Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach

17.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

22 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

Mitofagia, proces oczyszczania uszkodzonych mitochondriów, jest niezbędny do homeostazy mitochondriów i utrzymania zdrowia. W tym artykule przedstawiono niektóre z najnowszych metod wykrywania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans i myszach.

Streszczenie

Mitochondria są elektrowniami komórek i wytwarzają energię komórkową w postaci ATP. Dysfunkcja mitochondriów przyczynia się do biologicznego starzenia się i wielu różnych zaburzeń, w tym chorób metabolicznych, zespołów przedwczesnego starzenia się i chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD) i choroba Parkinsona (PD). Utrzymanie zdrowia mitochondriów zależy od biogenezy mitochondriów i skutecznego usuwania dysfunkcyjnych mitochondriów poprzez mitofagię. Opracowanie eksperymentalnych metod dokładnego wykrywania autofagii/mitofagii, zwłaszcza w modelach zwierzęcych, było trudne. Niedawny postęp w kierunku zrozumienia molekularnych mechanizmów mitofagii umożliwił opracowanie nowych technik wykrywania mitofagii. Tutaj przedstawiamy kilka wszechstronnych technik monitorowania mitofagii w komórkach ludzkich, Caenorhabditis elegans (np. szczepy Rosella i DCT-1 / LGG-1) oraz myszy (mt-Keima). Połączenie tych technik wykrywania mitofagii, w tym ocena międzygatunkowa, poprawi dokładność pomiarów mitofagii i doprowadzi do lepszego zrozumienia roli mitofagii w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Mitofagia jest niezbędna do utrzymania mitochondriów. Mitochondria przecinają wiele szlaków sygnalizacji komórkowej i są uniwersalnymi organellami subkomórkowymi odpowiedzialnymi za produkcję energii komórkowej, metabolizm komórkowy i homeostazę wapnia1,2,3,4. Mitochondria stale doświadczają wyzwań związanych ze źródłami endogennymi i egzogennymi, takimi jak odpowiednio reaktywne formy tlenu (ROS) i toksyny mitochondrialne, co prowadzi do powstawania "starzejących się" i dysfunkcyjnych mitochondriów. Nagromadzenie uszkodzonych mitochondriów zmniejsza wydajność produkcji ATP, jednocześnie zwiększając ilość szkodliwych ROS, i jest powiązane z chorobami związanymi z wiekiem, takimi jak choroby metaboliczne, AD i PD1,5,6. Aby zapobiec dysfunkcji komórkowej wywołanej mitochondriami, komórki muszą specyficznie rozpoznawać uszkodzone mitochondria i skutecznie usuwać je w procesie komórkowym zwanym autofagią mitochondrialną (mitofagią). Wykazano znaczenie mitofagii w zdrowiu i chorobie, co ilustruje potrzebę dokładnych i skutecznych metod wykrywania mitofagii zarówno in vitro, jak i in vivo.

Mitofagia to wieloetapowy proces, w którym bierze udział wiele białek i kompleksów białkowych5,7,8. Krótko mówiąc, uszkodzone mitochondrium jest najpierw rozpoznawane i pochłaniane przez fagofor o podwójnej błonie, który może pochodzić z błony plazmatycznej, retikulum endoplazmatycznego, kompleksu Golgiego, jądra lub samego mitochondrium9,10. Fagofor sferyczny wydłuża się i ostatecznie uszczelnia mitochondria wewnątrz, tworząc autofagosom mitochondrialny (mitofagosom). Mitofagosom następnie łączy się z lizosomem w celu degradacji, tworząc autolizosom, w którym uszkodzone mitochondrium jest degradowane i poddawane recyklingowi7,8. Główne białka autofagiczne zaangażowane również w mitofagię to: Autofagia związana z 7 (ATG7) i Beclin1 (inicjacja), białko związane z mikrotubulami 1A/1B-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 w C. elegans) i p62 (składniki fagoforu) oraz glikoproteina błonowa związana z lizosomem 2 (LAMP2)6,7. Ponadto istnieje kilka niezbędnych białek unikalnych dla mitofagii, w tym między innymi indukowana przez PTEN przypuszczalna kinaza 1 (PINK-1), parkin1, białko jądrowe kropki 52 kDa (NDP52), optineuryna, białko oddziałujące BCL2 3 Like (NIX/BNIP3L) (DCT-1 w C. elegans), między innymi5,6,11.

Powszechną metodą wykrywania zmian w poziomach autofagii jest stosunek LC3-II/LC3-I lub LC3-II/aktyny. Jednak ta metoda jest niespecyficzna, ponieważ wzrost tego współczynnika może odzwierciedlać zwiększoną inicjację lub upośledzoną fuzję mitofagosomu z lizosomem12. Inną metodą jest ocena kolokalizacji między markerem autofagii (np. LC3) a białkiem mitochondrialnym (np. Translokaza zewnętrznej błony mitochondrialnej 20 (TOMM20, które może być degradowane przez proteasomy)). Może to jednak wskazywać jedynie na zmiany w całkowitym poziomie mitofagii i nie może odróżnić etapu, na którym dochodzi do blokady. Można to wyjaśnić, stosując równolegle inhibitory lizosomalne (np. E64d + pepstatyna A, określane jako EP) w celu spowodowania akumulacji mitofagosomów. Różnica między liczbą mitofagosomów na początku badania a liczbą mitofagosomów po leczeniu EP może wskazywać na mitofagię. Ograniczenia te skłoniły do opracowania nowych technik wykrywania mitofagii. W związku z rosnącym znaczeniem mitofagii w szerokim spektrum chorób człowieka, przedstawiamy kilka solidnych technik wykrywania mitofagii, które mogą być przydatne dla badaczy. Omawiamy zarówno techniki in vitro, jak i in vivo i zalecamy łączenie wielu technik w celu weryfikacji zmian mitofagii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zwierzęta (samce i samice myszy) urodziły się i były hodowane w akredytowanym ośrodku dla zwierząt, zgodnie z i aprobatą Komitetu Opieki i Użytkowania Zwierząt NIH. Metody eutanazji muszą być zgodne ze wszystkimi przepisami krajowymi i instytucjonalnymi.

1. Wykrywanie mitofagii w komórkach ludzkich

  1. Wykrywanie mitofagii za pomocą plazmidu mt-Keima
    UWAGA: Białko Keima, połączone z sygnałem docelowym mitochondriów, uproszczone jako mt-Keima, okazało się przydatne do wykrywania mitofagii in vivo. mt-Keima jest ratiometrycznym białkiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH, które wykazuje zieloną fluorescencję (wzbudzenie 458 nm) w warunkach zasadowych lub obojętnych i czerwoną fluorescencję (wzbudzenie 561 nm) w warunkach kwaśnych. Zdrowe mitochondria rozwijają się w warunkach podstawowych lub obojętnych (pH 7-8) i są wskazywane przez zieloną fluorescencję po transfekcji mt-Keima. Gdy mitochondria przechodzą mitofagię i łączą się z kwaśnymi lizosomami, pH spada do 4,5, a mitochondria zawierające mt-Keima wykazują czerwoną fluorescencję6,13,14. Co ważne, mt-Keima jest oporna na proteazy lizosomalne, co umożliwia ocenę mitofagii w dłuższych okresach. Poniższy protokół jest przeznaczony dla płytek 6-dołkowych.
    1. Dzień 1: Użyj pierwotnych komórek ludzkich (np. fibroblastów) lub unieśmiertelnionych komórek ludzkich (np. Komórek Hela lub komórek U2OS). Wysiew około 0,3-1 × 106 komórek/dołek (w zależności od tempa wzrostu komórek, aby umożliwić komórkom osiągnięcie 70% zbiegu następnego dnia) na płytce 6-dołkowej. Utrzymać komórki w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych (pożywka Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% FBS i 1% mieszanym roztworem penicyliny-streptomycyny) i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (20%O2, 5% CO2). Dodać 1 ml kompletnej pożywki/dołka do hodowli komórkowych na płytce 6-dołkowej.
      UWAGA: Na tym etapie można przeprowadzić nadekspresję genów/knockdown lub leczenie farmakologiczne6.
    2. Dzień 2: Wymieszaj plazmid DNA mt-Keima6 i odczynnik do transfekcji DNA (mieszanina na jeden dołek z płytki 6-dołkowej).
      1. Rozcieńczyć 15 μl odczynnika do transfekcji DNA w 150 μl pożywki wolnej od surowicy zgodnie z protokołem producenta.
      2. Rozcieńczyć 2-5 μg plazmidowego DNA mt-Keima w 150 μl pożywki wolnej od surowicy.
      3. Dodaj rozcieńczony plazmid mt-Keima do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji DNA, wiruj przez 10 s i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Optymalizacja warunków transfekcji DNA może być konieczna w zależności od wielkości płytki (szczegółowe informacje można znaleźć w protokołach producentów).
      4. Dodawaj kroplami mieszaninę DNA/odczynnika do transfekcji do komórek, a następnie delikatnie potrząsaj płytkami przez 5-10 s, aż roztwór całkowicie się wymiesza
        5. .
    3. Dzień 3: Zmień pożywkę, zastępując pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji DNA świeżą, kompletną pożywką do hodowli komórkowych (1 ml / dołek).
    4. Dzień 4: Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej6. Użyj dwóch kanałów obrazowania: kanału zielonego (wzbudzenie 458 nm, emisja 570-695 nm) do wizualizacji prawidłowych mitochondriów i kanału czerwonego (wzbudzenie 561 nm, emisja 570-695 nm) do wizualizacji mitochondriów, które przechodzą mitofagię. Losowo zobrazuj 20 obszarów pod 40-krotnym powiększeniem, aby pokryć łącznie 100-200 komórek w każdym dołku.
    5. Przeprowadzanie analizy danych. Oblicz "indeks mitofagii" (procent mitochondriów poddawanych mitofagii), używając oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo ilość fluorescencji zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym: weź stosunek fluorescencji czerwonej do fluorescencji czerwonej + zielonej i pomnóż przez 1006.
      UWAGA: Alternatywą dla transfekcji jest użycie linii komórkowych HeLa o stabilnej ekspresji mt-Keima14. Ponieważ komórki HeLa nie wyrażają Parkiny, Parkina musi być stabilnie eksprymowana, aby badać mitofagię zależną od Parkiny w tej linii komórkowej.
  2. Wykrywanie mitofagii za pomocą kolokalizacji między podjednostką II oksydazy cytochromu C (COXII) a LAMP2
    UWAGA: COXII jest białkiem błony wewnętrznej kodowanym w genomie mitochondrialnym. "Wskaźnik mitofagii" jest równy stosunkowi COXII kolokalizowanego z LAMP2 wyrażonemu jako procent całkowitej ilości COXII.
    1. Nasienne komórki HeLa (lub inne komórki będące przedmiotem zainteresowania wymienione w kroku 1.1.1) w 4-dołkowym szkiełku komorowym (1-5 ×10 4 komórki w 1 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych/dołku) w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (20%O2, 5% CO2) przez noc.
    2. Dodać 3,0 μl 10 mM cyjanku karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych (etap 1.2.1) przez 3 godziny
      UWAGA: Można stosować inne leki wpływające na mitofagię.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą pipety o pojemności 1 ml, przemyć komórki dwukrotnie 1 ml / studzienkę zimnego (0-4 °C) 1x PBS. Pozostaw roztwór na 10-30 s przed następnym praniem. Następnie dodaj 0,5 ml 3,7% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 10 minut na lodzie, aby utrwalić komórki.
      Uwaga: PFA jest toksyną. Pracuj w dygestorium podczas korzystania z PFA.
    4. Wyrzuć roztwór PFA za pomocą pipety o pojemności 1 ml, przemyj komórki dwukrotnie zimnym 1X PBS (1 ml / studzienkę; pozostaw roztwór na 10 s przed następnym płukaniem) i przepuść komórki za pomocą 1 ml / studzienkę 0,25% detergentu (w 1x PBS) przez 10 minut na lodzie.
    5. Wyrzuć bufor przepuszczalny, delikatnie przemyj komórki dwukrotnie zimnym 1x PBS i wyrzuć (pozostaw roztwór na 10 s między płukaniami). Zablokuj komórki 1 ml/studzienkę 5% FBS w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Przykryj komory, aby zapobiec utracie wilgoci.
    6. Przygotować 0,5 ml / basenik zmieszanego roztworu przeciwciał z przeciwciałem COXII (mysz, rozcieńczenie 1:250) i przeciwciałem LAMP2 (królik, rozcieńczenie 1:20-1:50) w 1x PBS z 5% FBS i przechowywać na lodzie przez 0,5-1 godzinę.
    7. Wyjmij szkiełko z 4-dołkową komorą z komory chłodniczej i wylej roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Delikatnie przemyj komórki dwukrotnie 1 ml / studzienkę zimnego 1x PBS i wyrzuć (pozostaw roztwór na 10 s między płukaniami), a następnie dodaj 0,5 ml / studzienkę zmieszanego roztworu przeciwciał. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na wytrząsarce z małą prędkością.
    8. Odrzucić pierwszy roztwór przeciwciała za pomocą pipety o pojemności 1 ml i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie 1 ml / studzienkę zimnego 1x PBS i wyrzucić. Pozostaw roztwór na 10 s przed następnym praniem. Dodać 1 ml / studzienkę fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych (np. koziego anty-królika o długości fali 568 nm czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) dla LAMP2; i koziego anty-mysiego o długości fali 488 nm białka zielonej fluorescencji (GFP) dla COXII) w rozcieńczeniu 1:250 z 5% FBS w 1x PBS. Przykryć szkiełko 4-dołkowe folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na wytrząsarce z małą prędkością.
    9. Drugi roztwór przeciwciał należy odrzucić pipetą o pojemności 1 ml. Delikatnie umyj komórki sześć razy 1 ml / studzienkę zimnego 1x PBS. Pozostaw roztwór na 1 minutę przed następnym praniem.
    10. Zamontuj ogniwa za pomocą 50 μl/studzienkę pożywki do mocowania zapobiegającego blaknięciu za pomocą DAPI i dodaj szkiełka nakrywkowe.
    11. Zobrazuj komórki pod mikroskopem konfokalnym z 66-krotnym powiększeniem i olejkiem immersyjnym (skany/mozaiki kafelkowe mogą być użyte do zwiększenia liczby komórek obrazowanych przez oprogramowanie). Używaj tych samych ustawień, takich jak czas ekspozycji kanału, wzmocnienie cyfrowe, przesunięcie cyfrowe itp. we wszystkich procesach obrazowania (szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach oprogramowania)15.
    12. Użyj oprogramowania do analizy kolokalizacji, aby przeanalizować ilościowo co najmniej 20 losowych obrazów ze 100 komórek15. Użyj funkcji "Zamknięty Bezier", aby zaznaczyć całe pojedyncze komórki. Porównaj współczynnik kolokalizacji GFP Pearsona z RFP, ważonym lub nieważonym, aby określić poziomy mitofagii w analizowanych komórkach. Utrzymuj wartości poziomych i pionowych krzyżyków oprogramowania do analizy kolokalizacji przez cały czas trwania analizy. Aby dokładnie ustawić te krzyżyki, przygotuj dwa dodatkowe zestawy komórek i oznacz jedną COXII, a drugą LAMP2. Następnie ustaw krzyżyk nitkowy bezpośrednio nad rozkładem pikseli dla każdego kanału15 (szczegóły w instrukcjach oprogramowania).
  3. Wysokoprzepustowy pomiar obrazowy do badań przesiewowych w kierunku mitofagii
    UWAGA: Wykonywanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków indukujących lub hamujących mitofagię z dużych bibliotek związków jest technicznie wymagające. Technika obrazowania oparta na kolokalizacji mitochondriów z autofagosomami jest bardziej uproszczoną, ale bardzo czułą alternatywą dla badań przesiewowych mitofagii16.
    1. Dzień 1: Komórki nasienne (np. ludzkie pierwotne fibroblasty w 5 000 komórek/100 ml pożywki do hodowli komórkowych/dołku) na 96-dołkowej płytce (patrz krok 1.1.1).
    2. Dzień 2: Traktuj komórki od drugiego dnia FCCP lub innymi związkami będącymi przedmiotem zainteresowania przez wyznaczony czas inkubacji (patrz krok 1.2.2).
    3. Postępuj zgodnie z krokami 1.2.2-1.2.9, używając pierwszorzędowych przeciwciał dla COXII (mysz, rozcieńczenie 1:250 z 5% FBS w 1x PBS) i LC3B (królik, rozcieńczenie 1:100-1:200 z 5% FBS w 1x PBS). Alternatywnie można zastosować przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko COXII i LAMP2.
    4. Zobrazuj komórki za pomocą czytnika fluorescencyjnego16. Zbieraj obrazy w losowo rozmieszczonych polach i z minimum 500 komórkami/studzienką.
    5. Analizuj dane za pomocą dostosowanego do potrzeb analizatora komórek protocol16.

2. Wykrywanie mitofagii u C. elegans

UWAGA: Nicień C. elegans stanowi platformę do testowania mitofagii na poziomie organizmu. Do monitorowania mitofagii można wykorzystać dwa szczepy: (1) Rosella (mtRosella) ukierunkowana na mitochondria lub (2) receptor mitofagii DCT-1 połączony z GFP wraz z markerem autofagosomalnym LGG-1 połączony z czerwonym białkiem fluorescencyjnym Discosoma sp. (DsRed)5,17.

  1. Monitorowanie mitofagii za pomocą biosensora Rosella
    UWAGA: Rosella to bioczujnik molekularny, który łączy niewrażliwy na pH DsRed połączony z wrażliwym na pH wariantem GFP. Biosensor Rosella wykorzystuje różnice pH między kwaśnym lizosomem (pH ~4,5) a innymi przedziałami komórkowymi. Ten biosensor został wykorzystany do skutecznego monitorowania mitofagii u Saccharomyces cerevisiae i kilku linii komórkowych ssaków, takich jak HeLa, HEK293 i HCT11618,19. Dostosowaliśmy ten wszechstronny podwójnie fluorescencyjny reporter i wygenerowaliśmy transgeniczne nicienie C. elegans eksprymujące Rosellę ukierunkowaną na mitochondria (mtRosella) w komórkach mięśniowych ściany ciała. Indukcja mitofagii jest wskazywana przez zmniejszony stosunek GFP / DsRed fluorescencji mtRosella.
    1. Dzień 1: Wybierz larwy L4 robaków wykazujących ekspresję Roselli ukierunkowanej na mitochondria (mtRosella) w komórkach mięśniowych ściany ciała na płytkę pożywki wzrostu nicieni (NGM) wysianą E. coli (OP50) za pomocą mikroskopu preparacyjnego5. Umieść 10-20 robaków/talerz na co najmniej trzech talerzach o średnicy 3,5 cm. Inkubować nicienie w standardowej temperaturze 20 °C5.
      UWAGA: Zobacz odnośnik do anatomii robaka, w tym identyfikacji larw L4 20 oraz sposobu tworzenia kilofa, który jest używany do przenoszenia robaków z jednego miejsca do drugiego21.
    2. Dzień 5: Zsynchronizuj nicienie, wybierając 15-20 transgenicznych larw L4 i przenosząc je na świeżą płytkę NGM z nasionami OP50. Użyć co najmniej pięciu płytek na warunki doświadczalne.
    3. Dzień 7: Przygotuj tablice rejestracyjne dla leków wpływających na mitofagię, które są przedmiotem zainteresowania lub kontroli pozytywnej.
      1. Zabij bakterie E. coli (OP50) wysiane, wystawiając płytki NGM na 15 minut z 222 μW/cm2 (intensywność) światła UV, aby upewnić się, że związki indukujące mitofagię nie są metabolizowane przez bakterie. Płyty muszą być naświetlone 2,000 J/m2,
        UWAGA: Potrzebne sekundy ekspozycji = 2,000/((intensywność w μW/cm2)*100).
      2. Dodaj interesujący związek (związki) na wierzch płytek NGM z nasionami. Dodać równoważną ilość nośnika złożonego (rozpuszczalnika używanego do rozpuszczania związku, takiego jak dimetylosulfotlenek (DMSO)) do tabliczek nośnika jako kontrolę ujemną. Do pozytywnej kontroli indukcji mitofagii zastosowano mitochondrialny środek toksyczny, parakwat (stężenie końcowe 8 mM). Dodać roztwór zawierający 10 μl 8 M wywaru parakwatu i 190 μl ddH2O na wierzchu płytki agarowej dla grupy poddanej działaniu substancji. Dla grupy nośników dodać roztwór zawierający 10 μl DMSO ze 190 μl ddH2O na wierzchu płytki agarowej.
        UWAGA: Roztwór roboczy parakwatu można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
      3. Delikatnie obracaj płytki, aż lek lub pojazd pokryje całą powierzchnię. Pozostaw płytki do wyschnięcia z zamkniętymi pokrywkami w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem robaków.
        UWAGA: Płytki z lekami można również przygotować, dodając leki do płynnego NGM przed jego zestaleniem.
    4. Dzień 7: Przenieś 10-20 2-dniowych dorosłych zwierząt transgenicznych przygotowanych w kroku 2.1.2 na płytki zawierające parakwat, związek (związki) będący przedmiotem zainteresowania lub nośnik (DMSO). Inkubować transgeniczne zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 2 dni.
    5. Dzień 9: Przygotuj 2% płatki agarozowe (patrz Materiały Uzupełniające). Następnie dodać jedną kroplę (10 μl) 20 mM lewamizolu w M9 na wkładkę. Unieruchomij transgeniczne zwierzęta do obrazowania, umieszczając je w kropli M9-lewamizolu. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
    6. Uchwyć pojedyncze transgeniczne zwierzęta za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu epifluorescencyjnego. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne całych transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję mtRosella w komórkach mięśniowych ściany ciała przy 10-krotnym powiększeniu5. Zapisz zebrane obrazy.
    7. Przetwarzaj pozyskane obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ. Przeanalizuj komórki mięśniowe ściany ciała znajdujące się w głowie robaka, aby uniknąć autofluorescencji w tkance jelitowej. Zmierz średnią wartość intensywności pikseli i całkowitą powierzchnię dla każdego obrazu fluorescencyjnego tylko w obszarze głowy każdego zwierzęcia. Aby przeanalizować konkretny obszar zainteresowań:
      1. Wybierz "podziel kanał" w menu rozwijanym "obraz" i "kolor", aby przekonwertować obrazy .
      2. Użyj narzędzia "zaznaczanie odręczne", aby uchwycić fluorescencyjny obszar zainteresowania.
      3. Wybierz polecenie "pomiar" w menu rozwijanym "analizuj" i przeprowadź analizę intensywności pikseli.
      4. Intensywność pikseli należy znormalizować, dzieląc intensywność przez całkowity analizowany obszar. Po normalizacji oblicz stosunek GFP do DsRed22.
    8. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić test t-student (porównanie między dwiema grupami) lub ANOVA (porównanie między wieloma grupami) do analizy statystycznej z p < 0,05 jako znaczącym5,17.
  2. Ocena mitofagii za pomocą kolokalizacji między DCT-1 i LGG-1
    UWAGA: DCT-1 jest białkiem błony mitochondrialnej zewnętrznej, które działa jako receptor mitofagii w odpowiedzi na warunki stresowe, podobnie jak jego domniemane ortologi BNIP3 i NIX/BNIP3L u ssaków5. Tak więc inicjacja mitofagii jest oceniana przez kolokalizację między receptorem mitofagii DCT-1 a autofagosomalnym białkiem błonowym LGG-1 (homolog ssaka LC3).
    1. Dzień 1: Wybierz larwy L4 zwierząt transgenicznych wykazujące ekspresję zarówno DCT-1::GFP, jak i DsRed::LGG-1 w komórkach mięśniowych ściany ciała5 na płytce NGM z nasionami OP50. Umieść 5-10 robaków/talerz 3,5 cm i użyj co najmniej trzech talerzy. Inkubować nicienie w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Transgeny znajdują się na oddzielnych plazmidach i nie są zintegrowane z genomem. Podnieś nicienie niosące zarówno markery kontransformacji rol-6 (su1006), jak i pmyo-2 GFP. Tylko transgeniczne robaki z obydwoma markerami kontransformacji wyrażają zarówno DCT-1::GFP, jak i DsRed::LGG-1 w komórkach mięśniowych ściany ciała.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami z 2.1.2-2.1.5.
    3. Obraz pojedynczych komórek mięśniowych ściany ciała za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu konfokalnego5,23. Wykrywaj granice całych komórek mięśniowych ściany ciała i rób zdjęcia z zestawu pod 63-krotnym powiększeniem. Można również zastosować większe powiększenie.
    4. Otwieraj i przetwarzaj obrazy uzyskane za pomocą oprogramowania konfokalnego. Inicjacja mitofagii jest wskazywana przez kolokalizację receptora mitofagii (DCT-1::GFP) do markera autofagosomalnego (DsRed::LGG-1). Ręcznie zmierz zdarzenia kolokalizacji w każdym stosie komórek mięśniowych ściany ciała5. Istotne jest, aby wszystkie ustawienia mikroskopu i kamery (obiektyw i lupa, filtry, czas ekspozycji, rozdzielczość, intensywność lasera, wzmocnienie itp.) były spójne podczas eksperymentów. Należy zwrócić uwagę na wszystkie ustawienia.
    5. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić test t-student (porównanie między dwiema grupami) lub ANOVA (porównanie między wieloma grupami) do analizy statystycznej z p < 0,05 jako znaczącym5,17. Do porównań dwukierunkowych użyj testu t-Studenta (p < 0,05 jest uważane za istotne). W przypadku porównań wielokrotnych należy użyć jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), skorygowanej za pomocą testu Bonferroniego post hoc. Zalecamy analizę co najmniej 50-70 zwierząt lub 30-50 komórek mięśniowych ściany ciała dla każdego warunku eksperymentalnego. Powtórz eksperyment co najmniej trzy razy.

3. Wykrywanie mitofagii u myszy

UWAGA: Poprzednie metody wykrywania mitofagii u myszy były kłopotliwe, niewrażliwe i trudne do oszacowania. Transgeniczny model myszy wyrażający ukierunkowaną na mitochondria formę fluorescencyjnego reportera Keima (mt-Keima) może być teraz wykorzystany do oceny poziomów mitofagii w szerokim zakresie warunków fizjologicznych i patofizjologicznych.

  1. Eutanazja myszy przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt14.
  2. Przymocuj mysz (brzuszną stroną do góry) do platformy roboczej za pomocą kołków w kończynach. Wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych i kleszczy, aby odsłonić wątrobę24. Wytnij kawałek wątroby (np. kawałek prawego płata w odległości 1 × 1 × 1 cm) za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych i kleszczyków.
    UWAGA: Wykrywanie mitofagii u myszy jest skomplikowane i wymaga wiedzy na temat anatomii myszy oraz bardzo umiejętnego obchodzenia się z myszami i chirurgii na myszach. Ten protokół zawiera podstawowe, kluczowe kroki tej metody, a bardziej szczegółowa metoda jest dostępna24.
  3. Umieść próbkę wątroby na metalowej płytce na lodzie, aby szybko schłodzić tkankę. Trzymaj chusteczkę na zimnej metalowej płytce i przetwarzaj tak szybko, jak to możliwe. Optymalnie zużyć w ciągu 1 godziny od rozwarstwienia.
  4. Podnieś próbkę wątroby za pomocą zakrzywionych kleszczyków i spłucz 5 ml lodowatego 1x PBS.
  5. Przenieść wątrobę na szalkę Petriego (Ø 100 mm) na lodzie za pomocą końcówki łopatki z łyżką.
  6. Próbkę wątroby należy ręcznie pociąć na odcinki o grubości 0,5-1 mm za pomocą ostrzy o jednej krawędzi.
  7. Ostrożnie przenieś skrawki tkanek do naczynia ze szklanym dnem za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych.
  8. Ostrożnie ustaw sekcję wątroby za pomocą kleszczy, aby spłaszczyła się na dnie.
  9. Przykryj pokrojoną wątróbkę 3-5 kroplami zimnego 1x PBS.
    UWAGA: Barwienie DAPI jest zalecane w celu zidentyfikowania obszaru zainteresowania w niektórych tkankach (np. mózgu)24. Aby zweryfikować kolokalizację czerwonego sygnału mt-Keima z lizosomem, można użyć barwników lizosomalnych, takich jak dextran cascade blue i lysosensor24.
  10. Zobrazuj skrawki tkanek pod mikroskopią konfokalną za pomocą dwóch sekwencyjnych wzbudzeń24. Ustaw dwa kanały obrazowania: "zielony" kanał mt-Keima (wzbudzenie 458 nm, emisja 570-695 nm) i "czerwony" mt-Keima (wzbudzenie 561 nm, emisja 570-695 nm). Zachowaj ustawienia obrazowania między warunkami eksperymentalnymi. Aby uzyskać bardziej wydajne obrazowanie, analizuj dwa zwierzęta jednocześnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykrywanie mitofagii w komórkach ludzkich:

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, ludzkie komórki HeLa poddano transfekcji plazmidem mt-Keima. Zdrowe komórki wykazały dobrze zorganizowaną sieć mitochondrialną (GFP, 488 nm) z niewielką liczbą zdarzeń mitofagii (RFP, 561 nm). Jednakże komórki poddane wstępnemu traktowaniu mitochondrialnym odsprzęgaczem FCCP (30 µM przez 3 h) wykazały znaczny wzrost częstości występowania mitofagii (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładny pomiar mitofagii jest wymagający technicznie. W tym miejscu przedstawiliśmy kilka solidnych technik, które pozwalają zarówno na jakościowe wykrywanie mitofagii, jak i kwantyfikację poziomów mitofagii w najpopularniejszych laboratoryjnych modelach eksperymentalnych.

Aby uzyskać powtarzalne dane, konieczny jest projekt eksperymentalny z co najmniej trzema powtórzeniami biologicznymi. Wszyscy badacze zaangażowani w eksperymenty i analizy muszą być ślepi na eksperymentalną tożsamość grupo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Laboratorium Bohr zawarło umowy CRADA z firmami ChromaDex i GlaxoSmithKline.

Podziękowania

Dziękujemy dr Atsushi Miyawaki i dr Richardowi J. Youle za udostępnienie plazmidu mt-Keima i zintegrowanych komórek Hela mt-Keima. Dziękujemy Raghavendrze A. Shamannie i dr Deborah L. Croteau za krytyczną lekturę manuskryptu. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program NIH (VAB), National Institute on Ageing, a także grant wewnątrzlaboratoryjny NIA na lata 2014-2015 i 2016-2017 (EFF, VAB). EFF był wspierany przez HELSE SOR-OST RHF (nr projektu: 2017056) oraz Norweską Radę ds. Badań Naukowych (nr projektu: 262175).

WKŁAD AUTORA:

EFF zaprojektowała rękopis i przygotowała szkic; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH i ED napisały różne sekcje artykułu; NT, JP, HN i VAB zrewidowały manuskrypt i dostarczyły ekspertyzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mt-Keima myszJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji DNAThermofisher#11668027
Pożywka Opti-MEM (Gibco)Pożywka bez surowicyThermofisher#31985062
plazmid mtEmia: pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
Przeciwciało COXII (mysz)abcam#ab110258
Przeciwciało LAMP2 (królik)NOVUS
kozio-anty-królik o długości fali 568 nm czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568
barwnik kozio-anty-mysz o długości fali 488 nm zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488
barwnik przedłuża złoty środek zapobiegający blaknięciu z DAPIInvitrogen#P36931
Płytka 6-dołkowaSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4-dołkowa szkiełko komoroweTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96-dołkowa płytkaThermofisher#152038
Przeciwciało LC3B królikNOVUS#NB100-2220
DNAProgen Biotechnik#anti-DNA mysie monoklonalne, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI
IN Analizator komórek (czytnik fluorescencyjny)GE Healthcare Nauki przyrodnicze#IN Analizator komórek Mikroskop konfokalny 2200
Eclipse TE-2000eNikon#TE-2000e
Oprogramowanie do kolokalizacjiVolocity#Volocity 6.3alternatywne oprogramowanie Zeiss ZEN 2012
IN Cell Investigator SoftwareGE Healthcare Life Sciences#28408974
pożywka do hodowli komórkowychThermofisher#DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermofisher#15140122
Surowica bydlęca płoduSigma-Aldrich#12003C-1000ML
Inkubator do hodowli komórkowychThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 Inkubator
epifluorescencyjnyZeissZeiss Axio Imager Z2
kameraOlympusOlympus DP71
ZeissZeiss Axio Observer Z1
doZeissZEN 2012
Analiza kolokalizacjiobrazu Image Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
oprogramowanie do analizy statystycznejGraphPad Software Inc., San Diego, USAPakiet oprogramowania GraphPad Prism
materiał do wykonania kilofa ślimakowegoSurepure Chemetals#4655Kilof wykonany jest z drutu o grubości 30 90% platyny 10% irydu
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]Zapytanie materiałowe do Tavernarakis NektariosUtrzymuj transgeniczne zwierzęta w temperaturze 20 stopni Celsjusza; C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]Zapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::RosellaZapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFPZapytanie o materiał do Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed:: LGG-1Zapytanie materiałowe do Tavernarakis Nektarios
Paraquat roztwórpatrz dane uzupełniające do przygotowania
buforu M9patrz dane uzupełniające do przygotowania
buforu M9-lewamizolupatrz dane uzupełniające do przygotowania
Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkoweFisher Scientific#B9992000
Kleszcze chirurgiczneSTERIS Animal Health19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczne
nożyczki chirurgiczneSTERIS Animal Health19-częściowy pakiet do sterylizacji psów Ekonomiczny
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS należy rozcieńczyć do 1x PBS za pomocą
wytrząsarkiFisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Stołowa orbitalna mała wytrząsarka platformowa na otwartym powietrzu Pakiet
2% podkładki agarozowejZobacz dane uzupełniające dotyczące przygotowania
Ostrza VibrosliceŚwiatowe instrumenty precyzyjne#BLADES-2płyta z jednokrawędziowym ostrzem
MSC#788039880,012 cala grubości x 6 cali szerokości x 12 cali długości, blacha ze stali nierdzewnej 430
Triton X-100detergent
Hydrat dichlorku wioligogenu metyluSigma-Aldrich#856177parakwat
Inkubator dla nicieniAQUALYTICInkubator do utrzymania 20 ° C
Stereoskop preparacyjnyOlympusSMZ645
Mikroskop konfokalnyZeissAxioObserver Z1Dla nicieni (krok 2)
mikroskop epifluorescencyjnyZeissAxioImager Z2Dla nicieni (krok 2)
Środek sieciujący UVVilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365Źródło światła UV; 356 nm
#CD107b z płaszczem wodnymMikroskop Mikroskop konfokalny Oprogramowanie konfokalne Oprogramowanie analizy obrazu itp ddH2O metalowa

Bibliografia

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie mitofagiizdrowie mitochondri wmikroskopia konfokalnaplazmid Mito Keimaszczepy C elegansludzkie kom rki HeLatkanka w troby myszytraktowanie parakwatemodsprz gacz FCCPko lokalizacja LAMP2 i COXII
Wykrywanie mitofagii in vitro i in vivo w komórkach ludzkich, C. elegans i myszach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.