Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56293

⸱

17 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.

Streszczenie

Choroba wieńcowa (CAD) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Miażdżyca, główna przyczyna choroby wieńcowej, jest inicjowana przez transmigrację wrodzonych monocytów immunologicznych do miejsc zapalnych zdeponowanych lipidów zwanych smugami tłuszczowymi, które są obecne w ścianach tętnic średnich i dużych tętnic. Kluczową cechą patogenną zmian w tym wczesnym stadium miażdżycy jest dojrzewanie monocytów, które migrują do tętnic, tworząc komórki piankowate lub makrofagi obciążone lipidami. Wiele dowodów potwierdza hipotezę, że ryzyko miażdżycy zwiększa przewlekłe stany zapalne towarzyszące chorobom takim jak reumatoidalne zapalenie stawów i HIV, a także ogólne starzenie się, a ryzyko to jest przewidywane przez aktywację monocytów. Podczas gdy modele mysie stanowią dobrą platformę do badania roli monocytów w miażdżycy in vivo, wymagają one genetycznej zmiany naturalnego metabolizmu cholesterolu i drastycznej zmiany normalnej diety myszy oraz mają ograniczoną przydatność do badania aterogennych wpływów chorób współistniejących u ludzi. To zmotywowało nas do opracowania ludzkiego modelu in vitro do pomiaru potencjału miażdżycowego monocytów wyizolowanych od osób o określonych stanach chorobowych. Obecnie ludzkie modele in vitro są ograniczone, ponieważ oceniają transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowatych w izolacji. Tutaj opisujemy protokół, w którym monocyty wyizolowane z krwi pacjenta transmigrują przez ludzkie komórki śródbłonka do macierzy kolagenowej typu 1 i mierzona jest ich skłonność do dojrzewania do komórek piankowatych w obecności lub braku egzogennego lipidu. Protokół został zatwierdzony do stosowania ludzkich monocytów oczyszczonych z osób zakażonych wirusem HIV i osób w podeszłym wieku niezakażonych wirusem HIV. Model ten jest wszechstronny i umożliwia ocenę transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej, a także umożliwia ocenę czynników aterogennych obecnych w surowicy lub osoczu.

Wprowadzenie

Transmigracja monocytów jest kluczowym krokiem w rozwoju blaszki miażdżycowej, która może prowadzić do zakrzepicy, udaru mózgu i zawału mięśnia sercowego. Blaszki miażdżycowe rozwijają się ze smug tłuszczowych, zwykle obecnych w miejscach o niskim oscylacyjnym przepływie krwi w średnich i dużych tętnicach, gdzie zdeponowany lipid przyczynia się do aktywacji śródbłonka i miejscowego stanu zapalnego1. Monocyty są rekrutowane do komórek śródbłonka w smugach tłuszczowych za pośrednictwem białek chemotaktycznych monocytów (takich jak CCL2) i transmigrują do intima2. Po transmigracji monocyty mogą tworzyć aterogenne, obciążone lipidami makrofagi zwane komórkami piankowatymi w wyniku wychwytu lipidów, syntezy lipidów, regulacji w dół wypływu cholesterolu lub kombinacji powyższych czynników. Monocyty mogą również gromadzić lipidy w krążeniu i mieć "pienisty" fenotyp, co może predysponować komórki do tworzenia komórek piankowych3,4. Komórki piankowate są cechą charakterystyczną smug tłuszczowych i blaszek miażdżycowych we wczesnym stadium, a na ich powstawanie mają wpływ zarówno mediatory lipidowe, jak i zapalne5. Alternatywnie, monocyty mają zdolność do odwrotnej transmigracji z tętnicy do krwiobiegu6, usuwając w ten sposób lipid z błony wewnętrznej i działając na rzecz utrzymania zdrowia tętnicy.

Określenie skłonności monocytów do transmigracji przez śródbłonek tętnicy i tworzenia komórek piankowatych w błonie wewnętrznej, lub do odwrócenia transmigracji i wyprowadzenia lipidów z płytki miażdżycowej, jest kluczowym wymogiem dla zrozumienia roli aktywacji monocytów w zwiększaniu ryzyka miażdżycy. Mysie modele CAD, takie jak miażdżyca, są ważne w wyjaśnianiu w czasie rzeczywistym informacji in vivo na temat rozwoju smug tłuszczowych/blaszek miażdżycowych. Jednak modele te wymagają genetycznej zmiany naturalnych zdolności przetwarzania cholesterolu u tych zwierząt, zwykle w połączeniu z drastycznymi zmianami w diecie (takimi jak model diety typu zachodniego ApoE-/-)7,8, indukując w ten sposób niefizjologiczne nagromadzenie krążących lipidów, które napędzają rozwój płytki nazębnej. Modele te mogą mieć ograniczone znaczenie w przypadku przewlekłych stanów zapalnych u ludzi, takich jak zakażenie wirusem HIV, które nie są związane ze zwiększonym poziomem krążącego cholesterolu lub lipoprotein o niskiej gęstości (LDL). Co więcej, różnice w biologii monocytów między ludźmi a myszami utrudniają testowanie pytań immunologicznych dotyczących znaczenia subpopulacji monocytów (takich jak monocyty pośrednie (CD14++CD16+))9. Jest to ważne podczas badania mechanizmów napędzających choroby sercowo-naczyniowe, ponieważ pośrednia liczba monocytów niezależnie przewiduje zdarzenia sercowo-naczyniowe10,11. Chociaż istnieją testy do sekwencyjnego pomiaru transmigracji monocytów lub tworzenia komórek piankowatych w izolacji, żaden test in vitro nie został zwalidowany do ilościowego określenia obu aspektów wczesnej miażdżycy przy użyciu tych samych komórek z kohort klinicznych. Modele Transwell wykorzystują zmodyfikowany dwukomorowy system Boydena, w którym komórki są ładowane do górnej komory i transmigrują przez porowatą barierę z tworzywa sztucznego lub monowarstwę komórek do dolnej komory, która zwykle zawiera pożywkę z chemoatraktantem12,13. Chociaż modele te są szeroko stosowane do analizy transmigracji leukocytów, na ogół nie zawierają warstwy reprezentującej błonę wewnętrzną, co powoduje migrację transmigrujących komórek do roztworu i nie pozwala na pomiar tworzenia się komórek piankowatych lub odwrotnej transmigracji tych samych komórek. I odwrotnie, modele tworzenia komórek piankowatych nie uwzględniają żadnych zmian w monocytach wywołanych przez transmigrację ani efektów aktywacji śródbłonka, o której wiadomo, że przyczynia się do tworzenia komórek piankowatych14. Ponadto systemy te indukują tworzenie komórek piankowych z makrofagów przylegających do płytek hodowli komórkowych poprzez dodanie nasyconych stężeń egzogennej utlenionej lipoproteiny o niskiej gęstości (oxLDL)15,16, kluczowy induktor tworzenia komórek piankowych. LDL stosowany w tych modelach jest często utleniany przez procesy nieistotne fizjologicznie, takie jak leczenie CuSO417, co kwestionuje fizjologiczne znaczenie badań z wykorzystaniem tych modeli.

Tutaj opisujemy test, który określa ilościowo transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowych tych samych komórek, co nie wymaga dodawania egzogennego oxLDL, co pozwala lepiej modelować rolę monocytów w tworzeniu komórek piankowych. Model ten został pierwotnie opracowany przez profesora Williama Mullera (Northwestern University, Chicago)18 i został udoskonalony w naszym laboratorium, aby ocenić ex vivo atherogeniczność monocytów wyizolowanych w warunkach nieaktywujących od osób z podstawowymi stanami zapalnymi towarzyszącymi chorobom, takim jak zakażenie wirusem HIV19 oraz starzenie się20, które wiążą się ze zwiększonym ryzykiem miażdżycy. Model ten stanowi również platformę do odpowiedzi na podstawowe pytania biologiczne dotyczące skłonności różnych podzbiorów monocytów do tworzenia komórek piankowych20, wpływu aktywacji śródbłonka przez cytokiny, takie jak TNF, na tworzenie komórek piankowatych14, oraz właściwości migracyjnych monocytów, takich jak głębokość i szybkość transmigracji w żelach19. Co więcej, transmigrację monocytów i tworzenie komórek piankowatych można określić ilościowo za pomocą standardowej mikroskopii, obrazowania żywych komórek, cytometrii przepływowej i obrazowej cytometrii przepływowej, zapewniając w ten sposób wszechstronną metodę oceny roli monocytów w miażdżycy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem ludzkich próbek biologicznych zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu Etyki Badań nad Ludźmi Szpitala Alfred w Melbourne. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w komorach z laminarnym przepływem powietrza klasy II, chyba że zaznaczono inaczej. Określenie „podgrzany” odnosi się do odczynników ogrzanych do 37 °C w kąpieli wodnej.

1. Przygotowanie włóknistych żeli kolagenowych typu I: dzień 1

  1. Przygotować spolimeryzowane żele kolagenowe, dodając sekwencyjnie i mieszając 35,7 mM NaOH, 0,71 x M19, 4,58 mM kwasu octowego oraz 1,71 mg/mL włóknistego kolagenu typu I do 5 mL polistyrenowej probówki zgodnie z Tabelą 1.
    UWAGA: Aby zapobiec tworzeniu się „kieszeni” kolagenowych w mieszaninie żelu, należy upewnić się, że kolagen jest dobrze wymieszany, delikatnie pipetując go w górę i w dół 5 razy. Przygotować od 4 do 6 żeli na warunek testowy do mikroskopii lub 15 żeli na warunek testowy do cytometrii przepływowej.
  2. Po dokładnym wymieszaniu, nanieść po 50 µL mieszaniny żelu kolagenowego do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki hodowlanej z płaskim dnem. Nie należy używać zewnętrznych rzędów i kolumn; należy wypełnić je 200 µL 1x buforem fosforanowym Dubecco (PBS), aby chronić żele przed wysychaniem. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2 h, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
    Uwaga: Płytki należy umieścić bezpośrednio na czystych metalowych statywach w inkubatorze, aby zapewnić równomierny rozkład ciepła.
  3. Po inkubacji przykryć żele 150 µL 1x suplementowanym M19 (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 5 dni do momentu użycia.

2. Namnażanie przechowywanych komórek HUVEC: Dzień 1

  1. Oznakuj i pokryj szalkę Petriego o średnicy 10 cm 1 ml 50 µg/mL fibronektynę rozcieńczoną w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  2. Rozmrozić alikwoty kriozachowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC, 1,0 x 106 komórek) w 10 mL M20.
    UWAGA: Komórki HUVEC należy przygotować zgodnie z wcześniejszym opisem21 i użytych przy niskiej liczbie pasaży (< fragment 4). W tym miejscu komórki HUVEC można zastąpić ludzkimi komórkami śródbłonka tętnicy wieńcowej.
  3. Resuspender komórki HUVEC w 10 ml pożywki M20 i przenieść do naczynia pokrytego fibronektyną, odsysając nadmiar fibronektyny przed dodaniem komórek; hodować do uzyskania konfluencji (około 5 dni), wymieniając pożywkę w 3. dniu.

3. Hodowla monowarstwy HUVEC na żelach kolagenowych: Dzień 5

  1. W 5. dniu odseparuj komórki HUVEC poprzez odessanie supernatantu hodowli z szalki Petriego i wypłukanie pożywki zawierającej surowicę przy użyciu 10 mL bezsurowiczego medium M19.
  2. Dodaj do komórek HUVEC 5 mL 0,05% trypsyny/0,53 EDTA w M19 i inkubuj przez 1-2 min w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając aż do odklejenia się komórek.
  3. Po odklejeniu komórek szybko opłucz szalkę Petriego 5 mL medium M20 i przenieś pożywkę z komórkami do probówki o pojemności 10 mL.
  4. Odwiruj próbki przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odessij supernatant, resuspenduj komórki w 20 µL medium M20 i policz komórki przy użyciu hemocytometru.
  5. Resuspenduj komórki do stężenia 2,0 x 105 komórek/mL w M20, odessij medium M19 z żelów z płytki 96-dołkowej (krok 1.3) i dodaj 10 µL resuspendowanych komórek HUVEC (2,0 x 104 komórek) do każdego z przygotowanych powyżej żelów kolagenowych (krok 1.2). Hoduj płytki przez kolejne 3 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2.
    UWAGA: Integralność monowarstwy HUVEC można potwierdzić po 3 dniach za pomocą barwienia azotynem srebra2 lub immunohistochemii w kierunku białek połączeń ścisłych23 na tym etapie. W tym celu należy przygotować dodatkowe żele.

4. Aktywacja monowarstwy HUVEC oraz izolacja/aktywacja monocytów do transmigracji: dzień 8

  1. W 8. dniu, przed dodaniem monocytów, aktywuj każdą monowarstwę HUVEC poprzez odessanie pożywki M20 znajdującej się nad żelami i dodanie 100 µL 10 ng/mL ludzkiego TNFα w medium M20 na żel. Inkubować w 37 °C/5% CO2 przez 4 h.
    UWAGA: W razie potrzeby jako kontrole można również uwzględnić warunki dla nieaktywowanych komórek HUVEC.
  2. Podczas 4-godzinnego etapu aktywacji HUVEC, wyizoluj monocyty z PBMC, wykorzystując techniki z użyciem kulek magnetycznych w celu negatywnej selekcji komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Minimum 6,5 x 106 Na tym etapie należy użyć PBMC, aby niezawodnie odzyskać 3,0 x 105 monocyty wymagane dla jednej grupy badawczej, ponieważ monocyty stanowią zazwyczaj około 10–15% PBMC.
    UWAGA: Aby ocenić wpływ aktywacji monocytów przed ich transmigracją i tworzeniem się komórek piankowatych, monocyty można aktywować na tym etapie. W razie potrzeby monocyty można wyizolować z rozmrożonych PBMC (tj., przechowywane próbki pacjentów). Subpopulacje monocytów wyizolowane za pomocą sortowania FACS można przygotować do dodania do żeli (Rysunek 1).

5. Transmigracja pierwotnych ludzkich monocytów: dzień 8

  1. Aby zmierzyć transmigrację monocytów, należy usunąć pożywkę zawierającą TNFα i dwukrotnie przemyć żele za pomocą 100 µL M19 poprzez dodawanie i usuwanie pożywki. Po przemyciu dodać 2,0 x 105 świeżo wyizolowane lub rozmrożone i wypłukane krioanalogowe PBMC lub 5,0 x 104 świeżo wyizolowane monocyty lub oczyszczone subpopulacje monocytów do monowarstw HUVEC w 100 µL M20. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 aby umożliwić migrację monocytów do przodu w głąb żelu. Zaleca się przeznaczenie 6 dołków dla każdego badanego warunku eksperymentalnego.
    UWAGA: Aby ocenić wpływ serum autologicznego na transmigrację i tworzenie komórek piankowatych, należy inkubować komórki w medium M20 zawierającym odpowiednie stężenie inaktywowanej termicznie surowicy dawcy i porównać wyniki z warunkami z zastosowaniem kontroli w postaci puli surowic ludzkich. Na tym etapie można dodać leukocyty inne niż monocyty. W przypadku badania wpływu konkretnych lipidów/gatunków lipidów (np., HDL, oxHDL), wszystkie poniższe kroki należy przeprowadzić w pożywce bezsurowiczej zawierającej 20-50 µg/mL lipidy
  2. Po 1 h transmigracji w kierunku w przód, należy zebrać komórki, które nie przeszły przez żele, płucząc je dwukrotnie za pomocą 100 µL podgrzanego do odpowiedniej temperatury 1 mM EGTA w 1x PBS, a następnie raz z 100 µL M19 (te same warunki wirowania), łącząc nadsączyny z każdej studni w obrębie tego samego warunku eksperymentalnego (zazwyczaj 6 studni) w probówce do mikrocentrifugowania o pojemności 1,5 ml na lodzie. Wirować komórki, które nie migrowały, przy 4 °C, 300 x g przez 5 min i resuspendować w 30 µL 1x PBS.
  3. Należy policzyć komórki zebrane w supernatancie, aby określić liczbę komórek, które przeszły przez transmigrację w kierunku przednim.
  4. Procent komórek, które przemiegr {t}) w przód, określa się w następujący sposób:
    Wzór obliczeniowy dla migracji komórek w badaniach naukowych: całkowita liczba dodanych komórek, komórki zmigrowane. Równanie migracji komórek, obliczanie procentowego udziału komórek, które nie migrowały, schemat formuły do badań. Równanie transmigracji: 100% - komórki nietransmigrujące (%) = transmigracja w przód (%).
  5. Przykryj wypłukane żele zawierające przetransmigrowane komórki za pomocą 100 µL M20 i inkubować przez kolejne 48 h.
  6. Po 48 h należy zebrać nadsącz i dwukrotnie wypłukać komórki, które nie przeszły przez membranę, za pomocą 100 µL podgrzany do odpowiedniej temperatury roztwór 1 mM EGTA/PBS, zbierając i łącząc nadsącz z każdego wariantu zgodnie z opisem w kroku 5.2.
    UWAGA: Fenotyp komórek po odwrotnej transmigracji można badać przy użyciu standardowych protokołów barwienia do cytometrii przepływowej.
  7. Wirować komórki przy 4 °C, 30 x g przez 5 min, a następnie resuspender komórki w 30 µL 1x PBS. Należy policzyć komórki i określić ich żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
  8. Oblicz procent komórek poddanych transmigracji wstecznej, korzystając z następującego równania:
    Równanie odwrotnej transmigracji; stosunek komórek w transmigracji odwrotnej do komórek w transmigracji w przód w badaniu migracji komórek.
    UWAGA: Uwzględnienie całkowitej liczby komórek poddanych transmigracji w kierunku przednim daje dokładniejszy obraz transmigracji wstecznej, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby transmigracja w kierunku przednim wyniosła 10%.
  9. W celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej utrwalono żele poprzez dodanie 100 µL 2% formaldehydu (stężenie końcowe) do każdej studzienki, przykryć płytki folią aluminiową i przechowywać w 4 °C do momentu analizy. W przypadku cytometrii przepływowej nie należy utrwalać komórek na tym etapie. Szczegóły znajdują się w poniższych protokołach dla analizy mikroskopowej (sekcja 6) lub cytometrii przepływowej (sekcja 7).
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i żrący; należy stosować środki ochrony indywidualnej (ŚOI). Należy zachować ostrożność podczas dodawania formaldehydu, jednak ze względu na niskie użyte stężenie ten etap nie musi być wykonywany w dygestorium.

6. Ilościowe oznaczenie komórek piankowatych i makrofagów metodą mikroskopową (barwienie Oil-Red O)

  1. Usunąć formaldehyd i przemyć żele 10 µL 50% (v/v) metanolu przez 5 min, a następnie 10 µL 78% (v/v) metanolu przez 15 min.
    UWAGA: Etapy barwienia można przeprowadzać na blacie laboratoryjnym, niekoniecznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  2. Przeprowadzić barwienie kropelek lipidowych, dodając 10 µL świeżo przygotowanego 0,2% (w/v) roztworu Oil-Red O (szczegóły w Tabeli Materiałów) na 1 h w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć nadmiar barwnika, przemywając żele 4 razy 10 µL 78% (v/v) metanolu, odsysając i odrzucając nadsącz po każdym przemyciu.
  4. Przeprowadzić przeciwbarwienie przez 15 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 10 µL barwnika Giemsy, rozcieńczonego 1:10 w wodzie destylowanej.
  5. Odsysać barwnik Giemsy i przemyć żele raz wodą.
  6. Aby oddzielić żele od płytki, należy delikatnie oddzielić brzegi dołków od żelu, przesuwając igłę 21 G z rymielem skierowanym na zewnątrz wzdłuż krawędzi żelu.
  7. Aby przymocować żele do szkiełka przedmiotowego, należy wykonać dwa otwory (średnicy 6,35 mm) w pasku dwustronnej taśmy klejącej o wymiarach 2,54 cm x 1,5 cm. Przymocować taśmę do standardowego szkiełka przedmiotowego i usunąć warstwę ochronną z góry.
    1. Do otworów w taśmie dodać kroplę wody za pomocą pipety transferowej. Używając pęsety, delikatnie przenieść żele do otworów w taśmie i przykryć szkiełkiem nakrywką o rozmiarze 1,5. Delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkę, aby przylegało do taśmy.
  8. Analizować za pomocą mikroskopii w ciemnym polu z kontrastem interferencyjnym (DIC), wykorzystując obiektyw 40X w mikroskopie odwróconym.
    1. Ustawić ostrość na monowarstwę HUVEC przy powiększeniu 40X i przesuwać ognisko w głąb żelu, licząc makrofagi/komórki piankowate w całej jego głębokości. Powtórzyć procedurę dla trzech oddzielnych pól widzenia znajdujących się w podobnej odległości od krawędzi żelu, aby zminimalizować ewentualny efekt brzeżny. Zapewni to spójność głębokości żelu pomiędzy obszarami liczenia.
      UWAGA: Komórki w żelu należy zakwalifikować jako komórki piankowate (zdefiniowane jako komórki, w których >1/3 cytoplazmy stanowią zabarwione Oil-Red O kropelki lipidowe) lub makrofagi w ciągu 2 h od przymocowania do szkiełek (Rysunek 2). Tworzenie komórek piankowatych wyrażane jest jako procent komórek piankowatych w stosunku do całkowitej liczby komórek zmigrowanych i podaje się jako medianę liczb z 3 pól widzenia zbadanych dla 6 żeli na warunek, co daje medianę z 18 pomiarów na warunek. Przykład surowych liczb komórek z typowego eksperymentu przedstawiono w Tabeli 2.
      UWAGA: Klasyfikacja komórki jako komórki piankowatej lub makrofaga za pomocą mikroskopii jest subiektywna i w konsekwencji może zależeć od badacza. W badaniach klinicznych, gdzie eksperymenty są prowadzone przez dłuższy czas, ważne jest, aby całe liczenie było wykonywane w sposób zaślepiony przez jednego badacza. Przykłady komórek piankowatych i makrofagów w żelach przedstawiono na Rysunku 2.

7. Analiza przetransportowanych komórek metodą cytometrii przepływowej

  1. Aby scharakteryzować fenotypowo komórki piankowate oraz makrofagi po migracji transendotelialnej, należy przetrawić żele, dodając 100 µL z 37 °C podgrzaną wcześniej kolagenazę D o stężeniu 1 mg/mL rozcieńczoną w medium M199 do każdej studzienki i inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C/5% CO2.
    UWAGA: Płytki 96-dołkowe należy umieścić bezpośrednio na czystych metalowych regałach w inkubatorze, aby zapewnić równomierny rozkład ciepła.
  2. Po inkubacji rozdrobnij żele za pomocą 200 µL końcówką pipety i inkubować przez kolejne 20 min w 37 °C/5% CO2.
  3. Po pełnym strawieniu przefiltrować i połączyć zawartości strawionych żeli z powtórzeń przez 35 µm probówki do FACS z zakrętkami z nylonowej siatki umieszczone na lodzie, a następnie jednokrotne przemycie buforem do FACS (patrz Tabela materiałów) w 4 °C, 30 x g. Resuspendować komórki w 100 µL płukania FACS.
  4. Incubować otrzymane komórki z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami swoistymi dla CD45, markerem żywotności komórek (live/dead) oraz wybranymi powierzchniowymi lub wewnątrzkomórkowymi markerami fenotypowymi lub funkcjonalnymi, zgodnie ze standardowymi protokołami cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Należy przygotować probówki kontrolne do kompensacji, używając odpowiednich fluoroforów oraz kulek kompensacyjnych Ig. Wyekstrahowane komórki można również nanieść na szkiełka przedmiotowe do mikroskopii immunofluorescencyjnej za pomocą wirówki cytologicznej. Alternatywnie, stosując niniejszy protokół, z powodzeniem pobraliśmy komórki do oceny za pomocą obrazowej cytometrii przepłyewej.
  5. Należy przeprowadzić akwizycję komórek za pomocą cytometru przepływowego i w razie potrzeby wykonać kompensację.
    UWAGA: Ponieważ komórki piankowate/makrofagi mogą nie tworzyć oddzielnych populacji na podstawie właściwości rozpraszania światła i mogą znacznie różnić się rozmiarem oraz kształtem, należy ustawić szerokie bramki rozpraszania przedniego (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), aby objąć wszystkie zmigrowane komórki, zgodnie z przedstawionym w Rycina 3A.
  6. Po akwizycji należy przeprowadzić analizę danych przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej. Aby zidentyfikować komórki zmigrowane, w pierwszej kolejności należy wybrać komórki wykazujące brak ekspresji markera żywe/martwe, jak pokazano w Rycina 3BNastępnie przeprowadź dyskryminację pojedynczych komórek, tworząc wąską bramkę wokół komórek widocznych na wykresie SSC-area vs SSC-height.
  7. Wybierz CD45+ komórki i wyznaczyć bramkę dla głównej populacji zmigrowanych komórek widocznej na wykresie FSC/SSC, ponieważ są to makrofagi/komórki piankowate.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ilościowe określanie transmigracji monocytów

Monocyty dodaje się do modelu zgodnie z opisem na Rysunku 1, przygotowując sześć żeli dla każdego wariantu. Monocyty dla 6 żeli na jednego dawcę (t.j. 5,0 x 104 monocytów na żel; 6 żeli = 3,0 x 105 monocytów na dawcę) resuspenduje się do końcowej objętości 60 µL medium M199 zawierającego wymagane serum/izolo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół oferuje wszechstronną i fizjologicznie istotną metodę oceny miażdżycowości monocytów z ludzkich kohort klinicznych, łącząc zarówno transmigrację monocytów, jak i tworzenie komórek piankowatych. Model ten ma przewagę nad alternatywnymi metodami tworzenia komórek piankowatych, ponieważ uwzględnia wpływ transmigracji monocytów na tworzenie komórek piankowatych i umożliwia pomiar transmigracji odwrotnej6 oprócz wrodzonej skłonności monocytów do dojrzewania do komórek piankowatyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy wyrażają wdzięczność za pracę prof. Williama Mullera i dr Clare Westhorpe za ich kluczową rolę w rozwoju wcześniejszych wersji tego modelu. Autorzy chcieliby również podziękować rdzeniowi AMREP Flow Cytometry za sortowanie podzbiorów monocytów oraz pielęgniarkom z Oddziału Chorób Zakaźnych Alfred Hospital za rekrutację osób z HIV+ do niektórych badań. Autorzy wyrażają wdzięczność za wkład w tę pracę Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Wiktorii, który otrzymał Instytut Burneta. TAA jest wspierana przez stypendium podoktorskie rektora Uniwersytetu RMIT. Prace te były wspierane przez grant projektu NHMRC 1108792 przyznany AJ i AH. TK jest wspierany przez granty NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żelowe odczynniki przygotowawcze
NaOHSigma-Aldrich221465-500G0,1 M NaOH rozcieńczone w H20
10x M199Sigma-AldrichM0650
AcCOOHSigma-Aldrich695092-100ML20 mM Kwas octowy rozcieńczony w H20
Cultrex Kolagen bydlęcy IR& D Systems3442-050-01Typ I Kolagen włóknisty
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Cell culture
M199Life Technologies11150-059Pożywka M199 zawierająca sole Earle'a, L-glutaminę i 2,2 g/l wodorowęglanu sodu.
Pożywki uzupełnione o 100 &mikro; g/ml L-glutaminy  i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny 
M20Uzupełniony M199 zawierający 20% inaktywowanej termicznie surowicy zbiorczej lub dawcy.
Do M199 można dodać poszczególne gatunki lipidów, takie jak LDL.
HUVECPierwotne ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVEC) można wyizolować z pępowiny pobranej za świadomą zgodą i aprobatą etyczną. Izolowany HUVEC można również kupić komercyjnie.
śródbłonka tętnicy wieńcowejPierwotne ludzkie komórki śródbłonka tętnic wieńcowych można wyizolować z tętnic oddanych za świadomą zgodą i aprobatą etyczną. Wyizolowane komórki można również kupić komercyjnie.
EDTABDH Merck10093.5VKwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0
EGTASigma-AldrichE3889-500GKwas glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego)-N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA) - 1 mM, pH 8,0
0,05% trypsyna EDTAGibco25300-0540,05% trypsyna/0,53 EDTA (1X)
L-glutaminaGibco25030-081L-glutamina (200 mM)
Penicylina/streptomycyna Gibco15140-122Penicylina/streptomycyna (10 000 jednostek/ml Penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml Streptomycyna)
Surowica cielęca noworodkaGibco16010-142Surowica cielęca noworodka: Pochodzenie nowozelandzkie
FibronektynaSigma-AldrichF1056-1MGFibronektyna - 50 &mikro; g / ml podwielokrotności przygotowane i przechowywane
PBS (1x)Gibco14200-075Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (10x): Rozcieńczyć do 1x sterylnym H20
0,1% TNFGibcoPHC3015Rekombinowany ludzki TNF - Rozpuszczony w H20 i przechowywany w 10 &mikro; g / ml podwielokrotności
Lipoprotein o niskiej gęstościMerck MilliporeLP2-2MGLipoprotein o niskiej gęstości (LDL)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Mikroskopia
1 lub 2% formaldehyduPolysciences40181 lub 2% formaldehyd rozcieńczony sterylnym H20
50% i 78% metanolemAjax Finechem318-2,5L GL50% lub 78% v/v metanol, rozcieńczony olejem H20
Czerwona plama OSigma-AldrichO0625-25GRozcieńczony do 2 mg/ml w 22% 1M NaOH i 78% (v/v) metanolu
Szkiełka mikroskopoweMikro-GlassS41104AMKPodwójne, matowe, szlifowane pod kątem 45 stopni szkiełka mikroskopowe (25 X 76 mm)Szkiełka
nakrywkoweMenzel-Glä serMENCS224015GP22 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe szklane w rozmiarze #1,5
Taśma dwustronna3M Scotch4011Super wytrzymała zewnętrzna taśma montażowa (25,4 mm x 1,51 m)
Bejca GiemsaMerck Millipore1.09204.0500Roztwór błękitu metylenowego azur eozyny Giemsy (rozcieńczony materiał 1:10 w H20)
DziurkaczRęczny dziurkacz jednootworowy (dziurkacz 6,35 mm)
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Cytometria przepływowa
Collagenase DRoche Diagnostics11088858001Kolagenaza D rozcieńczona w pożywce M199 do 1 mg/ml 
35 &mikro; m rurki polistyrenowe FACS z siatką nylonową BDBiosciences35223535 i mikro; m rurki polistyrenowe FACS z siatką nylonową
Żywe/martwe Naprawialne żółte barwniki z martwych komórekLife TechnologiesL34959Żywe/martwe Naprawialna żółta plama z martwych komórek
MyciePrzygotować przez zmieszanie 1 X PBS-, 2 mM EDTA i 1% surowicy dla cieląt noworodków
NazwaFirma<silny>Numer katalogowy Komentarze
>Plasticware
96 dołkowa płytkaNunclon167008Powierzchnia Delta płaskodenna 96-dołkowa płytka
10 cm Szalka PetriegoTPP93100Sterylna 10
cm szalka Petriego 1,5 ml Probówki Eppendorfa Eppendorf0030 125.150Probówki Eppendorfa
Przenosić pipetaSamco Scientific222-20SSterylna pipeta transferowa (1 mL, duża bańka)
Ludzkie komórki FACS

Bibliografia

  1. Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
  3. Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
  4. Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038(2016).
  5. Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
  6. Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
  7. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  8. Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
  9. Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
  10. Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
  11. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  12. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  13. Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  14. Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
  15. Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
  16. Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
  17. Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
  18. Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
  19. Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
  20. Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
  21. Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
  22. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
  23. Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
  24. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
  25. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  26. Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
  27. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie kom rki r db onkamacierz kolagenowacytometria przep ywowaanaliza mikroskopowautlenione LDLpr bki krwi pacjent wpotencja aterogennyprzygotowanie elu kolagenowego
Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.