i działając na rzecz utrzymania zdrowia tętnicy.

Określenie skłonności monocytów do transmigracji przez śródbłonek tętnicy i tworzenia komórek piankowatych w błonie wewnętrznej, lub do odwrócenia transmigracji i wyprowadzenia lipidów z płytki miażdżycowej, jest kluczowym wymogiem dla zrozumienia roli aktywacji monocytów w zwiększaniu ryzyka miażdżycy. Mysie modele CAD, takie jak miażdżyca, są ważne w wyjaśnianiu w czasie rzeczywistym informacji in vivo na temat rozwoju smug tłuszczowych/blaszek miażdżycowych. Jednak modele te wymagają genetycznej zmiany naturalnych zdolności przetwarzania cholesterolu u tych zwierząt, zwykle w połączeniu z drastycznymi zmianami w diecie (takimi jak model diety typu zachodniego ApoE-/-)^7,8, indukując w ten sposób niefizjologiczne nagromadzenie krążących lipidów, które napędzają rozwój płytki nazębnej. Modele te mogą mieć ograniczone znaczenie w przypadku przewlekłych stanów zapalnych u ludzi, takich jak zakażenie wirusem HIV, które nie są związane ze zwiększonym poziomem krążącego cholesterolu lub lipoprotein o niskiej gęstości (LDL). Co więcej, różnice w biologii monocytów między ludźmi a myszami utrudniają testowanie pytań immunologicznych dotyczących znaczenia subpopulacji monocytów (takich jak monocyty pośrednie (CD14⁺⁺CD16+))⁹. Jest to ważne podczas badania mechanizmów napędzających choroby sercowo-naczyniowe, ponieważ pośrednia liczba monocytów niezależnie przewiduje zdarzenia sercowo-naczyniowe^10,11. Chociaż istnieją testy do sekwencyjnego pomiaru transmigracji monocytów lub tworzenia komórek piankowatych w izolacji, żaden test in vitro nie został zwalidowany do ilościowego określenia obu aspektów wczesnej miażdżycy przy użyciu tych samych komórek z kohort klinicznych. Modele Transwell wykorzystują zmodyfikowany dwukomorowy system Boydena, w którym komórki są ładowane do górnej komory i transmigrują przez porowatą barierę z tworzywa sztucznego lub monowarstwę komórek do dolnej komory, która zwykle zawiera pożywkę z chemoatraktantem^12,13. Chociaż modele te są szeroko stosowane do analizy transmigracji leukocytów, na ogół nie zawierają warstwy reprezentującej błonę wewnętrzną, co powoduje migrację transmigrujących komórek do roztworu i nie pozwala na pomiar tworzenia się komórek piankowatych lub odwrotnej transmigracji tych samych komórek. I odwrotnie, modele tworzenia komórek piankowatych nie uwzględniają żadnych zmian w monocytach wywołanych przez transmigrację ani efektów aktywacji śródbłonka, o której wiadomo, że przyczynia się do tworzenia komórek piankowatych¹⁴. Ponadto systemy te indukują tworzenie komórek piankowych z makrofagów przylegających do płytek hodowli komórkowych poprzez dodanie nasyconych stężeń egzogennej utlenionej lipoproteiny o niskiej gęstości (oxLDL)^15,16, kluczowy induktor tworzenia komórek piankowych. LDL stosowany w tych modelach jest często utleniany przez procesy nieistotne fizjologicznie, takie jak leczenie CuSO₄¹⁷, co kwestionuje fizjologiczne znaczenie badań z wykorzystaniem tych modeli.

Tutaj opisujemy test, który określa ilościowo transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowych tych samych komórek, co nie wymaga dodawania egzogennego oxLDL, co pozwala lepiej modelować rolę monocytów w tworzeniu komórek piankowych. Model ten został pierwotnie opracowany przez profesora Williama Mullera (Northwestern University, Chicago)¹⁸ i został udoskonalony w naszym laboratorium, aby ocenić ex vivo atherogeniczność monocytów wyizolowanych w warunkach nieaktywujących od osób z podstawowymi stanami zapalnymi towarzyszącymi chorobom, takim jak zakażenie wirusem HIV¹⁹ oraz starzenie się²⁰, które wiążą się ze zwiększonym ryzykiem miażdżycy. Model ten stanowi również platformę do odpowiedzi na podstawowe pytania biologiczne dotyczące skłonności różnych podzbiorów monocytów do tworzenia komórek piankowych²⁰, wpływu aktywacji śródbłonka przez cytokiny, takie jak TNF, na tworzenie komórek piankowatych¹⁴, oraz właściwości migracyjnych monocytów, takich jak głębokość i szybkość transmigracji w żelach¹⁹. Co więcej, transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowatych można określić ilościowo za pomocą standardowej mikroskopii, obrazowania żywych komórek, cytometrii przepływowej i obrazowej cytometrii przepływowej, zapewniając w ten sposób wszechstronną metodę oceny roli monocytów w miażdżycy.

Protocol

UWAGA: Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem ludzkich próbek biologicznych zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Człowieka Szpitala Alfred w Melbourne. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w komorach bezpieczeństwa biologicznego klasy II, chyba że określono inaczej. "Wstępnie podgrzany" odnosi się do odczynników podgrzanych do 37 °C w łaźni wodnej.

1. Przygotowanie włóknistych żeli kolagenowych typu I: Dzień 1

1. Przygotuj spolimeryzowane żele kolagenowe, kolejno dodając i mieszając 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM kwasu octowego i 1,71 mg / ml kolagenu włóknistego typu I w probówce polistyrenowej o pojemności 5 ml zgodnie z tabelą 1.
   UWAGA: Upewnij się, że kolagen jest dobrze wymieszany, delikatnie pipetując w górę iw dół 5 razy, aby zatrzymać tworzenie się "kieszeni" kolagenowych w mieszance żelu. Przygotuj 4-6 żeli na warunki testowe do mikroskopii lub 15 żeli na warunki testowe do cytometrii przepływowej.
2. Po dokładnym wymieszaniu należy podać 50 μl mieszaniny żelu kolagenowego do każdego dołka sterylnej płaskodennej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Nie używaj zewnętrznych rzędów i kolumn, ale wypełnij je 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) firmy Dubecco, aby chronić żele przed wysuszeniem. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 2 godziny, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
   Uwaga: Umieść płytki bezpośrednio na czystych metalowych stojakach w inkubatorze, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie ciepła.
3. Po inkubacji nałożyć na żele 150 μl 1x uzupełnionego M199 (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 5 dni aż do użycia.

2. Rozbudowa przechowywanego HUVEC: Dzień 1

1. Oznaczyć i pokryć szalkę Petriego o średnicy 10 cm 1 ml fibronektyny o 50 μg/ml rozcieńczonej w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Rozmrozić podwielokrotności kriokonserwowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, 1,0 x 10⁶ komórek) w 10 ml M20,
   UWAGA: HUVEC powinien być przygotowany zgodnie z wcześniejszym opisem²¹ i używany przy niskim numerze przejścia (< przejście 4). HUVEC można tu zastąpić ludzkimi komórkami śródbłonka tętnicy wieńcowej.
3. Ponownie zawiesić HUVEC w 10 ml M20 i dodać do naczynia pokrytego fibronektyną, odsysając nadmiar fibronektyny przed dodaniem komórek i hodowlę do zbiegu (około 5 dni), zastępując pożywkę w dniu 3.

3. Hodowla monowarstwy HUVEC na żelach kolagenowych: Dzień 5

1. W dniu 5 należy odłączyć HUVEC przez odsysanie supernatantu hodowlanego z szalki Petriego i wypłukanie pożywki zawierającej surowicę 10 ml niezawierającego surowicy M199.
2. Dodaj 5 ml 0,05% trypsyny/0,53 EDTA w M199 do HUVEC i inkubuj przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, aż komórki się oderwą.
3. Po odłączeniu szybko przepłucz szalkę Petriego 5 ml M20 i przenieś podłoże zawierające komórki do probówki o pojemności 10 ml.
4. Odwirować próbki o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 200 μl M20 i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
5. Zawiesić komórki do 2,0 x 10⁵ komórek/ml w M20, odessać M199 na żelach z płytki 96-dołkowej (krok 1.3) i dodać 100 μl ponownie zawieszonego HUVEC (2,0 x 10⁴ komórki) do każdego żelu kolagenowego przygotowanego powyżej (krok 1.2). Płytki hodowlane przez kolejne 3 dni w temperaturze 37 °C/5% CO₂,
   UWAGA: Integralność monowarstwy HUVEC można potwierdzić po 3 dniach za pomocą barwienia azotanem srebra²² lub immunohistochemii dla białek o ścisłym połączeniu²³ na tym etapie. W tym celu należy przygotować dodatkowe żele.

4. Aktywacja monowarstwy HUVEC i izolacja/aktywacja monocytów do transmigracji: Dzień 8

1. W dniu 8 aktywuj każdą monowarstwę HUVEC przed dodaniem monocytów, odsysając pożywkę M20 nakładającą się na żele i dodając 100 μl 10 ng/ml ludzkiego TNFα w M20 na żel. Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 4 h.
   UWAGA: W razie potrzeby można również uwzględnić warunki nieaktywowanego HUVEC jako elementy sterujące.
2. Podczas 4-godzinnego etapu aktywacji HUVEC należy wyizolować monocyty z PBMC za pomocą technik kulek magnetycznych, aby dokonać negatywnej selekcji komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Na tym etapie należy użyć co najmniej 6,5 x 10⁶ PBMC, aby niezawodnie odzyskać 3,0 x 10⁵ monocytów wymaganych dla jednego schorzenia, ponieważ monocyty zwykle stanowią około 10-15% PBMC.
   UWAGA: Aby ocenić wpływ aktywacji monocytów przed transmigracją monocytów i tworzeniem komórek piankowatych, monocyty mogą być aktywowane na tym etapie. W razie potrzeby monocyty można wyizolować z rozmrożonych PBMC (tj. przechowywanych próbek pacjentów). Podzbiory monocytów wyizolowane przez sortowanie FACS można przygotować do dodania do żeli (ryc. 1).

5. Transmigracja pierwotnych ludzkich monocytów: Dzień 8

1. Aby zmierzyć transmigrację monocytów, usuń pożywkę zawierającą TNFα i dwukrotnie przemyj żele 100 μl M199, dodając i usuwając pożywkę. Po umyciu dodać 2,0 x 10⁵ świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych i umytych kriokonserwowanych PBMC lub 5,0 x 10⁴ świeżo wyizolowanych monocytów lub oczyszczonych podzbiorów monocytów do monowarstw HUVEC w 100 μl M20. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aby umożliwić transmigrację monocytów do żelu. Najlepiej jest pozostawić 6 studzienek na każdy badany warunek eksperymentalny.
   UWAGA: Aby ocenić wpływ surowicy autologicznej na transmigrację i tworzenie komórek piankowatych, inkubuj komórki z M20 zawierającym pożądane stężenie inaktywowanej termicznie surowicy dawcy i porównaj z warunkami z zbiorczą kontrolą surowicy ludzkiej. Na tym etapie można dodać leukocyty inne niż monocyty. Jeśli badasz wpływ określonych lipidów/gatunków lipidów (np. HDL, oxHDL), wykonaj wszystkie poniższe kroki z pożywką bez surowicy zawierającą 20-50 μg/ml lipidów.
2. Po 1 godzinie transmigracji do przodu, zebrać nietransmigrowane komórki, przemując żele dwukrotnie 100 μl wstępnie podgrzanego 1 mM EGTA w 1x PBS i raz 100 μl M199 (te same warunki wirówki), łącząc supernatanty z każdej studzienki w tych samych warunkach eksperymentalnych (zwykle 6 dołków) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml na lodzie. Odwirować nietransmigrowane komórki w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 30 μl 1x PBS.
3. Policz komórki zebrane w supernatancie, aby określić liczbę komórek transmigrujących do przodu.
4. Procent komórek transmigrowanych do przodu określa się w następujący sposób:
   
5. Przykryj przemyte żele zawierające transmigrowane komórki 100 μl M20 i inkubuj przez kolejne 48 godzin.
6. Po 48 godzinach zebrać supernatant i dwukrotnie przemyć nietransmigrowane komórki 100 μl, wstępnie podgrzanym 1 mM EGTA/PBS, zbierając i łącząc supernatant z każdego stanu, jak w kroku 5.2.
   UWAGA: Fenotyp komórek poddanych odwrotnej transmigracji może być badany na tych komórkach zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia cytometrii przepływowej.
7. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C, 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 30 μl 1x PBS. Policz komórki i określ żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
8. Określ procent komórek poddanych odwrotnej transmigracji, korzystając z następującego równania:
   
   UWAGA: Uwzględnienie całkowitej liczby komórek transmigrowanych do przodu daje dokładniejsze wskazanie transmigracji wstecznej, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby transmigracja do przodu wyniosła 100%.
9. Do analizy pod mikroskopem utrwalić żele, dodając 100 μl 2% formaldehydu (stężenie końcowe) do każdej studzienki, przykryć płytki folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy. W przypadku cytometrii przepływowej nie należy naprawiać komórek na tym etapie. Zapoznaj się z poniższymi protokołami analizy mikroskopowej (sekcja 6) lub cytometrii przepływowej (sekcja 7).
   UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i; używać środków ochrony osobistej (PPE). Należy zachować ostrożność podczas dodawania formaldehydu, jednak ten krok nie musi być wykonywany w dygestoriach ze względu na zastosowane niskie stężenie.

6. Oznaczanie ilościowe komórek piany i makrofagów za pomocą mikroskopii (barwienie olejowo-czerwone O)

1. Usuń formaldehyd i przemyj żele 100 μl 50% (v/v) metanolu przez 5 minut, a następnie 100 μl 78% (v/v) metanolu przez 15 min.
   UWAGA: Etapy barwienia można wykonywać na stole laboratoryjnym, a nie w komorze zagrożenia biologicznego klasy II.
2. Barwienie kropelek lipidów przez dodanie 100 μl świeżo przygotowanego 0,2% (w/v) Oil-Red O (szczegóły w Tabeli Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć nadmiar plam, myjąc żele 4 razy 100 μl 78% (v/v) metanolu, odsysając i wyrzucając supernatant po każdym praniu.
4. Barwienie przeciwstawne przez 15 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 100 μl Giemsy, rozcieńczonego w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej.
5. Odessać plamę Giemsa i raz umyć żele wodą.
6. Aby oderwać żele od płytki, należy obrzeżyć dołki za pomocą igły 21 G, skosem skierowanym na zewnątrz, wokół krawędzi żelu.
7. Aby zamontować żele na szkiełku mikroskopowym, należy przebić dwa otwory (średnica 6,35 mm) w pasku taśmy dwustronnej o wymiarach 2,54 cm x 1,5 cm. Przymocuj taśmę do standardowej strony mikroskopu i usuń powłokę ochronną od góry.
   1. Dodaj kroplę wody do otworów w taśmie za pomocą pipety transferowej. Za pomocą pęsety delikatnie przenieś żele do otworów w taśmie i przykryj szkiełkiem nakrywkowym w rozmiarze 1,5. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby przykleić je do taśmy.
8. Zbadaj za pomocą mikroskopii jasnego pola z kontrastem różnicowym przy użyciu obiektywu 40X w mikroskopie odwróconym.
   1. Ustaw ostrość monowarstwy HUVEC przy 40-krotnym powiększeniu i przewiń "w" żel, licząc makrofagi/komórki pianki na całej głębokości żelu. Powtórz tę czynność dla trzech różnych pól widzenia znajdujących się w podobnych odległościach od krawędzi żelu, aby zminimalizować możliwe efekty krawędzi. Zapewni to stałą głębokość żelu między regionami zliczania.
      UWAGA: Oceń komórki w żelu jako komórki piankowe (zdefiniowane jako komórki zawierające >1/3 ich cytoplazmy w postaci kropelek lipidów barwionych czerwienią olejową) lub makrofagi w ciągu 2 godzin od zamontowania na szkiełkach (Rysunek 2). Tworzenie komórek piankowych jest wyrażone jako procent komórek piankowych w stosunku do całkowitej liczby migrowanych komórek i jest wyrażone jako mediana zliczeń w 3 polach widzenia badanych dla 6 żeli na warunek, stąd mediana 18 pomiarów na warunek. Przykład surowej liczby komórek z typowego eksperymentu przedstawiono w tabeli 2.
      UWAGA: Klasyfikacja komórki jako komórki piankowej w porównaniu z makrofagami za pomocą mikroskopii jest subiektywna i w związku z tym może być zależna od badacza. W badaniach klinicznych, w których eksperymenty są przeprowadzane przez dłuższy czas, ważne jest, aby wszystkie zliczenia były wykonywane w ciemno przez jednego badacza. Przykłady komórek piankowych i makrofagów w żelach znajdują się na Rysunek 2.

7. Analiza transmigrowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej

1. Aby fenotypowo scharakteryzować komórki piankowate i makrofagi po migracji przezśródbłonkowej, należy trawić żele, dodając 100 μl 37 °C wstępnie podgrzanej 1 mg/ml kolagenazy D rozcieńczonej w M199 do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C/5% CO₂,
   UWAGA: Umieść 96-dołkowe płytki bezpośrednio na czystych metalowych stojakach w inkubatorze, aby zapewnić równomierne rozprowadzanie ciepła.
2. Po inkubacji zmacerować żele za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl i inkubować przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 °C/5% CO₂ .
3. Po całkowitym roztrawieniu przefiltrować i połączyć strawione kontrpliki żelowe przez 35 μm probówki FACS z nylonową siatką umieszczone na lodzie i przemyć raz płukaniem FACS (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C, 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl płukania FACS.
4. Inkubuj powstałe komórki z przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem specyficznymi dla CD45, markera żywej / martwej komórki oraz powierzchniowych/wewnątrzkomórkowych markerów fenotypowych lub funkcjonalnych będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowych protokołów cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Przygotować probówki kontrolne do kompensacji za pomocą odpowiednich fluoroforów i kulek kompensacyjnych Ig. Wyekstrahowane komórki można również zebrać na szkiełkach do mikroskopii immunofluorescencyjnej metodą cytoprzędzenia. Alternatywnie, udało nam się zebrać komórki przy użyciu tego protokołu do oceny za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.
5. Pobrać komórki za pomocą cytometru przepływowego i wykonać kompensację zgodnie z wymaganiami.
   UWAGA: Ponieważ komórki/makrofagi piankowe mogą nie tworzyć indywidualnych populacji przy użyciu właściwości rozpraszania światła i mogą znacznie różnić się rozmiarem i kształtem, ustaw bramki liberalnego rozproszenia do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), aby uchwycić wszystkie migrowane komórki, jak pokazano na Rysunek 3A.
6. Po akwizycji przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej. Aby zidentyfikować migrowane komórki, najpierw wybierz komórki jako ujemne dla żywego/martwego markera, jak pokazano na Rysunek 3B. Następnie przeprowadź dyskryminację pojedynczej komórki, tworząc ciasną bramkę wokół komórek pokazanych na wykresie o powierzchni SSC w stosunku do wysokości SSC.
7. Wybierz komórki CD45 ⁺ i bramkują główną populację migrowanych komórek obecnych na wykresie FSC / SSC, ponieważ są to makrofagi / komórki piankowe.

Results

Kwantyfikacja transmigracji monocytów

Monocyty są dodawane do modelu zgodnie z opisem w Rysunek 1, a dla każdego warunku przygotowuje się sześć żeli. Monocyty na 6 żeli na dawcę (tj. 5,0 x 10⁴ monocyty na żel 6 żeli = 3,0 x 10⁵ monocytów na dawcę) zawiesza się w końcowej objętości 600 μl pożywki M199 zawierającej wymaganą surowicę/wyizolowany lipid. Ko...

Discussion

Opisany tutaj protokół oferuje wszechstronną i fizjologicznie istotną metodę oceny miażdżycowości monocytów z ludzkich kohort klinicznych, łącząc zarówno transmigrację monocytów, jak i tworzenie komórek piankowatych. Model ten ma przewagę nad alternatywnymi metodami tworzenia komórek piankowatych, ponieważ uwzględnia wpływ transmigracji monocytów na tworzenie komórek piankowatych i umożliwia pomiar transmigracji odwrotnej⁶ oprócz wrodzonej skłonności monocytów do dojrzewania do komórek piankowatyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Żelowe odczynniki przygotowawcze
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0,1 M NaOH rozcieńczone w H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Kwas octowy rozcieńczony w H20
Cultrex Kolagen bydlęcy I	R& D Systems	3442-050-01	Typ I Kolagen włóknisty
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	Pożywka M199 zawierająca sole Earle'a, L-glutaminę i 2,2 g/l wodorowęglanu sodu. Pożywki uzupełnione o 100 &mikro; g/ml L-glutaminy  i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny
M20			Uzupełniony M199 zawierający 20% inaktywowanej termicznie surowicy zbiorczej lub dawcy. Do M199 można dodać poszczególne gatunki lipidów, takie jak LDL.
HUVEC			Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVEC) można wyizolować z pępowiny pobranej za świadomą zgodą i aprobatą etyczną. Izolowany HUVEC można również kupić komercyjnie.
		śródbłonka tętnicy wieńcowej	Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych można wyizolować z tętnic oddanych za świadomą zgodą i aprobatą etyczną. Wyizolowane komórki można również kupić komercyjnie.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Kwas glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego)-N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA) - 1 mM, pH 8,0
0,05% trypsyna EDTA	Gibco	25300-054	0,05% trypsyna/0,53 EDTA (1X)
L-glutamina	Gibco	25030-081	L-glutamina (200 mM)
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140-122	Penicylina/streptomycyna (10 000 jednostek/ml Penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml Streptomycyna)
Surowica cielęca noworodka	Gibco	16010-142	Surowica cielęca noworodka: Pochodzenie nowozelandzkie
Fibronektyna	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronektyna - 50 &mikro; g / ml podwielokrotności przygotowane i przechowywane
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (10x): Rozcieńczyć do 1x sterylnym H20
0,1% TNF	Gibco	PHC3015	Rekombinowany ludzki TNF - Rozpuszczony w H20 i przechowywany w 10 &mikro; g / ml podwielokrotności
Lipoprotein o niskiej gęstości	Merck Millipore	LP2-2MG	Lipoprotein o niskiej gęstości (LDL)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Mikroskopia
1 lub 2% formaldehydu	Polysciences	4018	1 lub 2% formaldehyd rozcieńczony sterylnym H20
50% i 78% metanolem	Ajax Finechem	318-2,5L GL	50% lub 78% v/v metanol, rozcieńczony olejem H20
Czerwona plama O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Rozcieńczony do 2 mg/ml w 22% 1M NaOH i 78% (v/v) metanolu
Szkiełka mikroskopowe	Mikro-Glass	S41104AMK	Podwójne, matowe, szlifowane pod kątem 45 stopni szkiełka mikroskopowe (25 X 76 mm)Szkiełka
nakrywkowe	Menzel-Glä ser	MENCS224015GP	22 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe szklane w rozmiarze #1,5
Taśma dwustronna	3M Scotch	4011	Super wytrzymała zewnętrzna taśma montażowa (25,4 mm x 1,51 m)
Bejca Giemsa	Merck Millipore	1.09204.0500	Roztwór błękitu metylenowego azur eozyny Giemsy (rozcieńczony materiał 1:10 w H20)
Dziurkacz			Ręczny dziurkacz jednootworowy (dziurkacz 6,35 mm)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Cytometria przepływowa
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Kolagenaza D rozcieńczona w pożywce M199 do 1 mg/ml
35 &mikro; m rurki polistyrenowe FACS z siatką nylonową BD	Biosciences	352235	35 i mikro; m rurki polistyrenowe FACS z siatką nylonową
Żywe/martwe Naprawialne żółte barwniki z martwych komórek	Life Technologies	L34959	Żywe/martwe Naprawialna żółta plama z martwych komórek
Mycie			Przygotować przez zmieszanie 1 X PBS-, 2 mM EDTA i 1% surowicy dla cieląt noworodków
Nazwa	Firma<	silny>Numer katalogowy	Komentarze
>Plasticware
96 dołkowa płytka	Nunclon	167008	Powierzchnia Delta płaskodenna 96-dołkowa płytka
10 cm Szalka Petriego	TPP	93100	Sterylna 10
cm szalka Petriego 1,5 ml Probówki Eppendorfa Eppendorf		0030 125.150	Probówki Eppendorfa
Przenosić pipeta	Samco Scientific	222-20S	Sterylna pipeta transferowa (1 mL, duża bańka)