Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56302

⸱

4 października 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Streszczenie

Molekuła interakcji zrębowej-1 (STIM1) jest białkiem transbłonowym typu I zlokalizowanym na retikulum endoplazmatycznym (ER) i błonach plazmatycznych (PM). STIM1 rezydent ER reguluje aktywność kanałów PM Orai1 w procesie znanym jako wejście wapnia w magazynie (Ca2 +), które jest głównym procesem sygnalizacyjnym Ca2 +, który napędza odpowiedź immunologiczną. STIM1 ulega potranslacyjnej N-glikozylacji w dwóch luminalnych miejscach Asn w domenie wykrywania Ca2+ cząsteczki. Jednak biochemiczne, biofizyczne i strukturalne efekty biologiczne N-glikozylowanego STIM1 były do niedawna słabo poznane ze względu na niezdolność do łatwego uzyskania wysokich poziomów jednorodnego białka N-glikozylowanego. W tym miejscu opisujemy implementację podejścia chemicznego in vitro, które przyłącza ugrupowania glukozy do określonych miejsc białkowych, co ma zastosowanie do zrozumienia leżącego u podstaw wpływu N-glikozylacji na strukturę i mechanizm białka. Za pomocą roztworowej spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego oceniamy zarówno skuteczność modyfikacji, jak i strukturalne konsekwencje przyłączenia glukozy do pojedynczej próbki. Podejście to można łatwo zaadaptować do badania niezliczonych glikozylowanych białek występujących w przyrodzie.

Wprowadzenie

Store powered calcium (Ca2+) entry (SOCE) jest główną drogą, za pomocą której komórki odpornościowe pobierają Ca2+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do cytozolu. W limfocytach T receptory limfocytów T zlokalizowane na błonie komórkowej (PM) wiążą antygeny, które aktywują białkowe kinazy tyrozynowe (recenzja w 1,2,3). Kaskada fosforylacji prowadzi do aktywacji γ fosfolipazy (PLCγ), która następnie pośredniczy w hydrolizie 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu błonowego (2) do diacyloglicerolu i 1,4,5-trifosforanu inozytolu (IP3). IP3 jest małym dyfuzyjnym przekaźnikiem, który wiąże się z receptorami IP3 (IP3R) na retikulum endoplazmatycznym (ER), otwierając w ten sposób ten kanał receptorowy i umożliwiając Ca2 + spływ w dół gradientu stężeń od światła ER do cytozolu (recenzja w 4). Sygnalizacja receptorowa z receptorów sprzężonych z białkiem G i kinazy tyrozynowej w wielu innych pobudliwych i niepobudliwych typach komórek prowadzi do takiej samej produkcji IP3 i aktywacji IP3Rs.

Ze względu na skończoną pojemność magazynowania Ca2+ ER, uwalnianie za pośrednictwem IP3 i wynikający z tego wzrost cytozolowego Ca2+ jest tylko przejściowe; jednak to wyczerpanie światła ER Ca2+ głęboko wpływa na cząsteczkę interakcji zrębowej-1 (STIM1), białko transbłonowe typu I (TM) najczęściej występujące na błonie ER 5,6,7. STIM1 zawiera zorientowaną na światło domenę detekcyjną Ca2+ składającą się z pary EF-ręka i sterylnego motywu α (EFSAM). Trzy zorientowane cytozolowo domeny zwiniętych cewek są oddzielone od EFSAM pojedynczą domeną TM (przejrzane w 8). Po wyczerpaniu luminalu ER Ca2+, EFSAM ulega oligomeryzacji sprzężonej z destabilizacją 7,9, co powoduje strukturalne przegrupowania domen TM i coiled-coils 10. Kulminacją tych zmian strukturalnych jest uwięzienie STIM1 na skrzyżowaniach ER-PM 11,12,13,14 poprzez interakcje z fosfoinozytydami PM 15,16 i podjednostki Orai1 17,18. Białka Orai1 to podjednostki PM, które łączą się, tworząc kanały Ca2+ 19,20,21,22. Oddziaływania STIM1-Orai1 na połączeniach ER-PM ułatwiają konformację kanału Ca2 + aktywowanego uwalnianiem Ca2 + (CRAC), co umożliwia przemieszczanie się Ca2 + do cytozolu z wysokich stężeń przestrzeni zewnątrzkomórkowej. W komórkach odpornościowych utrzymujące się cytozolowe podwyższenie Ca2 + za pośrednictwem kanałów CRAC indukuje zależną od Ca2 + kalmoduliny / kalcyneuryny defosforylację czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T, który następnie dostaje się do jądra i rozpoczyna regulację transkrypcji genów promujących aktywację komórek T 1,3. Proces aktywacji kanału CRAC przez STIM1 23,24 poprzez indukowane przez agonistę zubożenie luminalu Ca2+ ER i wynikające z tego trwałe podwyższenie cytozolowego Ca2+ jest zbiorczo określane jako SOCE 25. Istotna rola SOCE w limfocytach T jest oczywista w badaniach wykazujących, że dziedziczne mutacje zarówno w STIM1, jak i Orai1 mogą powodować ciężkie złożone zespoły niedoboru odporności 3,19,26,27. EFSAM inicjuje SOCE po wykryciu wyczerpania ER-luminalnego Ca2+ poprzez utratę koordynacji Ca2+ w kanonicznym EF-ręku, co ostatecznie prowadzi do samoasocjacji sprzężonej z destabilizacją 7,28,29.

Glikozylacja to kowalencyjne przyłączanie i przetwarzanie struktur oligosacharydowych, znanych również jako glikany, poprzez różne etapy biosyntezy w ER i Golgiego (przejrzane w 30,32,33). Istnieją dwa dominujące typy glikozylacji u eukariontów: sprzężone z N i O, w zależności od konkretnego aminokwasu i atomu łączącego wiązanie. W N-glikozylacji glikany są przyłączone do amidu łańcucha bocznego Asn i w większości przypadków etap inicjacji występuje w ER, gdy łańcuch polipeptydowy przemieszcza się do światła 34. Pierwszym etapem N-glikozylacji jest przeniesienie struktury rdzeniowej składającej się z czternastu cukrów składającej się z glukozy (Glc), mannozy (Man) i N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) (tj. Glc3Man9GlcNAc2) z lipidu błony ER za pomocą oligosacharylotransferazy 35,36. Dalsze etapy, takie jak rozszczepienie lub przeniesienie reszt glukozy, są katalizowane w ER przez specyficzne glikozydazy i glikozylotransferazy. Niektóre białka, które opuszczają ER i przemieszczają się do Golgiego, mogą być dalej przetwarzane 37. O-glikozylacja odnosi się do dodawania glikanów, zwykle do grupy hydroksylowej łańcucha bocznego reszt Ser lub Thr, a ta modyfikacja zachodzi całkowicie w kompleksie Golgiego 33,34. Istnieje kilka struktur O-glikanów, które mogą składać się z N-acetyloglukozaminy, fukozy, galaktozy i kwasu sjalowego, przy czym każdy monosacharyd dodaje się kolejno 33.

Chociaż żadna konkretna sekwencja nie została zidentyfikowana jako warunek wstępny dla wielu typów O-glikozylacji, wspólna sekwencja konsensusu została powiązana z modyfikacją powiązaną z N: Asn-X-Ser/Thr/Cys, gdzie X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem Pro 33. STIM1 EFSAM zawiera dwa z tych konsensusowych miejsc N-glikozylacji: Asn131-Trp132-Thr133 i Asn171-Thr172-Thr173. Rzeczywiście, poprzednie badania wykazały, że EFSAM może być N-glikozylowany w komórkach ssaków w Asn131 i Asn171 38,39,40,41. Jednak wcześniejsze badania nad konsekwencjami N-glikozylacji na SOCE były niespójne, sugerując stłumiony, wzmocniony lub brak wpływu tej potranslacyjnej modyfikacji na aktywację SOCE 38,39,40,41. W związku z tym badania nad biofizycznymi, biochemicznymi i strukturalnymi konsekwencjami N-glikozylacji EFSAM są niezbędne do zrozumienia regulacyjnych skutków tej modyfikacji. Ze względu na wymóg wysokiego poziomu jednorodnych białek w tych eksperymentach in vitro, zastosowano podejście selektywne miejscowo polegające na kowalencyjnym przyłączaniu ugrupowań glukozy do EFSAM. Co ciekawe, glikozylacja Asn131 i Asn171 spowodowała zmiany strukturalne, które zbiegają się w rdzeniu EFSAM i poprawiają właściwości biofizyczne, które promują SOCE za pośrednictwem STIM1 42.

Chemiczne powiązanie grup glikozylowych z tiolami Cys zostało dobrze potwierdzone przez przełomowe prace, które najpierw wykazały użyteczność tego bezenzymatycznego podejścia do zrozumienia specyficznego dla miejsca wpływu glikozylacji na funkcję białka 43,44. Niedawno, w odniesieniu do STIM1, reszty Asn131 i Asn171 zostały zmutowane do Cys, a glukoza-5-(metanothiosiulfonian) [glukoza-5-(MTS)] została użyta do kowalencyjnego powiązania glukozy z wolnymi tiolami 42. W tym miejscu opisujemy to podejście, które nie tylko wykorzystuje mutagenezę do włączenia specyficznych dla miejsca reszt Cys do modyfikacji, ale także stosuje spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego w roztworze (NMR) do szybkiej oceny zarówno wydajności modyfikacji, jak i zaburzeń strukturalnych w wyniku glikozylacji. Warto zauważyć, że tę ogólną metodologię można łatwo dostosować do badania skutków O- lub N-glikozylacji dowolnego rekombinowanego białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza celowana za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu wprowadzenia Cys do bakteryjnego wektora ekspresyjnego pET-28a.

  1. Wyznaczyć stężenie wektora pET-28a (tzn. dwuniciowego DNA), stosując współczynnik ekstynkcji w ultrafiolecie (UV) wynoszący 0,020 (μg/mL) cm-1 przy 260 nm.
  2. Zsyntetyzować parę komplementarnych starterów mutagennych dla każdej mutacji Cys w taki sposób, aby i) co najmniej 15 nukleotydów było komplementarnych do matrycy przed pierwszym niedopasowaniem zasad i 15 nukleotydów komplementarnych do matrycy po ostatnim niedopasowaniu zasad, ii) całkowita długość startera nie przekraczała 45 nukleotydów oraz iii) guanina lub cytozyna znajdowały się na pierwszej i ostatniej pozycji nukleotydowej każdego startera (Tabela 1). Upewnić się, że synteza starterów została przeprowadzona w skali 0,025 μmol z oczyszczaniem kartridżowym.
  3. Używając polimerazy DNA o wysokiej wierności, przygotować dwie 20 µL mieszaniny reakcyjne PCR: jedną zawierającą starter forward i drugą zawierającą starter reverse. Przygotować każdą mieszaninę tak, aby zawierała końcowe stężenia: 1x bufor PCR z 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM startera, 0,4 μL DMSO, 1,25 ng/μL DNA matrycowego, 0,02 U/μL polimerazy DNA o wysokiej wierności.
  4. Poddać oddzielne mieszaniny cyklowaniu termicznemu zgodnie z protokołem trzyetapowym: 98 °C przez 30 s (denaturacja), 53 - 56 °C przez 30 s (przyłączanie), 72 °C przez 30 s na kilobazę (kb)-1 (elongacja) DNA matrycowego. Powtórzyć program temperaturowy przez 5 cykli i dodać końcowy etap elongacji w 72 °C przez 7,5 min.
  5. Po wstępnej reakcji PCR ze starterami forward i reverse w oddzielnych probówkach, połączyć produkty w jednej probówce (tzn. łącznie 40 μL) i kontynuować reakcję PCR przez kolejne 20 cykli, stosując te same parametry cyklowania, które opisano w kroku 1.4.
  6. Przeprowadzić elektroforezę 15 μL mieszaniny reakcyjnej PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym, używając 0,5x buforu do elektroforezy Tris-kwas octowy-etylenodiaminotetraoctowy (TAE). W ramach kontroli przeprowadzić elektroforezę równoważnej ilości DNA matrycowego, który nie został poddany amplifikacji PCR, oraz alikwotu referencyjnej drabinki DNA zawierającej prążki markerowe większe i mniejsze od oczekiwanej wielkości produktu PCR.
  7. Po elektroforezie przy 120 V przez 40 min zanurzyć żel w wodzie zawierającej 0,5 μg/mL bromku etydyny i wstrząsać przez 30 min w temperaturze pokojowej. Potwierdzić amplifikację pełnej matrycy za pomocą starterów mutagennych poprzez wzrost względnej intensywności fluorescencji bromku etydyny prążka amplifikowanego w porównaniu do kontrolnego prążka matrycy w świetle UV (302 nm).
    1. Jeśli amplifikacja nie jest widoczna, powtórzyć PCR po skorygowaniu temperatury przyłączania w odstępach 0,5 °C w zakresie temperatur 53 - 56 °C.
  8. Po potwierdzeniu amplifikacji matrycy przez startery mutagenne, pozostałe ~25 μL mieszaniny reakcyjnej PCR potraktować enzymem restrykcyjnym DpnI w celu strawienia zmetylowanego DNA matrycowego. Użyć DpnI w ilości 0,5 µL (10 jednostek) na 25 μL mieszaniny reakcyjnej PCR oraz końcowego stężenia 1× buforu do reakcji DpnI. Inkubować przez 2,5 h w 37 °C.
  9. Po strawieniu matrycy dodać ~5 - 10 μL strawionej mieszaniny do 100 µL komórek Esherichia coli DH5α kompetentnych metodą szoku termicznego w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,75 mL. Inkubować mieszaninę komórek i DNA na lodzie przez 60 min.
  10. Poddać mieszaninę komórek i DNA w probówce do mikrocentryfugi szokowi termicznemu w 42 °C przez 45 s na suchym bloku grzejnym. Po inkubacji mieszaniny na lodzie przez 3 min dodać do komórek 900 μL pożywki Luria-Bertani (LB) w temperaturze pokojowej i przenieść całą zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 mL.
  11. Inkubować zawiesinę komórkową w 37 °C przez 90 min przy stałym wstrząsaniu z prędkością 190 rpm.
  12. Następnie przenieść zawiesinę komórkową z powrotem do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,75 mL i wirować przy 10 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  13. Po wirowaniu usunąć 900 μL supernatantu i resuspenderć komórki bakteryjne poprzez delikatne pipetowanie w pozostałych 100 μL LB.
  14. Przenieść otrzymaną skoncentrowaną zawiesinę komórkową na płytkę z agarem LB zawierającą antybiotyk selekcyjny dla wektora ekspresyjnego (tzn. 60 μg/mL kanamycyny). Aseptycznie rozprowadzić zawiesinę równomiernie na płytce z agarem i inkubować przez ~16 h w 37 °C.
  15. Następnego dnia zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki do 5 mL płynnej pożywki LB zawierającej presję selekcyjną antybiotykiem (tzn. 60 μg/mL kanamycyny). Hodować kulturę płynną przez noc w 37 °C przy stałym wstrząsaniu w 37 °C.
  16. Wyizolować i oczyścić namnożony plazmid z komórek E. coli przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu opartego na procedurze lizy alkalicznej 45.
  17. Potwierdzić obecność interesującej mutacji oraz jej poprawną ramkę odczytu poprzez sekwencjonowanie DNA plazmidu metodą Sangera 46.

2. Jednorodna ekspresja białka znakowanego 15N w szczepie BL21 ΔE3 Escherichia coli.

UWAGA: Różne białka rekombinowane wymagają różnych warunków ekspresji. Poniżej przedstawiono zoptymalizowaną procedurę ekspresji ludzkiego białka STIM1 EFSAM.

  1. Przeprowadź transformację wektora ekspresyjnego zawierającego mutacje Cys (tj. pET-28a-EFSAM) do komórek BL21 ΔE3 codon (+) kompetentnych metodą szoku termicznego i wysiej na płytki z agarem LB zawierające odpowiedni antybiotyk selekcyjny zgodnie z opisem w krokach 1.9-1.14), wprowadzając następujące modyfikacje: wysiej bezpośrednio alikwot 150 μL z całkowitej zawiesiny komórkowej o objętości ~1 000 μL na płytkę z agarem LB, bez konieczności zagęszczania komórek w probówce do mikrocentryfugi poprzez wirowanie.
  2. Następnego dnia aseptycznie przenieś pojedynczą kolonię do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 mL zawierającej 20 mL pożywki LB uzupełnionej o odpowiedni antybiotyk (tj. 60 μg/mL kanamycyny dla pET-28a-EFSAM). Inkubuj tę płynną kulturę startową przez noc (tj. ~16 h) w temperaturze 37 °C przy stałym wytrząsaniu z prędkością ~190 rpm.
  3. W tym samym dniu, co w kroku 2.2, przygotuj pożywkę M9 do ekspresji białka znakowanego 15N poprzez autoklawowanie 1 L soli buforowych M9 (tj. 42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8.6 mM NaCl, pH 7.4) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 4 L. Po ochłodzeniu przefiltruj mieszaninę 20% (w/v) D-glukozy, 1 M CaCl2, 1 M tiaminy, 1 M MgSO4, 1 mg/mL biotyny i 0.2 g/mL15N-NH4Cl przez sterylny filtr strzykawkowy 0.2 μm do 1 L sterylnego roztworu soli M9, tak aby końcowe stężenia tych składników wynosiły 0.2% (w/v) D-glukozy, 100 μM CaCl2, 50 μM tiaminy, 1 mM MgSO4, 1 μg/mL biotyny i 1 mg/mL15N-NH4Cl.
  4. Następnego dnia aseptycznie przenieś 20 mL nocnej płynnej kultury startowej do sterylnej probówki stożkowej 50 mL i wiruj przy 2 400 ×g przez 15 min w celu osadzenia komórek.
  5. Po odlaniu pożywki LB, resuspenduj otrzymany osad komórkowy w 10 mL minimalnej pożywki M9 i przenieś resuspendowany osad do 1 L minimalnej pożywki M9 z antybiotykiem (tj. 60 μg/mL kanamycyny).
  6. Hoduj bakterie w 1 L minimalnej pożywki M9 w temperaturze 37 °C przy stałym wytrząsaniu z prędkością ~190 rpm, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie wartość ~0.6-0.8.
  7. Po osiągnięciu określonego zakresu OD600 dodaj 200 μM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), aby indukować ekspresję białka.
  8. Po dodaniu IPTG kontynuuj inkubację komórek w celu ekspresji białka w temperaturze pokojowej przy stałym wytrząsaniu z prędkością ~190 rpm przez ~16 h (tj. przez noc).
  9. Następnego dnia zbierz bakterie poprzez wirowanie przy ~10 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  10. Odlej pożywkę LB i przenieś osad komórkowy do probówki stożkowej 50 mL. Przechowuj osad w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczania.

3. Oczyszczanie białka rekombinowanego z E. coli.

UWAGA: Różne białka rekombinowane wymagają odrębnych procedur oczyszczania. Poniższy protokół dotyczy oczyszczania białka EFSAM z znacznikiem 6×His z ciałek inkluzyjnych eksprimowanych z konstruktu pET-28a.

  1. Zamrożony osad komórek bakteryjnych należy homogenizować ręcznie w 6 M guanidynie-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) i 5 mM β-merkaptoetanolu, używając zmotoryzowanej pipety transferowej o pojemności 10 mL. Na tym etapie należy dodać około 40 mL guanidyny-HCl na każde 5 mL mokrego osadu komórkowego.
  2. Po 90-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej przy stałym obrocie w piecu do hybrydyzacji, odwiruj mieszaninę z prędkością ok. 15 000 ×g, 8 °C przez 40 min w celu odseparowania nierozpuszczalnych szczątków komórkowych (t. j. osad) z mieszaniny białek rozpuszczalnych (tj. supernatantu).
  3. Dodaj 750 µL 50% (v/v) Ni2+– zawiesinę kulek agarozowych z kwasem nitrilotrioctowym do oczyszczonego lizatu i inkubować przez kolejne 90 min w temperaturze pokojowej w inkubatorze obrotowym.
  4. Następnie należy wyizolować białko z oznakowaniem 6×His związaną z Ni2+ poprzez zebranie kulek agarozowych w kolumnie do oczyszczania białek z przepływem grawitacyjnym. Przed przejściem do kroku 3.5 należy pozwolić na całkowity przepływ lizatu przez kolumnę.
  5. Zebrane kuleczki wypłukać trzykrotnie, używając 10 ml roztworu zawierającego 6 M mocznik, 20 mM Tris-HCl pH 8 oraz 5 mM β-merkaptoetanol. Przed każdym kolejnym płukaniem 10 ml należy upewnić się, że cała poprzednia objętość 10 ml przepłynęła przez kolumnę.
  6. Eluuj białka w serii frakcji po 2 ml, wykorzystując bufor zawierający 6 M mocznik, 20 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM imidazol oraz 5 mM β-merkaptoetanol, z zachowaniem 90 s czasu inkubacji między frakcjami. Upewnij się, że cała objętość 2 ml przepłynie przez kolumnę przed każdym kolejnym etapem elucji.
  7. Na tym etapie należy potwierdzić obecność badanego białka w frakcjach elowanych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) z barwieniem błękitem Coomassie, stosując metodę Laemmliego. 47Oceń wielkość, ilość i czystość białka poprzez porównanie z prążkami standardowego markera masy cząsteczkowej, które są odpowiednio mniejsze i większe od oczekiwanej masy cząsteczkowej badanego białka.
  8. Połącz eluowane frakcje białka w membranie dializacyjnej o progu odcięcia masy cząsteczkowej 3 500 Da i inkubuj w 1 L buforu do refoldingu (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl2)2, pH 8) w 4 °C przez noc, podczas mieszania buforu za pomocą mieszadła magnetycznego.
  9. Po około 16 h refoldingu dodać około 1 j. trombiny na mg białka bezpośrednio do worka dializacyjnego i inkubować w 4 °C przez dodatkowe ok. 24 h.
  10. Zweryfikuj stopień odcięcia znacznika 6×His poprzez barwienie Coomassie Blue próbek15 μL alikwoty białka pobrane z worka dializacyjnego przed i po inkubacji z trombiną, które poddano elektroforezie na denaturujących żelach poliakrylamidowych (SDS-PAGE) metodą Laemmliego 47Jeśli zaobserwowano przesunięcie migracji o ok. 2 kDa, odpowiadające masie cząsteczkowej odciętego znacznika 6×His, należy przejść do kroku 3.11; jeśli pozostaje frakcja nieprzetrawionego białka, którą można wykryć za pomocą barwienia błękitem Coomassie, należy dodać ok. 0,2 U trombiny na mg białka bezpośrednio do worka dializacyjnego i inkubować w 4 °C przez dodatkowe ok. 24 h.
  11. W celu dalszego oczyszczania białka należy zastosować chromatografię wykluczania cząsteczek lub chromatografię wymiany jonowej. W przypadku chromatografii wymiany anionowej białka EFSAM, należy wyjąć roztwór białka z worka dializacyjnego i zagęścić go około 10-krotnie, używając wirówkowego koncentratora do ultrafiltracji z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 10 000 Da. Następnie roztwór należy rozcieńczyć około 20-krotnie w buforze bez NaCl (20 mM Tris, 5 mM CaCl2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Urównoważyć wstępnie napełnioną kolumnę do wymiany anionowej, przepuszczając przez nią 10 objętości kolumny buforu bez NaCl, opisanego w kroku 3.11. Równoważenie należy przeprowadzić za pomocą buforu wprowadzonego do strzykawki z końcówką luer-lock, pozbawionej pęcherzyków powietrza, przepychając roztwór przez kolumnę kroplowo i unikając nacisku na strzykawkę, który powodowałby wypływ roztworu w formie ciągłego strumienia. Należy zastosować silny wymieniacz anionowy (np. agarozę sieciowaną z grupami funkcyjnymi czwartorzędowego amonu).
  13. Naniesiony roztwór białka rozcieńczony w buforze bez NaCl (krok 3.11) należy zaaplikować na kolumnę zgodnie z opisem w kroku 3.12.
  14. Eluuj białka w gradiencie [tj. 0–60% (v/v)] rosnącego stężenia buforu NaCl (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl2)2, 1 mM DTT, pH 8) przy użyciu dwupompowego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Należy ustawić system FPLC tak, aby zbierał frakcje o objętości ok. 1–1,5 ml, a profil elucji białka monitorować za pomocą absorbancji UV przy 280 nm, przy prędkości przepływu 0,5 ml/min.
  15. Zidentyfikuj piki elucji i frakcje zawierające białko docelowe oraz określ czystość białka za pomocą żeli SDS-PAGE barwionych błękitem Coomassiego z zastosowaniem metody Laemmliego 47.
  16. Połączyć frakcje wykazujące > 95% (tj. frakcje wykazujące jedynie pojedynczy prążek białkowy na żelach barwionych błękitem Coomassie) przenieść do worka dializacyjnego i poddać wymianie na wybrany bufor eksperymentalny drogą dializy, zgodnie z opisem w kroku 3.8.

4. Chemiczne przyłączenie glukozy-5-MTS do białka metodą dializy.

  1. Przygotować 55 mM roztwór zapasu N-(β-D-glukopiranozyl)-N'-[2-metanotiosulfonylo)etylo]mocznik (glukoza-5-MTS), rozpuszczając 10 mg związku w 500 μl 100% (v/v) DMSO. Niewykorzystaną glukozę-5-MTS rozpuszczoną w DMSO przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować próbkę białka do modyfikacji poprzez dializę 1,5 mL białka o stężeniu ~60 μM przeciwko 1 L buforu do modyfikacji składającego się z 20 mM MOPS, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 oraz 0,1 mM TCEP, pH 8,3. Należy użyć membrany dializacyjnej o progu odcięcia masy cząsteczkowej mniejszym niż rozmiar modyfikowanego białka (np. użyć progu 3 500 Da dla EFSAM o masie ~17 500 Da).
  3. Po 24 h w temperaturze 4 °C przenieść próbkę z worka dializacyjnego do probówki do mikrocentryfugi. Dodać glukozę-5-MTS rozpuszczoną w DMSO do stężenia końcowego 2 mM.
  4. Inkubować próbkę w ciemności przez 1 h w temperaturze pokojowej. W ciągu 1 h inkubacji mieszać roztwór poprzez delikatne opukiwanie probówki co 10 min.
  5. Następnie ponownie wymienić bufor białka na końcowy bufor eksperymentalny niezawierający czynnika redukującego poprzez dializę w temperaturze 4 °C, jak opisano w kroku 4.2, lub poprzez ultrafiltrację odśrodkową. W przypadku procedury ultrafiltracji zagęścić próbkę białka o objętości ~1,5 mL do < 0,5 mL, a następnie rozcieńczyć w tym samym koncentratorze buforem eksperymentalnym. Powtórzyć ten etap zagęszczania i rozcieńczania jeszcze dwa razy, aby całkowita wymiana była co najmniej 30×30×30 = 27 000-krotna. Dla EFSAM jako bufor eksperymentalny stosować 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5.
  6. Przygotować próbkę do spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową poprzez wymianę za pomocą dializy lub ultrafiltracji, odpowiednio zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.5, przeciwko 25 mM wodorowęglanu amonu lub 25 mM octanu amonu. W przypadku stosowania dializy należy upewnić się, że wymiana została przeprowadzona co najmniej trzy razy, aby usunąć wszelkie pozostałości soli NaCl i CaCl2.
  7. Wyznaczyć dokładną masę (tj. ± 1 Da) badanego białka za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową 48,49. Należy oczekiwać, że każde kowalencyjne przyłączenie glukozy do tiolu Cys za pomocą grupy metanotiosulfonianowej zwiększy masę białka o 281,3 Da (tj. dodać 360,4 Da dla glukozy-5-MTS i odjąć 79,1 Da dla odchodzącej grupy CH3SO2 podczas przyłączania kowalencyjnego).

5. Ocena wydajności modyfikacji i zaburzeń strukturalnych przy użyciu NMR w roztworze.

  1. Należy upewnić się, że stężenie zmodyfikowanego białka wynosi > 100 μM po przyłączeniu glukozy i końcowej wymianie buforu. W przypadku EFSAM stężenie białka należy oszacować, stosując współczynnik ekstynkcji UV przy 280 nm równy 1,54 (mg mL-1) cm-1.
  2. Roztwór białka należy uzupełnić o 60 μM kwasu 4,4-dimetylo-4-silapentan-1-sulfonowego (DSS) do shimowania i kalibracji impulsów oraz 10% (v/v) D2O do blokady sygnału (signal lock). Aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu, należy użyć próbek o objętości 600 μL w dopasowanych częstotliwościowo probówkach NMR 5 mm, umieszczonych w spektrometrze o częstotliwości minimum 600 MHz wyposażonym w kriogeniczną sondę potrójnego rezonansu HCN.
  3. Należy zarejestrować standardowe widma 1H-15N HSQC zgodnie z wcześniejszym opisem 50,51, dobierając temperaturę, szerokości skanowania 1H i 15N, ustawienia przejściowe (transients) oraz przyrosty (increments) odpowiednie dla danej próbki. Dla widm EFSAM należy zastosować temperaturę 20 °C, 256 przejściów 1H, 64 przyrosty w wymiarze 15N oraz szerokości skanowania dla 1H i 15N ustalone odpowiednio na 8 000 i 1 800 Hz.
  4. Po akwizycji widma glikozylowanego białka do próbki NMR należy dodać ditiotreitol (DTT) z roztworu stokowego 1 M do stężenia końcowego 15 mM. DTT usuwa resztę glukozy z białka poprzez redukcję wiązania pośredniczonego przez mostek dwusiarczkowy.
  5. Należy zarejestrować drugie widmo 1H-15N HSQC w tych zredukowanych/niemodyfikowanych warunkach, aby uzyskać widmo referencyjne do oceny wydajności modyfikacji oraz perturbacji strukturalnych spowodowanych przyłączeniem glukozy.
  6. Dane NMR należy przetworzyć za pomocą oprogramowania NMRPipe zgodnie z wcześniejszym opisem 52. Przetwarzanie musi obejmować co najmniej konwersję danych, fazowanie, supresję rozpuszczalnika, transformatę Fouriera i wstępną wizualizację widm.
  7. Wydajność modyfikacji należy ocenić poprzez pomiar intensywności pików amidowych i wartości przesunięć chemicznych w widmach zmodyfikowanych i zredukowanych, korzystając z wtyczki NEASY w programie CARA 53. Należy ocenić intensywność piku amidowego Cys zarówno w widmie z przyłączoną glukozą, jak i w widmie zredukowanym. Jeśli piku amidowego Cys nie można wiarygodnie zlokalizować w obu widmach, jako odczyt należy wykorzystać intensywności reszt sąsiadujących z Cys.
  8. Wydajność oblicza się jako intensywność amidu z widma zmodyfikowanego Cys podzieloną przez intensywność amidu z widma zredukowanego Cys (tj. traktowanego DTT), pomnożoną przez 100:
    Równanie wydajności \(Efficiency = \frac{I_M}{I_R} \times 100\); formuła matematyczna., gdzie IM jest intensywnością amidu w widmie zmodyfikowanym Cys, a IR jest intensywnością amidu w widmie zredukowanym Cys. Alternatywnie można ocenić średnią wydajność dla kilku pików amidowych:
    Formuła średniej wydajności: Mean Efficiency = (1/n) Σ od i=1 do n Efficiency_i., gdzie Efficiencyi to osobno wyznaczona wydajność obliczona dla każdej reszty i, a n to całkowita liczba reszt użytych w obliczeniach.
  9. Perturbacje przesunięcia chemicznego (CSP) oblicza się z różnic przesunięć chemicznych między dwoma widmami obserwowanymi w wymiarach 15N i 1H dla każdego piku, normalizując wynik dla większego zakresu przesunięć chemicznych 15N za pomocą następującego równania:
    Formuła CSP: pierwiastek kwadratowy z ΔH² plus (0,14×ΔN)². Koncepcja matematyczna w termodynamice., gdzie ΔH to zmiana w ppm w wymiarze protonowym, a ΔN to zmiana w ppm w wymiarze azotowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwszym krokiem tej metody jest wprowadzenie mutagenezy do kandydujących reszt glikozylacji, zamieniając je na reszty Cys, które mogą być modyfikowane za pomocą glukozy-5-MTS. EFSAM nie posiada naturalnych reszt Cys, więc przed przeprowadzeniem mutagenezy nie trzeba uwzględniać żadnych szczególnych warunków. Jednak naturalne reszty Cys należy najpierw zmienić na niemodyfikowalne reszty przed przeprowadzeniem opisanej chemii. Aby minimalnie wpłynąć na naturalną strukturę, sugerujemy wyko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Glikozylacja białek jest modyfikacją potranslacyjną, w której cukry są kowalencyjnie przyłączone do polipeptydów głównie poprzez wiązania z łańcuchami bocznymi aminokwasów. Aż 50% białek ssaków jest glikozylowanych 54, gdzie glikozylowane białka mogą następnie wywoływać różnorodne efekty, od zmiany powinowactwa wiązania biomolekularnego, wpływu na fałdowanie białek, zmiany aktywności kanałów, kierowania cząsteczek do degradacji i transportu komórkowego, by wymienić tylko kilka (przegląd w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Te badania były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (05239 do P.B.S.), Kanadyjską Fundację Innowacji/Fundusz Badawczy Ontario (do P.B.S.), Fundację Walki z Rakiem Prostaty - Telus Ride for Dad (do P.B.S.) oraz Ontario Graduate Scholarship (do Y.J.C. i N.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA PhusionThermo Fisher ScientificF530SUżyj w kroku 1.3.
Generuler 1kb DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1163Użyj w kroku 1.6.
Enzym restrykcyjny DpnINew England Biolabs, Inc.R0176Użyć w kroku 1.8.
Zestaw plazmidu Presto Mini GeneAid, Inc.PDH300Użyj w kroku 1.16.
BL21 DE3 kodon (+) E. coliAgilent Technologies, Inc.230280Użyj w kroku 2.1.
DH5a E. coliInvitrogen, Inc.18265017Użyj w kroku 1.9.
Filtr strzykawkowy 0,22 mmMillipore, Inc.SLGV033RSUżyj w kroku 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Żywica agarozowaThermo Fisher Scientific88221Użyj w kroku 3.3.
3,500 Da MWCO Rurki do dializyBioDesign, Inc.D306Użyć w krokach 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 i 4.6.
Trombin bydlęcyBioPharm Laboratories, Inc.SKU91-055Użyj w kroku 3.9.
5 ml kolumny wymiennika anionowego HiTrap Q FFGE Healthcare, Inc.17-5156-01Użyj w kroku 3.11.
Glukoza-5-MTSToronto Research Chemicals, Inc.G441000Użyj w kroku 4.1.
Koncentratory odśrodkowe do ultrafiltracji Vivaspin 20Sartorius, Inc.VS2001Użyj w krokach 3.11, 4.2, 4.5 i 4.6.
PageRuler Niebarwiona szeroka drabinka białkowaThermo Fisher Scientific26630Zastosowanie w krokach 3.7, 3.10 i 3.15
Kolumna wymiany anionowej HiTrap Q FFGE Healthcare, Inc.17-5053-01Użyj w kroku 3.12.
chromatografii cieczowej AKTA Pure Fast ProteinGE Healthcare, Inc.29018224Użyj w kroku 3.14.
Spektrometr NMR Varian Inova 600 MHzAgilent Technologies, Inc.Użyj w krokach 5.2 i 5.5.
System

Bibliografia

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), Epub 2005 May 2002 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L. Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. Agostinis, P., Afshin, S. , Bristol-Myers Squibb. Syracuse, NY. 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modyfikacja grup tiolowych cysteinyglikozylowanie in vitromutogeneza bia ekanaliza NMR w roztworzespektrometria mas z jonizacj elektrosprayoczyszczanie bia ekchromatografia powinowactwa ze streptawidynchromatografia wymiany anionowejocena biologii strukturalnej
Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.