Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

DOI:

10.3791/56300

⸱

26 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Delaware State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie na toksyny środowiskowe może mieć dotkliwy wpływ na rozwijające się zarodki. Wiadomo, że substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną, takie jak bisfenole, niekorzystnie wpływają na układ nerwowy. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący model sieci neuronalnej kręgowców (zarodków piskląt) in vitro w celu zbadania funkcjonalnego wpływu ekspozycji na toksyny na wczesne zarodki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bis-fenole, takie jak bis-fenol A (BPA) i bis-fenol-S (BPS), są powszechnie stosowanymi środkami polimeryzującymi w produkcji tworzyw sztucznych i licznych produktów codziennego użytku. Zaliczane są do związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) o właściwościach podobnych do estradiolu. Długotrwałe narażenie na EDC, nawet w niskich dawkach, wiąże się z różnymi wadami zdrowotnymi, w tym rakiem, zaburzeniami zachowania i niepłodnością, z większą podatnością we wczesnych okresach rozwojowych. Aby zbadać wpływ BPA na rozwój funkcji neuronalnych, jako model wykorzystaliśmy sieć neuronalną in vitro pochodzącą z wczesnego mózgu embrionalnego piskląt. Odkryliśmy, że narażenie na BPA wpłynęło na rozwój aktywności sieciowej, w szczególności na wzrost aktywności i synchronizację. Zmiana aktywności sieci jest kluczowym ogniwem między celem molekularnym leku lub związku a jego wpływem na wynik behawioralny. Matryce wieloelektrodowe stają się coraz częściej użytecznymi narzędziami do badania wpływu leków na aktywność sieci in vitro. Na rynku dostępnych jest kilka systemów i chociaż istnieją różnice w liczbie elektrod, rodzaju i jakości matrycy elektrod oraz oprogramowania analitycznego, podstawowych zasadach i uzyskanych danych jest taka sama w różnych systemach. Chociaż obecnie ograniczają się do analizy dwuwymiarowych kultur in vitro, te systemy MEA są ulepszane, aby umożliwić aktywność sieci in vivo w wycinkach mózgu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ekspozycji embrionalnej oraz rejestrowania aktywności i synchronizacji sieci neuronalnej, wraz z reprezentatywnymi wynikami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4,4′-Isopropylidenediphenol, powszechnie określany jako Bisphenol-A lub BPA, jest dodatkiem przeciwutleniającym występującym w szerokiej gamie produktów na bazie poliwęglanu i żywicy epoksydowej, począwszy od papieru termicznego, płyt CD i nietłukącego szkła, a skończywszy na wewnętrznej powłoce puszek po napojach. Chociaż wiadomo, że BPA jest środkiem zaburzającym gospodarkę hormonalną, który naśladuje estrogen1, badania nad jego szkodliwymi skutkami wynikającymi z codziennego, przypadkowego narażenia na BPA pojawiły się głównie w ciągu ostatnich 10-15 lat. Konsekwencje nawet niskiego poziomu ekspozycji na BPA są najgłębsze we wczesnych okresach rozwojowych, w tym podczas embriogenezy poprzez ekspozycję matek2,3. Narażenie żeńskich zarodków w okresie życia płodowego na działanie substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego wiąże się również ze zwiększoną podatnością na choroby od raka pochwy do raka piersi4,5. Badania na zwierzętach wykazały, że narażenie na BPA prowadzi do nietypowej struktury mózgu i nieprawidłowości funkcjonalnych objawiających się w zachowaniu6. W związku z tym stosowanie BPA w butelkach do karmienia niemowląt zostało zakazane przez większość agencji regulacyjnych w Europie i Ameryce Północnej, w tym FDA. Aby zachować zgodność z przepisami, wielu producentów przestawiło się na 4,4'-sulfonylodifenol lub bisfenol-S (BPS). Biorąc pod uwagę fakt, że BPA i BPS są analogami strukturalnymi i że ostatnie doniesienia wykazały porównywalną siłę działania BPS w transkrypcji estrogenowej7, ważne jest zbadanie toksyczności tego związku w stosunku do BPA.

Tutaj opisujemy protokół do testowania wpływu BPA (i innych EDC) na sieci neuronów za pomocą modelu kręgowców, zarodka pisklęcia. Hodowle neuronów in vitro tworzą kontakty synaptyczne i generują potencjały czynnościowe (zwane również kolcami). Aktywność impulsową tych kultur można rejestrować za pomocą systemów wieloelektrodowych (MEA). Uważa się, że skoki są zsynchronizowane, gdy występują w odstępie 5 ms. Początkowa losowa aktywność impulsowa, która ostatecznie się synchronizuje, jest kluczową cechą rozwijających się sieci neuronowych8,9. Synchronizacja może być mierzona przy użyciu różnych metod, a kilka algorytmów opisano w literaturze9,10,11. W naszych analizach korzystamy z algorytmu opracowanego przez Paivę i współpracowników12, który jest zintegrowany z oprogramowaniem rejestrującym, które steruje systemem akwizycji MEA. Silna aktywność impulsowa embrionalnych neuronów piskląt stanowi prototyp do badania wpływu BPA na aktywność sieci neuronowych13. Używając układów wieloelektrodowych do rejestrowania aktywności impulsowej, zaobserwowaliśmy, że ekspozycja na BPA hamuje rozwój synchronizacji impulsów neuronalnych9,14. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię badania ekspozycji na BPA na neurony zarodków piskląt w hodowli wraz z reprezentatywnymi wynikami dotyczącymi rozwoju synchronizacji impulsów neuronalnych w kulturach zarodkowych piskląt.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół został ustandaryzowany do testowania efektów ekspozycji na BPA podczas (wczesnej) embriogenezy i może być zmodyfikowany do użycia z BPS, BPF lub innym EDC w neuronach embrionalnych piskląt.

Ten protokół jest zgodny z polityką instytucjonalną Uniwersytetu Stanowego Delaware oraz polityką NIH dotyczącą ptasich embrionów. Protokół jest również zgodny z wytycznymi DSU dotyczącymi bezpieczeństwa materiałowego i chemicznego.

1. Ustawienia materiału

  1. Rozpuść BPA (m.w. 228.29) w 10% etanolu (v/v) w wodzie, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy (0,23 mg na ml 10% etanolu). Wykonać kolejne rozcieńczenia (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM i 10 μM) w podłożu neuropodstawowym.
    Uwaga: BPA jest toksyną środowiskową i należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z proszkiem.
  2. Inkubować jaja piskląt w dostępnym w handlu inkubatorze stołowym w temperaturze 37 °C. Inkubować jaja przez 7 dni w przypadku zarodków E7.
  3. Przygotuj MEA. Wysterylizuj wymaganą liczbę MEA, mocząc w 70% etanolu przez 3 do 4 godzin, a następnie spłucz trzykrotnie w około 10 ml sterylnej wody destylowanej w okapie BSLII.
    UWAGA: MEA zawierają 64 nanoporowate elektrody platynowe ułożone w siatkę 8 x 8. Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odstęp między elektrodami wynosi 200 μm. Nie używaj denaturowanego etanolu do sterylizacji MEA, ponieważ doprowadzi to do korozji MEA.
  4. Umieść MEA w sterylnym pojemniku z pokrywką (w celu utrzymania sterylnych warunków) i przenieś do inkubatora stołowego. Piecz przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 55 °C. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej sterylizacji, a temperatura nie powinna przekraczać 60 °C. Zachowując sterylność, należy przenieść naczynie zawierające MEA do okapu BSLII w celu przechowywania do dalszego użycia.
    UWAGA: Używamy szklanego naczynia do pieczenia nadającego się do pieczenia w piekarniku z plastikową pokrywką i sterylizujemy je powierzchniowo 70% etanolem i umieszczamy w okapie BSLII do wysuszenia.
  5. Podzielić roztwór ECM macierzy pozakomórkowej. Rozmrozić fiolkę w temperaturze 4 °C przez noc i zamrozić 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: ECM jest dostarczany w stanie zamrożonym. ECM nie powinien być doprowadzany do temperatury pokojowej, dopóki nie będzie gotowy do powlekania, ponieważ polimeryzuje w temperaturze pokojowej, a po polimeryzacji nie jest możliwe powlekanie. ECM bez czynników wzrostu jest preferowany, aby zapobiec dodatkowym skutkom spowodowanym nieznanymi czynnikami.
  6. Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne (kleszcze Dumont #5, kleszcze zakrzywione, małe nożyczki i nożyczki sprężynowe) oraz naczynia preparacyjne pokryte materiałem samouszczelniającym się 70% etanolem i pozwól im wyschnąć w okapie preparacyjnym
    7. .

2. Hodowla neuronów embrionalnych piskląt i aktywność sieci

  1. W dniu powlekania wyjąć fiolkę ECM z zamrażarki w temperaturze -20 °C, spryskać 70% etanolem i umieścić na lodzie. Rozcieńczyć do 25%, dodając 300 μl zimnego podłoża neurobazalnego do okapu BSLII.
  2. Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl 25% ECM do środka MEA, uważając, aby nie dotknąć elektrod i natychmiast usuń, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj MEA i umieść w inkubatorze CO2 (37 ° C i 5% CO2 ), aż będzie gotowy do płytki neuronów.
  3. Wysterylizować zewnętrzną skorupę jaja E7 (7. dzień zarodkowy, inkubowany w temperaturze 37 °C przez 7 dni) 70% etanolem. Odetnij zarodek do dolnego naczynia preparacyjnego Sylgarda zawierającego zimny sterylny roztwór zrównoważonych soli Hanka (HBSS) bez wapnia. Wytnij wokół oczu i usuń gałki oczne. Za pomocą cienkich kleszczyków DuMont #5 i nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie po stronie brzusznej i usuń zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę pial. Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki o wielkości około 2 mm za pomocą nożyczek sprężynowych.
    UWAGA: Po usunięciu błony mózgowia nie powinny być przyczepione żadne naczynia krwionośne. Jeśli to możliwe, lepiej jest przeprowadzić sekcję w sterylnym kapturze preparacyjnym, chociaż uzyskaliśmy dość dobre wyniki, gdy sekcja jest wykonywana poza kapturem, o ile narzędzia i obszar sekcji są dokładnie wysterylizowane 70% etanolem.
  4. Za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia zbierz kawałki przodomózgowia do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej HBSS po pozostawieniu kawałków przodomózgowia na dno probówki wirówkowej.
  5. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki i dodaj 1 ml pożywki neurobazalnej. Pozwól kawałkom tkanki opaść na dno i usuń podłoże. Powtórz to pranie jeszcze raz. Ten krok polega na zmyciu trypsyny/EDTA.
  7. Dodaj 2 ml pożywki neuropodstawowej i zacznij trytuować. Tryturacja polega na pobraniu sterylnej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura i delikatnym przepuszczeniu przez nią tkanki kilka razy, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki. Jeśli po wielokrotnych przejściach pozostaną jakieś kawałki, po prostu pozostaw je do osiadania na dnie.
    UWAGA: Unikaj spieniania podczas rozcierania - jeśli utworzy się piana, zatrzymaj się i usuń przez aspirację.
  8. Rozcieńczyć ponownie zawieszone komórki w stosunku 1:10 pożywką neurobazalną i policzyć żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. Zmieszać 50 μl rozcieńczonych komórek z 50 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl do hemekytometru po umieszczeniu na szkiełku nakrywkowym i policzyć jasne, przezroczyste komórki (niebieskie komórki są martwe i nie powinny być liczone).
    UWAGA: Typowa liczba komórek z pojedynczego czujnika optycznego E7 waha się od 1 do 5 x 107 komórek/ml.
  9. Płytkować zdysocjowane komórki na MEA pokrytych ECM o gęstości 2,200 komórek/mm kwadratowy. W przypadku naszego systemu MEA przekłada się to na około 130 000 komórek na MEA. Dodaj pożywkę neuropodstawną, aby zwiększyć objętość w MEA do 1 ml i umieść MEA w inkubatorze CO2 na noc w celu przyłączenia komórek i przedłużenia neurytów (Rysunek 1).
    UWAGA: W przypadku MEA o różnych obszarach i liczbie elektrod można wypróbować różne gęstości komórek - ogólnie rzecz biorąc, wyższa gęstość komórek powoduje większą aktywność sieci, ale także prowadzi do krótszych hodowli.
  10. Następnego dnia dodać BPA do końcowego stężenia 10 μM w podłożu neurobazalnym z 1 mM zapasu wykonanego w kroku 1.1 do MEA poddanego działaniu środka terapeutycznego. Do kontrolnego MEA dodać taką samą objętość 10% roztworu etanolu w wodzie (v/v).
  11. Zastąp zużytą pożywkę pożywką neurobazalną zawierającą 10 μM BPA co drugi dzień przez 7 dni in vitro (7DIV), a następnie codziennie, wraz ze wzrostem aktywności sieci.
    UWAGA: Wraz ze wzrostem aktywności sieci wzrasta aktywność metaboliczna, a zmiany podłoża muszą być częstsze. Nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na pomarańczowy.

3. Rejestrowanie aktywności sieci neuronalnej

  1. W dniu pozyskania należy wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę neurobazalną i umieścić MEA w inkubatorze CO2 przez co najmniej 2 godziny przed rejestracją. Uruchom oprogramowanie rejestrujące i ustaw temperaturę MEA na 37 °C, klikając ikonę temperatury (rysunek uzupełniający 3.1a-b).
    UWAGA: Nagrywanie może rozpocząć się już w 3 dniu posiewu i może trwać tak długo, jak długo kultury są żywe.
  2. Ustaw parametry akwizycji, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę "Muse" (w sekcji Strumienie w lewym panelu okna) i wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Detektor spajków", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Spike Detector (6 x STD)" pojawi się pod nazwą pliku (Rysunek uzupełniający 3.2a-b).
  3. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Spike Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Burst Detector", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Burst Detector" (ISI) pojawi się pod ikoną Muse (Rysunek uzupełniający 3.3a-b).
  4. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Burst Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Kompilator statystyk neuronowych". W wyskakującym okienku upewnij się, że wybrano Nagłówek pliku, Zagregowane statystyki studni i Synchronizacja. Kliknij OK. "Kompilator statystyk" pojawi się poniżej (Rysunek uzupełniający 3.4a-b).
    UWAGA: Spowoduje to ustawienie adaptacyjnego przekraczania progu (filtr 6x STD), interwał między spajkami na 100 ms z minimalną liczbą skoków na 5, wykrywanie średniej szybkości wypalania na 10 s z parametrem synchronicznym na 20 ms oraz minimalna szybkość skoków na 0,083333 skoków na minutę.
  5. Ustaw zaplanowane nagrywanie na czas nagrywania 5 minut (300 000 ms), klikając ikonę zegara na dole. Osiąga się to poprzez zmianę informacji w sekcji ustawień, aby nagrywać co 5,1 minuty i nagrywać przez 5 minut. Zostanie to uruchomione natychmiast i zostanie wykonane jednorazowo (rysunek uzupełniający 3.5).
  6. Upewnij się, że temperatura MEA osiągnęła 37 °C przed przemieszczeniem MEA. Wyjmij MEA z inkubatora, umieść go na jednostce rejestrującej i zablokuj MEA. Rozpocznij nagrywanie aktywności sieciowej, klikając przycisk rozpocznij nagrywanie w sekcji zaplanowanego nagrywania lub ikonę nagrywania w oknie "Odtwarzanie plików". Zazwyczaj czas nagrywania wynosi 5 minut (300 000 ms), chociaż można uzyskać dłuższe nagrania do 10 minut.
  7. Po nagraniu włóż MEA z powrotem do inkubatora.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność w celu utrzymania sterylności i zminimalizowania czasu przebywania MEA poza inkubatorem.

4. Analiza danych

  1. Analiza surowych danych może odbywać się w trybie offline za pomocą oprogramowania do nagrywania. Kliknij menu rozwijane Plik i otwórz nagrywanie. Wybierz plik danych pierwotnych, który ma zostać przeanalizowany. Odtwórz ponownie surowe nagrania, aby uchwycić wymagane parametry pikowania.
  2. Aby uzyskać średnią liczbę skoków, użyj modułu Detektor spajków, a aby uzyskać wskaźnik synchronizacji, użyj modułu Kompilator statystyk neuronowych.
  3. Załaduj moduły Spike Detector, Burst Detector i Statistics Compiler jak poprzednio (Sekcja 3).
  4. Z menu rozwijanych w oknach modułu Detektor szczytów, Detektor serii i Kompilator statystyk wybierz odpowiednio Lista wartości szczytowych, Lista serii sieci i Metryki zaawansowane.
  5. Kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie pliku danych, który utworzy plik .csv w przekierowanym folderze. Parametry spajków - całkowita liczba skoków i indeks synchronizacji - zostaną zapisane w pliku .csv.
    UWAGA: Analiza w czasie rzeczywistym podczas rejestrowania surowych danych nie jest zalecana, ponieważ może to zużywać czas procesora i zasoby obliczeniowe.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbadaliśmy wpływ BPA na rozwój synchroniczny w hodowlach neuronalnych zarodków piskląt. Synchronizacja aktywności impulsowej jest wskaźnikiem prawidłowego rozwoju sieci neuronalnych in vitro. Gdy dwa skoki wystąpią w odległości 5 ms od siebie, uważa się je za synchroniczne. Hodowle neuronów in vitro początkowo wykazują losową aktywność impulsową - kolce występują losowo, a odstępy między kolcami wykazują normalny rozkład. W miarę dojrzewania kultur aktywność wyrastania staje się bardziej zsynchronizowana, a odstępy między kolcami są stałe. Synchroniczna aktywność impulsowa kultury została określona ilościowo za pomocą analizy korelacji krzyżowej czasów skoków przy użyciu oprogramowania rejestrującego12 w celu wyprowadzenia wskaźnika synchronizacji (SI). Odkryliśmy, że ekspozycja na BPA niekorzystnie wpływa na rozwój aktywności sieciowej poprzez zmniejszenie aktywności skokowej i wskaźnika synchronizacji (Rysunek 2a i 2b). Podsumowując, wykazaliśmy, że szkodliwy wpływ ekspozycji na BPA na zarodek wpływa na jego rozwój, w tym na funkcję neuronów, którą można ocenić poprzez synchroniczny rozwój neuronów piskląt w hodowli.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat protokołu przedstawiający etapy od sekcji przodomózgowia piskląt do dysocjacji, posiewu i rejestrowania aktywności sieci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: (A) Średnia liczba kolców jest znacznie niższa w hodowlach przodomózgowia piskląt traktowanych BPA E7 w porównaniu do kultur kontrolnych. Średnia liczba skoków została wyodrębniona za pomocą oprogramowania do nagrywania. Średnie (kontrola, 14 890 ± 949,0, N = 15 i BPA, 5 624 ± 465,9, N = 22) były istotnie różne (niesparowany test t, p <0,0001). (B) Średni wskaźnik synchronizacji (SI) jest znacznie niższy w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. SI został wyodrębniony za pomocą modułu Neural Statistics Compiler w oprogramowaniu do nagrywania. Średnie SI (kontrola, 0,5159 ± 0,06547 N = 15 i BPA, 0,1140 ± 0,01840 N = 22) były istotnie różne (niesparowany test t, p <0,0001). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fazy szybkiego wzrostu i rozwoju, takie jak embriogeneza, są szczególnie podatne na szkodliwe działanie różnych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego, w tym BPA. Udostępniamy szczegółowe protokoły badania skutków ekspozycji na BPA w modelu sieci neuronalnej kręgowców in vitro . Korzystając z tego protokołu, ustaliliśmy, że BPA obniża szybkość skoków, a także wskaźnik synchronizacji w rozwijających się sieciach neuronalnych (ryc. 2a-b).

Nasza metodologia została opracowana do badania ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy i może być łatwo dostosowana do badania wpływu innych EDC. Embrionalne kultury neuronalne piskląt są stosunkowo łatwe do ustalenia w porównaniu z innymi modelami kręgowców, w tym szczura lub myszy. Co więcej, nie ma potrzeby posiadania osobnego pomieszczenia dla zwierząt – do przeprowadzenia tych testów wystarczy prosty inkubator na stole laboratoryjnym. Opisujemy zastosowanie systemu wieloelektrodowego (MEA) do oceny wpływu EDC, BPA, na aktywność sieci. Opisane tutaj protokoły mogą być stosowane w innych systemach. Krytycznym aspektem tego protokołu jest utrzymanie sterylności. Obejmuje to preparację zarodka w sterylnych warunkach - wystarczy sterylizacja narzędzi z 70% etanolem i użycie sterylnego roztworu soli Hanka Balanced Salts. Ze względu na to, że dane są zbierane przez okres kilku tygodni, kluczowe znaczenie ma utrzymanie sterylnego obchodzenia się z MEA. Raz założone kultury neuronalne mogą być hodowane długoterminowo - do trzech miesięcy - i dlatego są przydatne do badania długotrwałej ekspozycji na EDC i inne związki w sieciach neuronalnych. Innym ważnym aspektem tego protokołu jest czas od sekcji do poszycia. Optymalny czas to 30 minut, łącznie z inkubacją tkanki z trypsyną. Im dłuższy czas, tym gorsza przeżywalność komórek.

Opisujemy tutaj podstawowy protokół, który można zastosować do oceny dowolnej substancji chemicznej lub leku, który wpływa na zachowanie i funkcje neuronalne. W tym przypadku zastosowaliśmy gęstość komórek wynoszącą 2 200 komórek na mm2; Można to jednak modyfikować i stosować inne gęstości komórek. Ogólnie rzecz biorąc, odkryliśmy, że zwiększenie gęstości komórek zwiększa aktywność sieci - więcej skoków w krótszym czasie. Opisana metoda, choć bardzo przydatna w ocenie wpływu substancji chemicznych na aktywność sieci, ma jednak ograniczenia. Jednym z największych ograniczeń tej metody jest to, że te dwuwymiarowe hodowle in vitro mogą nie odzwierciedlać trójwymiarowej architektury mózgu kręgowców. Można temu zaradzić, korzystając z nagrań slice. Inną alternatywą jest zastosowanie leczenia do rozwijającego się zarodka pisklęcia za pomocą małego okienka wyciętego na szerokim końcu jaja15, wypreparowanie mózgu pod koniec schematu leczenia, wykonanie grubych skrawków na wibratomie i umieszczenie w MEA w celu zarejestrowania aktywności sieci.

Nasz protokół jest istotny, ponieważ umożliwia badanie wpływu EDC na rozwój aktywności sieci i oferuje eksplorację mechanistycznych podstaw działania tych substancji chemicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez NSF (HBCU-UP Research Initiation Award, HRD 1401426 i EPSCoR EPS-0814251) oraz NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. jest wspierany przez stypendium z Delaware INBRE-III 6404.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5 forecepsFine Science Tools11251-10
Axion Muse MEAAxion BiosystemsM64-GL1-30Pt200Będzie nazywany systemem MEA w rękopisie
Axis SoftwareAxion BiosystemsBędzie nazywany oprogramowaniem do nagrywania w rękopisie
BPASigma-Aldrich239658-250g
zakrzywione kleszczeFine Science Tools11272-50
EtOHSigma-Aldrich64-17-5
Zapłodnione jaja kurzez dowolnej lokalnej farmy lub Spafas
HBSSFisher14170112
HemacytometrFisher  02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced Phenol Red-FreeBD Biosciences356231Będzie nazywany Extra Cellular Matrix (ECM) w manuskrypcie
Neurobaseal mediumBrainBitsNb4-500
Oprogramowanie statystyczne NeuroexplorerNex TechnologiesNeuroexplorer wersja 5
Pipety PasteuraFisher  13-678-20A
Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki15514-12
Naczynia do preparowania dna SylgardLiving Systems InstrumentaionDD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dyeFisher15-250-061
Trypsyna-EDTAFisher15400054
precyzyjnej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).
  2. Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).
  3. Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).
  4. Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
  5. Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).
  6. Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system. Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).
  7. Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).
  8. Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).
  9. Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).
  10. Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27(2015).
  11. Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12 (7), 1006223(2016).
  12. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5 (12), 14443(2010).
  13. Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).
  14. Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).
  15. Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).
  16. Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).
  17. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  18. Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
  19. Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno sieci neuronalnejzarodkowy m zg kurczakaekspozycja na bisfenol Aanaliza aktywno ci impulsowejpomiar synchronizacjisterylna hodowla kom rkowatrawienie trypsyn z EDTArejestracja elektrofizjologiczna

Powiązane artykuły