Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria są elektrowniami komórek i wytwarzają energię komórkową w postaci ATP. Dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do biologicznego starzenia się i wielu różnych zaburzeń, w tym chorób metabolicznych, zespołów przedwczesnego starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona (PD). Utrzymanie zdrowia mitochondriów zależy od biogenezy mitochondriów i skutecznego usuwania dysfunkcyjnych mitochondriów poprzez mitofagię. Opracowanie eksperymentalnych metod dokładnego wykrywania autofagii/mitofagii, zwłaszcza w modelach zwierzęcych, było trudne. Niedawny postęp w kierunku zrozumienia molekularnych mechanizmów mitofagii umożliwił opracowanie nowych technik wykrywania mitofagii. Tutaj przedstawiamy kilka wszechstronnych technik monitorowania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans (np. szczepy Rosella i DCT-1 / LGG-1) oraz myszy (mt-Keima). Połączenie tych technik wykrywania mitofagii, w tym ocena międzygatunkowa, poprawi dokładność pomiarów mitofagii i doprowadzi do lepszego zrozumienia roli mitofagii w zdrowiu i chorobie.
Wprowadzenie
Mitofagia jest niezbędna do utrzymania mitochondriów. Mitochondria przecinają wiele szlaków sygnalizacji komórkowej i są uniwersalnymi organellami subkomórkowymi odpowiedzialnymi za produkcję energii komórkowej, metabolizm komórkowy i homeostazę wapnia1,2,3,4. Mitochondria stale doświadczają wyzwań związanych ze źródłami endogennymi i egzogennymi, takimi jak odpowiednio reaktywne formy tlenu (ROS) i toksyny mitochondrialne, co prowadzi do powstawania "starzejących się" i dysfunkcyjnych mitochondriów. Nagromadzenie uszkodzonych mitochondriów ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zwierzęta (samce i samice myszy) urodziły się i były hodowane w akredytowanym ośrodku dla zwierząt, zgodnie z i aprobatą Komitetu Opieki i Użytkowania Zwierząt NIH. Metody eutanazji muszą być zgodne ze wszystkimi przepisami krajowymi i instytucjonalnymi.
1. Wykrywanie mitofagii w komórkach ludzkich
- Wykrywanie mitofagii za pomocą plazmidu mt-Keima
UWAGA: Białko Keima, połączone z sygnałem docelowym mitochondriów, uproszczone jako mt-Keima, okazało się przydatne do wykrywania mitofagii in vivo. mt-Keima jest ratiometrycznym białkiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH, które wykazuje zieloną fluoresce....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykrywanie mitofagii w komórkach ludzkich:
Stosując przedstawioną tutaj procedurę, ludzkie komórki HeLa poddano transfekcji plazmidem mt-Keima. Zdrowe komórki wykazały dobrze zorganizowaną sieć mitochondrialną (GFP, 488 nm) z niewielką liczbą zdarzeń mitofagii (RFP, 561 nm). Jednakże komórki poddane wstępnemu traktowaniu mitochondrialnym odsprzęgaczem FCCP (30 µM przez 3 h) wykazały znaczny wzrost częstości występowania mitofagii (.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dokładny pomiar mitofagii jest wymagający technicznie. W tym miejscu przedstawiliśmy kilka solidnych technik, które pozwalają zarówno na jakościowe wykrywanie mitofagii, jak i kwantyfikację poziomów mitofagii w najpopularniejszych laboratoryjnych modelach eksperymentalnych.
Aby uzyskać powtarzalne dane, konieczny jest projekt eksperymentalny z co najmniej trzema powtórzeniami biologicznymi. Wszyscy badacze zaangażowani w eksperymenty i analizy muszą być ślepi na eksperymentalną tożsamość grupo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Laboratorium Bohr zawarło umowy CRADA z firmami ChromaDex i GlaxoSmithKline.
Podziękowania
Dziękujemy dr Atsushi Miyawaki i dr Richardowi J. Youle za udostępnienie plazmidu mt-Keima i zintegrowanych komórek Hela mt-Keima. Dziękujemy Raghavendrze A. Shamannie i dr Deborah L. Croteau za krytyczną lekturę manuskryptu. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIH (VAB), National Institute on Ageing, a także grant wewnątrzlaboratoryjny NIA na lata 2014-2015 i 2016-2017 (EFF, VAB). EFF był wspierany przez HELSE SOR-OST RHF (nr projektu: 2017056) oraz Norweską Radę ds. Badań Naukowych (nr projektu: 262175).
WKŁAD AUTORA:
EFF zaprojektowała rękopis i przygotowała szkic; KP, NS, EMF, RDS, JSK, S....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| mt-Keima mysz | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji DNA | Thermofisher | #11668027 | |
| Pożywka Opti-MEM (Gibco) | Pożywka bez surowicy | Thermofisher | #31985062 |
| plazmid mtEmia: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| Przeciwciało COXII (mysz) | abcam | #ab110258 | |
| Przeciwciało LAMP2 (królik) | NOVUS | ||
| kozio-anty-królik o długości fali 568 nm czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 |
| barwnik kozio-anty-mysz o długości fali 488 nm zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 |
| barwnik przedłuża złoty środek zapobiegający blaknięciu z DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| Płytka 6-dołkowa | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| 4-dołkowa szkiełko komorowe | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-dołkowa płytka | Thermofisher | #152038 | |
| Przeciwciało LC3B królik | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA | Progen Biotechnik | #anti-DNA mysie monoklonalne, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI |
| IN Analizator komórek (czytnik fluorescencyjny) | GE Healthcare Nauki przyrodnicze | #IN Analizator komórek Mikroskop konfokalny 2200 | |
| Eclipse TE-2000e | Nikon | #TE-2000e | |
| Oprogramowanie do kolokalizacji | Volocity | #Volocity 6.3 | alternatywne oprogramowanie Zeiss ZEN 2012 |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| pożywka do hodowli komórkowych | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Thermofisher | #15140122 | |
| Surowica bydlęca płodu | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Inkubator | |
| epifluorescencyjny | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| kamera | Olympus | Olympus DP71 | |
| Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | ||
| do | Zeiss | ZEN 2012 | |
| Analiza kolokalizacji | obrazu Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| oprogramowanie do analizy statystycznej | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | Pakiet oprogramowania GraphPad Prism | |
| materiał do wykonania kilofa ślimakowego | Surepure Chemetals | #4655 | Kilof wykonany jest z drutu o grubości 30 90% platyny 10% irydu |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Zapytanie materiałowe do Tavernarakis Nektarios | Utrzymuj transgeniczne zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed:: LGG-1 | Zapytanie materiałowe do Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat roztwór | patrz dane uzupełniające do przygotowania | ||
| buforu M9 | patrz dane uzupełniające do przygotowania | ||
| buforu M9-lewamizolu | patrz dane uzupełniające do przygotowania | ||
| Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Kleszcze chirurgiczne | STERIS Animal Health | 19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczne | |
| nożyczki chirurgiczne | STERIS Animal Health | 19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczny | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS należy rozcieńczyć do 1x PBS za pomocą |
| wytrząsarki | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Stołowa orbitalna mała wytrząsarka platformowa na otwartym powietrzu Pakiet |
| 2% podkładki agarozowej | Zobacz dane uzupełniające dotyczące przygotowania | ||
| Ostrza Vibroslice | Światowe instrumenty precyzyjne | #BLADES-2 | płyta z jednokrawędziowym ostrzem |
| MSC | #78803988 | 0,012 cala grubości x 6 cali szerokości x 12 cali długości, blacha ze stali nierdzewnej 430 | |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Hydrat dichlorku wioligogenu metylu | Sigma-Aldrich | #856177 | parakwat |
| Inkubator dla nicieni | AQUALYTIC | Inkubator do utrzymania 20 ° C | |
| Stereoskop preparacyjny | Olympus | SMZ645 | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | AxioObserver Z1 | Dla nicieni (krok 2) |
| mikroskop epifluorescencyjny | Zeiss | AxioImager Z2 | Dla nicieni (krok 2) |
| Środek sieciujący UV | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | Źródło światła UV; 356 nm |
Bibliografia
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
