Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

4,4′-Isopropylidenediphenol, powszechnie określany jako Bisphenol-A lub BPA, jest dodatkiem przeciwutleniającym występującym w szerokiej gamie produktów na bazie poliwęglanu i żywicy epoksydowej, począwszy od papieru termicznego, płyt CD i nietłukącego szkła, a skończywszy na wewnętrznej powłoce puszek po napojach. Chociaż wiadomo, że BPA jest środkiem zaburzającym gospodarkę hormonalną, który naśladuje estrogen¹, badania nad jego szkodliwymi skutkami wynikającymi z codziennego, przypadkowego narażenia na BPA pojawiły się głównie w ciągu ostatnich 10-15 lat. Konsekwencje nawet niskiego poziomu ekspozycji na BPA są najgłębsze we wczesnych okresach rozwojowych, w tym podczas embriogenezy poprzez ekspozycję matek^2,3. Narażenie żeńskich zarodków w okresie życia płodowego na działanie substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego wiąże się również ze zwiększoną podatnością na choroby od raka pochwy do raka piersi^4,5. Badania na zwierzętach wykazały, że narażenie na BPA prowadzi do nietypowej struktury mózgu i nieprawidłowości funkcjonalnych objawiających się w zachowaniu⁶. W związku z tym stosowanie BPA w butelkach do karmienia niemowląt zostało zakazane przez większość agencji regulacyjnych w Europie i Ameryce Północnej, w tym FDA. Aby zachować zgodność z przepisami, wielu producentów przestawiło się na 4,4'-sulfonylodifenol lub bisfenol-S (BPS). Biorąc pod uwagę fakt, że BPA i BPS są analogami strukturalnymi i że ostatnie doniesienia wykazały porównywalną siłę działania BPS w transkrypcji estrogenowej⁷, ważne jest zbadanie toksyczności tego związku w stosunku do BPA.

Tutaj opisujemy protokół do testowania wpływu BPA (i innych EDC) na sieci neuronów za pomocą modelu kręgowców, zarodka pisklęcia. Hodowle neuronów in vitro tworzą kontakty synaptyczne i generują potencjały czynnościowe (zwane również kolcami). Aktywność impulsową tych kultur można rejestrować za pomocą systemów wieloelektrodowych (MEA). Uważa się, że skoki są zsynchronizowane, gdy występują w odstępie 5 ms. Początkowa losowa aktywność impulsowa, która ostatecznie się synchronizuje, jest kluczową cechą rozwijających się sieci neuronowych^8,9. Synchronizacja może być mierzona przy użyciu różnych metod, a kilka algorytmów opisano w literaturze^9,10,11. W naszych analizach korzystamy z algorytmu opracowanego przez Paivę i współpracowników¹², który jest zintegrowany z oprogramowaniem rejestrującym, które steruje systemem akwizycji MEA. Silna aktywność impulsowa embrionalnych neuronów piskląt stanowi prototyp do badania wpływu BPA na aktywność sieci neuronowych¹³. Używając układów wieloelektrodowych do rejestrowania aktywności impulsowej, zaobserwowaliśmy, że ekspozycja na BPA hamuje rozwój synchronizacji impulsów neuronalnych^9,14. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię badania ekspozycji na BPA na neurony zarodków piskląt w hodowli wraz z reprezentatywnymi wynikami dotyczącymi rozwoju synchronizacji impulsów neuronalnych w kulturach zarodkowych piskląt.

Poniższy protokół został ustandaryzowany do testowania efektów ekspozycji na BPA podczas (wczesnej) embriogenezy i może być zmodyfikowany do użycia z BPS, BPF lub innym EDC w neuronach embrionalnych piskląt.

Ten protokół jest zgodny z polityką instytucjonalną Uniwersytetu Stanowego Delaware oraz polityką NIH dotyczącą ptasich embrionów. Protokół jest również zgodny z wytycznymi DSU dotyczącymi bezpieczeństwa materiałowego i chemicznego.

1. Ustawienia materiału

1. Rozpuść BPA (m.w. 228.29) w 10% etanolu (v/v) w wodzie, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy (0,23 mg na ml 10% etanolu). Wykonać kolejne rozcieńczenia (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM i 10 μM) w podłożu neuropodstawowym.
   Uwaga: BPA jest toksyną środowiskową i należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z proszkiem.
2. Inkubować jaja piskląt w dostępnym w handlu inkubatorze stołowym w temperaturze 37 °C. Inkubować jaja przez 7 dni w przypadku zarodków E7.
3. Przygotuj MEA. Wysterylizuj wymaganą liczbę MEA, mocząc w 70% etanolu przez 3 do 4 godzin, a następnie spłucz trzykrotnie w około 10 ml sterylnej wody destylowanej w okapie BSLII.
   UWAGA: MEA zawierają 64 nanoporowate elektrody platynowe ułożone w siatkę 8 x 8. Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odstęp między elektrodami wynosi 200 μm. Nie używaj denaturowanego etanolu do sterylizacji MEA, ponieważ doprowadzi to do korozji MEA.
4. Umieść MEA w sterylnym pojemniku z pokrywką (w celu utrzymania sterylnych warunków) i przenieś do inkubatora stołowego. Piecz przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 55 °C. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej sterylizacji, a temperatura nie powinna przekraczać 60 °C. Zachowując sterylność, należy przenieść naczynie zawierające MEA do okapu BSLII w celu przechowywania do dalszego użycia.
   UWAGA: Używamy szklanego naczynia do pieczenia nadającego się do pieczenia w piekarniku z plastikową pokrywką i sterylizujemy je powierzchniowo 70% etanolem i umieszczamy w okapie BSLII do wysuszenia.
5. Podzielić roztwór ECM macierzy pozakomórkowej. Rozmrozić fiolkę w temperaturze 4 °C przez noc i zamrozić 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: ECM jest dostarczany w stanie zamrożonym. ECM nie powinien być doprowadzany do temperatury pokojowej, dopóki nie będzie gotowy do powlekania, ponieważ polimeryzuje w temperaturze pokojowej, a po polimeryzacji nie jest możliwe powlekanie. ECM bez czynników wzrostu jest preferowany, aby zapobiec dodatkowym skutkom spowodowanym nieznanymi czynnikami.
6. Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne (kleszcze Dumont #5, kleszcze zakrzywione, małe nożyczki i nożyczki sprężynowe) oraz naczynia preparacyjne pokryte materiałem samouszczelniającym się 70% etanolem i pozwól im wyschnąć w okapie preparacyjnym
.

2. Hodowla neuronów embrionalnych piskląt i aktywność sieci

1. W dniu powlekania wyjąć fiolkę ECM z zamrażarki w temperaturze -20 °C, spryskać 70% etanolem i umieścić na lodzie. Rozcieńczyć do 25%, dodając 300 μl zimnego podłoża neurobazalnego do okapu BSLII.
2. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl 25% ECM do środka MEA, uważając, aby nie dotknąć elektrod i natychmiast usuń, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj MEA i umieść w inkubatorze CO₂ (37 ° C i 5% CO_{2 ),} aż będzie gotowy do płytki neuronów.
3. Wysterylizować zewnętrzną skorupę jaja E7 (7. dzień zarodkowy, inkubowany w temperaturze 37 °C przez 7 dni) 70% etanolem. Odetnij zarodek do dolnego naczynia preparacyjnego Sylgarda zawierającego zimny sterylny roztwór zrównoważonych soli Hanka (HBSS) bez wapnia. Wytnij wokół oczu i usuń gałki oczne. Za pomocą cienkich kleszczyków DuMont #5 i nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie po stronie brzusznej i usuń zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę pial. Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki o wielkości około 2 mm za pomocą nożyczek sprężynowych.
   UWAGA: Po usunięciu błony mózgowia nie powinny być przyczepione żadne naczynia krwionośne. Jeśli to możliwe, lepiej jest przeprowadzić sekcję w sterylnym kapturze preparacyjnym, chociaż uzyskaliśmy dość dobre wyniki, gdy sekcja jest wykonywana poza kapturem, o ile narzędzia i obszar sekcji są dokładnie wysterylizowane 70% etanolem.
4. Za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia zbierz kawałki przodomózgowia do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej HBSS po pozostawieniu kawałków przodomózgowia na dno probówki wirówkowej.
5. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
6. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki i dodaj 1 ml pożywki neurobazalnej. Pozwól kawałkom tkanki opaść na dno i usuń podłoże. Powtórz to pranie jeszcze raz. Ten krok polega na zmyciu trypsyny/EDTA.
7. Dodaj 2 ml pożywki neuropodstawowej i zacznij trytuować. Tryturacja polega na pobraniu sterylnej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura i delikatnym przepuszczeniu przez nią tkanki kilka razy, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki. Jeśli po wielokrotnych przejściach pozostaną jakieś kawałki, po prostu pozostaw je do osiadania na dnie.
   UWAGA: Unikaj spieniania podczas rozcierania - jeśli utworzy się piana, zatrzymaj się i usuń przez aspirację.
8. Rozcieńczyć ponownie zawieszone komórki w stosunku 1:10 pożywką neurobazalną i policzyć żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. Zmieszać 50 μl rozcieńczonych komórek z 50 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl do hemekytometru po umieszczeniu na szkiełku nakrywkowym i policzyć jasne, przezroczyste komórki (niebieskie komórki są martwe i nie powinny być liczone).
   UWAGA: Typowa liczba komórek z pojedynczego czujnika optycznego E7 waha się od 1 do 5 x 10⁷ komórek/ml.
9. Płytkować zdysocjowane komórki na MEA pokrytych ECM o gęstości 2,200 komórek/mm kwadratowy. W przypadku naszego systemu MEA przekłada się to na około 130 000 komórek na MEA. Dodaj pożywkę neuropodstawną, aby zwiększyć objętość w MEA do 1 ml i umieść MEA w inkubatorze CO₂ na noc w celu przyłączenia komórek i przedłużenia neurytów (Rysunek 1).
   UWAGA: W przypadku MEA o różnych obszarach i liczbie elektrod można wypróbować różne gęstości komórek - ogólnie rzecz biorąc, wyższa gęstość komórek powoduje większą aktywność sieci, ale także prowadzi do krótszych hodowli.
10. Następnego dnia dodać BPA do końcowego stężenia 10 μM w podłożu neurobazalnym z 1 mM zapasu wykonanego w kroku 1.1 do MEA poddanego działaniu środka terapeutycznego. Do kontrolnego MEA dodać taką samą objętość 10% roztworu etanolu w wodzie (v/v).
11. Zastąp zużytą pożywkę pożywką neurobazalną zawierającą 10 μM BPA co drugi dzień przez 7 dni in vitro (7DIV), a następnie codziennie, wraz ze wzrostem aktywności sieci.
    UWAGA: Wraz ze wzrostem aktywności sieci wzrasta aktywność metaboliczna, a zmiany podłoża muszą być częstsze. Nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na pomarańczowy.

3. Rejestrowanie aktywności sieci neuronalnej

1. W dniu pozyskania należy wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę neurobazalną i umieścić MEA w inkubatorze CO₂ przez co najmniej 2 godziny przed rejestracją. Uruchom oprogramowanie rejestrujące i ustaw temperaturę MEA na 37 °C, klikając ikonę temperatury (rysunek uzupełniający 3.1a-b).
   UWAGA: Nagrywanie może rozpocząć się już w 3 dniu posiewu i może trwać tak długo, jak długo kultury są żywe.
2. Ustaw parametry akwizycji, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę "Muse" (w sekcji Strumienie w lewym panelu okna) i wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Detektor spajków", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Spike Detector (6 x STD)" pojawi się pod nazwą pliku (Rysunek uzupełniający 3.2a-b).
3. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Spike Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Burst Detector", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Burst Detector" (ISI) pojawi się pod ikoną Muse (Rysunek uzupełniający 3.3a-b).
4. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Burst Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Kompilator statystyk neuronowych". W wyskakującym okienku upewnij się, że wybrano Nagłówek pliku, Zagregowane statystyki studni i Synchronizacja. Kliknij OK. "Kompilator statystyk" pojawi się poniżej (Rysunek uzupełniający 3.4a-b).
   UWAGA: Spowoduje to ustawienie adaptacyjnego przekraczania progu (filtr 6x STD), interwał między spajkami na 100 ms z minimalną liczbą skoków na 5, wykrywanie średniej szybkości wypalania na 10 s z parametrem synchronicznym na 20 ms oraz minimalna szybkość skoków na 0,083333 skoków na minutę.
5. Ustaw zaplanowane nagrywanie na czas nagrywania 5 minut (300 000 ms), klikając ikonę zegara na dole. Osiąga się to poprzez zmianę informacji w sekcji ustawień, aby nagrywać co 5,1 minuty i nagrywać przez 5 minut. Zostanie to uruchomione natychmiast i zostanie wykonane jednorazowo (rysunek uzupełniający 3.5).
6. Upewnij się, że temperatura MEA osiągnęła 37 °C przed przemieszczeniem MEA. Wyjmij MEA z inkubatora, umieść go na jednostce rejestrującej i zablokuj MEA. Rozpocznij nagrywanie aktywności sieciowej, klikając przycisk rozpocznij nagrywanie w sekcji zaplanowanego nagrywania lub ikonę nagrywania w oknie "Odtwarzanie plików". Zazwyczaj czas nagrywania wynosi 5 minut (300 000 ms), chociaż można uzyskać dłuższe nagrania do 10 minut.
7. Po nagraniu włóż MEA z powrotem do inkubatora.
   UWAGA: Należy zachować ostrożność w celu utrzymania sterylności i zminimalizowania czasu przebywania MEA poza inkubatorem.

4. Analiza danych

1. Analiza surowych danych może odbywać się w trybie offline za pomocą oprogramowania do nagrywania. Kliknij menu rozwijane Plik i otwórz nagrywanie. Wybierz plik danych pierwotnych, który ma zostać przeanalizowany. Odtwórz ponownie surowe nagrania, aby uchwycić wymagane parametry pikowania.
2. Aby uzyskać średnią liczbę skoków, użyj modułu Detektor spajków, a aby uzyskać wskaźnik synchronizacji, użyj modułu Kompilator statystyk neuronowych.
3. Załaduj moduły Spike Detector, Burst Detector i Statistics Compiler jak poprzednio (Sekcja 3).
4. Z menu rozwijanych w oknach modułu Detektor szczytów, Detektor serii i Kompilator statystyk wybierz odpowiednio Lista wartości szczytowych, Lista serii sieci i Metryki zaawansowane.
5. Kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie pliku danych, który utworzy plik .csv w przekierowanym folderze. Parametry spajków - całkowita liczba skoków i indeks synchronizacji - zostaną zapisane w pliku .csv.
   UWAGA: Analiza w czasie rzeczywistym podczas rejestrowania surowych danych nie jest zalecana, ponieważ może to zużywać czas procesora i zasoby obliczeniowe.

Zbadaliśmy wpływ BPA na rozwój synchroniczny w hodowlach neuronalnych zarodków piskląt. Synchronizacja aktywności impulsowej jest wskaźnikiem prawidłowego rozwoju sieci neuronalnych in vitro. Gdy dwa skoki wystąpią w odległości 5 ms od siebie, uważa się je za synchroniczne. Hodowle neuronów in vitro początkowo wykazują losową aktywność impulsową - kolce występują losowo, a odstępy między kolcami wykazują normalny rozkład. W miarę dojrzewania kultur aktywność wyrastania staje się bardziej zsynchronizowana, a odstępy między kolcami są stałe. Synchroniczna aktywność impulsowa kultury została określona ilościowo za pomocą analizy korelacji krzyżowej czasów skoków przy użyciu oprogramowania rejestrującego12 w celu wyprowadzenia wskaźnika synchronizacji (SI). Odkryliśmy, że ekspozycja na BPA niekorzystnie wpływa na rozwój aktywności sieciowej poprzez zmniejszenie aktywności skokowej i wskaźnika synchronizacji (Rysunek 2a i 2b). Podsumowując, wykazaliśmy, że szkodliwy wpływ ekspozycji na BPA na zarodek wpływa na jego rozwój, w tym na funkcję neuronów, którą można ocenić poprzez synchroniczny rozwój neuronów piskląt w hodowli.

Rysunek 1: Schemat protokołu przedstawiający etapy od sekcji przodomózgowia piskląt do dysocjacji, posiewu i rejestrowania aktywności sieci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: (A) Średnia liczba kolców jest znacznie niższa w hodowlach przodomózgowia piskląt traktowanych BPA E7 w porównaniu do kultur kontrolnych. Średnia liczba skoków została wyodrębniona za pomocą oprogramowania do nagrywania. Średnie (kontrola, 14 890 ± 949,0, N = 15 i BPA, 5 624 ± 465,9, N = 22) były istotnie różne (niesparowany test t, p <0,0001). (B) Średni wskaźnik synchronizacji (SI) jest znacznie niższy w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. SI został wyodrębniony za pomocą modułu Neural Statistics Compiler w oprogramowaniu do nagrywania. Średnie SI (kontrola, 0,5159 ± 0,06547 N = 15 i BPA, 0,1140 ± 0,01840 N = 22) były istotnie różne (niesparowany test t, p <0,0001). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.