In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) są ważnym ogniwem między wrodzonym i adaptacyjnym układem odpornościowym. Jako komórki prezentujące antygen (APC) mogą komunikować się z limfocytami zarówno poprzez prezentację antygenu, jak i uwalnianie cytokin^1,2,3. Jednak jako profesjonalne fagocyty, ich podstawową funkcją jest usuwanie patogenów, starzejących się komórek i resztek komórkowych^1,4. Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) znaczne ilości mieliny są generowane z umierających oligodendrocytów, typu komórek odpowiedzialnych za mielinizację aksonów OUN⁵. My i inni wykazaliśmy, że usuwanie resztek mieliny jest przede wszystkim odpowiedzialne za infiltrację BMDMs^5,6,7. Sugeruje się jednak, że w obrębie miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego pochłonięcie resztek mieliny przesuwa te normalnie przeciwzapalne komórki w stan prozapalny^5,8,9. Jako kluczowe mediatory zapalenia układu nerwowego w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, BMDM są ważnymi celami klinicznymi.

Aby pomóc w zbadaniu wpływu BMDM na uszkodzony rdzeń kręgowy, opracowaliśmy model in vitro, aby bezpośrednio badać, jak BMDM reagują na resztki mieliny. Aby poprawić znaczenie biologiczne, w badaniach tych wykorzystuje się zarówno pierwotne mysie BMDM, jak i świeżo wyizolowane szczątki mieliny. W związku z tym przedstawione tutaj metody szczegółowo opisują również izolację i hodowlę pierwotnych mysich BMDM oraz zmodyfikowaną technikę gradientu sacharozy stosowaną do izolowania resztek mieliny pochodzących z mysich OUN ^10,11,12. Szczątki mieliny można łatwo oznaczyć barwnikiem fluorescencyjnym, estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), w celu śledzenia jej internalizacji przez BMDM. CFSE dobrze nadaje się do tego zastosowania, ponieważ nie jest cytotoksyczny, a jego wąskie spektrum fluorescencyjne pozwala na multipleksowanie z innymi sondami fluorescencyjnymi^13,14. Po fagocytozie lipidy resztki mieliny są transportowane przez lizosomy i pakowane jako obojętne lipidy w wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów⁵. Aby określić ilościowo tę wewnątrzkomórkową akumulację lipidów, przedstawiamy metodę barwienia czerwienią olejową O (ORO) zoptymalizowaną pod kątem ilościowej analizy obrazu. Ta prosta metoda barwienia daje solidne, powtarzalne wyniki i kwantyfikację¹⁵. Metody te ułatwiają badanie fagocytozy resztek mieliny i retencji lipidów przy użyciu ograniczonego specjalistycznego sprzętu.

Metody opisane tutaj i w sekcji 2 zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Florydy (IACUC) i są zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8. Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tym protokole są trzymane w dedykowanym pomieszczeniu dla zwierząt laboratoryjnych do czasu wykorzystania. Nie przeprowadzono żadnych eksperymentów in vivo przed uśmierceniem. Liczebność zwierząt oparto na potrzebach eksperymentalnych, wykorzystując średnie zbiory komórek i mieliny jako wskazówkę w celu zminimalizowania użycia.

UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) (Sekcja 1), przygotowanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu (Sekcja 2), ogólną procedurę analizy fagocytozy resztek mieliny (Sekcja 3) oraz ogólną procedurę analizy akumulacji lipidów w resztkach mieliny (Sekcja 4). Przygotowanie odczynników, pobieranie i manipulowanie komórkami, pobieranie i znakowanie mieliny oraz wykonywanie testów powinny być zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza.

1. Wytwarzanie pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

1. Przygotowanie kompletnej pożywki do hodowli makrofagów (CMCM)
   UWAGA: Wytwarzanie makrofagów ze szpiku kostnego wymaga użycia czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Preparat ten wykorzystuje pożywkę kondycjonowaną mysimi fibroblastami L929 jako źródło M-CSF.
   1. Wytwarzaj mysie pożywki kondycjonowane fibroblastami L929 poprzez hodowlę komórek w 145 mm szalkach z 50 ml wysokiej glukozy (4500 mg / L glukozy) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 5% surowicą nowonarodzonych cieląt (NCS) i penicyliną/streptomycyną przez 7 dni.
   2. Zebrać pożywkę z kultur do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 3500 x g, 4 °C.
   3. Przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kondycjonowane media można przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
   4. Do DMEM o wysokim poziomie glukozy dodaj 5% obj. / obj. NCS, 15% obj. / obj. L929 mysiego fibroblastu kondycjonowanego DMEM i 1% penicyliny / streptomycyny. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące. Przed użyciem podgrzać do 37 °C.
2. Pobieranie pierwotnych komórek szpiku kostnego i indukcja makrofagów
   nuta: Korzystając z tego protokołu, jedna mysz wygeneruje około 20 milionów makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).
   1. Poddaj eutanazji pożądaną liczbę myszy w wieku 8-10 tygodni, stosując standardowe wytyczne dotyczące uduszenia CO₂, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
   2. Zdezynfekuj zwierzę za pomocą 70% (obj./obj.) etanolu:H₂O, nasycając futro.
   3. Wytnij mały otwór w jamie brzusznej i ostrożnie odciągnij skórę, aby odsłonić znajdującą się pod spodem tkankę. Uważaj, aby nie przebić jamy otrzewnej.
   4. Usuń obie tylne nogi, zaczynając od biodra i kończąc na kostce. Umieść pobraną tkankę na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną.
      nuta: Podczas przetwarzania kilku zwierząt upewnij się, że naczynia są na lodzie, aby ograniczyć degradację tkanek.
   5. Usuń mięśnie i tkankę łączną z kości za pomocą skalpela. Tylko kość udowa i piszczelowa są używane do pobierania komórek, kość strzałkową można wyrzucić.
   6. Odsłoń jamę szpikową pobranych kości, przycinając niewielką część z każdego końca skalpelem.
   7. Za pomocą igły o wadze 25 g przepłukać jamy szpiku za pomocą CMCM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kości będą wydawały się białe, gdy zostaną wystarczająco zarumienione.
   8. Po zakończeniu zbierania mieszadło zasysa igłą 18 g przez 30-90 s, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.
      nuta: W tym momencie można przeprowadzić opcjonalny etap lizy krwinek czerwonych (RBC). Ostatnio zasugerowano, że wewnątrzkomórkowa zawartość żelaza może wpływać na wpływ resztek mieliny na polaryzację makrofagów¹⁶. Aby uzyskać informacje na temat włączenia etapu lizy RBC, patrz Trouplin i wsp. ¹⁷.
   9. Przefiltruj zawiesinę przez sitko sterylne o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   10. Nasiona zebrały komórki równomiernie do 145 mm szalek do hodowli komórkowych zawierających 15-20 ml CMCM. Użyj około trzech naczyń hodowlanych na każdą ofiarowaną mysz. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   11. Po 72 godzinach umyj płytki sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki, a następnie dodaj 15-20 ml świeżego CMCM. Inkubować kultury przez dodatkowe 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Po 7 dniach całkowitej hodowli, początkowo wyizolowane krwiotwórcze komórki szpiku kostnego będą dojrzałymi BMDM (Ryc. 1).

2. Wytwarzanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu

UWAGA: Wszystkie odczynniki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

1. Przygotowanie odczynników do zbierania resztek mieliny
   1. Przygotować roztwór buforowy Tris·Cl.
      1. Do 800 ml destylowanego dejonizowanego H₂O (ddiH₂O) dodać 20 ml 1 M Tris·Cl, pH 7,45 (20 mM stężenie końcowe) i 20 ml 100 mM Na₂EDTA (2 mM stężenie końcowe).
      2. Dostosuj pH do 7,45. Dostosuj objętość do 1000 ml za pomocą ddiH₂O. Roztwór filtrujący przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.
   2. Przygotować 1 M roztwór sacharozy.
      1. Do 100 ml roztworu buforowego Tris·Cl dodać 68,46 g sacharozy. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl. Roztwór filtracyjny przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.
   3. Przygotować 200 ml 0,32 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (vol/vol).
   4. Przygotować 150 ml 0,83 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (obj./obj.).
2. Zbieranie surowych szczątków mieliny pochodzących z mózgu
   nuta: Opisana tutaj metoda zbierania służy do izolacji surowych szczątków mieliny.
   1. Poddaj eutanazji 10-12 myszy w wieku 8-10 tygodni przy użyciu standardowych wytycznych dotyczących uduszenia CO₂, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
   2. Wypreparuj mózgi i umieść je w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 10 ml 0,32 M roztworu sacharozy. Trzymaj danie na lodzie.
   3. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych pokrój mózg na kawałki o wielkości około 5^mm3.
   4. Przenieść tkankę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać około 30 ml 0,32 M roztworu sacharozy.
   5. Homogenizować za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego, aż do uzyskania gładkiego roztworu.
   6. Rozcieńczyć homogenizowane mózgi do końcowej objętości 90 ml 0,32 M roztworem sacharozy.
   7. Do sześciu cienkościennych probówek ultrawirówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml dodaj 20 ml 0,83 M roztworu sacharozy.
   8. Delikatnie dodać homogenizowany roztwór mózgu do wierzchu 0,83 M roztworu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać dwóch warstw.
   9. Zrównoważyć każdą probówkę 0,32 M roztworem sacharozy.
   10. Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirnika na ich minimalne wartości, aby zmniejszyć utratę resztek mieliny.
   11. Zbierz resztki mieliny z granicy faz dwóch gęstości sacharozy.
       UWAGA: Zanieczyszczenia powinny pojawiać się jako biały pasek w kierunku środka rury.
   12. Połączyć surowe resztki mieliny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dostosować objętość do około 35 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl.
   13. Homogenizuj surowe resztki mieliny za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego przez 30-60 s.
   14. Równomiernie podzielić zawiesinę między 6 czystych probówek ultrawirówek i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.
   15. Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.
   16. Ponieważ stałe białe granulki będą teraz widoczne, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osadki w 10-15 ml roztworu buforowego Tris·Cl.
   17. Równomiernie podzielić zawiesinę między 2 czyste probówki ultrawirówki i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.
   18. Ponownie odwirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, używając odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.
   19. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 5-6 ml sterylnego PBS i podzielić zawiesinę między odpowiednią liczbę wstępnie zważonych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   20. Wirować przy 22 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   21. Odrzucić supernatant i określić masę osadków mieliny.
   22. Ponownie zawiesić granulki w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml.
       UWAGA: Dziesięć do dwunastu mózgów wystarcza do wytworzenia 10-15 ml resztek mieliny o stężeniu 100 mg/mL. Resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
3. Etykietowanie fluorescencyjne resztek mieliny
   1. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór 50 μM estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE).
      1. Używając sterylnego PBS, rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy CFSE przygotowany ze 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia roboczego 50 μM.
      2. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
   2. Rozmrozić żądaną ilość resztek mieliny 100 mg/ml i ponownie zawiesić sterylną igłą 29 g.
      UWAGA: Zamrożenie resztek mieliny spowoduje, że wypadnie ona z roztworu, co wymaga ponownego zamieszania przed użyciem.
   3. Przenieś resztki mieliny do wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   4. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
   5. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 μl roztworu CFSE na 100 μl granulowanych szczątków mieliny.
   6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.
   7. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   8. Zawiesić osad w 600-800 μl buforu do przemywania (filtr 0,2 μm wysterylizowany 100 mM glicyny w PBS).
   9. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   10. Powtórz kroki 2.3.8-2.3.9 jeszcze dwa razy.
   11. Po ostatnim przemyciu określić masę osadu resztek mieliny i ponownie zawiesić do 100 mg/ml za pomocą sterylnego PBS.
       Uwaga: Oznaczone resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.

3. Test fagocytozy szczątków mieliny

UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji fagocytozy fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.

1. Przygotowanie płytek zabiegowych
   1. Na każdą płytkę o średnicy 145 mm zebrać dojrzałe BMDM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, używając 5-6 ml 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (dPBS) (pH 7,4) firmy Dulbecco.
      nuta: Nie należy stosować trypsyny, ponieważ może ona zmienić stan aktywacji komórek¹⁸.
   2. Dodaj równą objętość wstępnie podgrzanego CMCM do każdej probówki z zebranymi komórkami.
   3. Wirować przy 180 x g przez 8 minut w temperaturze 20 °C. Odrzucić supernatant.
   4. Ponownie zawieś komórki w CMCM i zlicz.
   5. Do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dodać 1x10⁵ komórek w 1 ml CMCM.
   6. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny.
2. Oczyszczanie i analiza resztek mieliny
   1. Dodaj 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny znakowanych CFSE do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).
   2. Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niepochłonięte resztki mieliny.
   4. Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS.
   6. Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
   7. Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.
   8. Dodaj 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris do każdego dołka, aby zmniejszyć fotowybielanie.
   9. Obrazowanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.
      nuta: Długości fal wzbudzenia i emisji CFSE wynoszą odpowiednio 494 nm i 521 nm.
   10. Podziel liczbę komórek CFSE dodatnich przez liczbę jąder, aby określić względny wychwyt resztek mieliny.
   11. Przed przystąpieniem do obrazowania płytki należy przechowywać do 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

4. Kwantyfikacja lipidów wewnątrzkomórkowych za pomocą barwienia olejem Red-O

UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji wewnątrzkomórkowych lipidów pochodzących z resztek mieliny. Stosowanie resztek mieliny znakowanych CFSE nie jest zalecane do fluorescencyjnej kwantyfikacji barwienia ORO ze względu na nakładanie się widma. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.

1. Przygotowanie roztworów barwiących
   1. Przygotować 0,5% roztwór barwiący Oil Red-O (ORO).
      1. Powoli dodawać 100 ml 100% glikolu propylenowego (1,2-propanodiolu) do 0,5 g ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol), mieszając.
      2. Podgrzewać roztwór w temperaturze 95 °C przez 15 minut lub do momentu, gdy wszystkie duże cząstki się rozpuszczą.
         UWAGA: Nie podgrzewać powyżej 100 °C.
      3. Przefiltruj roztwór przez kawałek bibuły filtracyjnej, będąc jeszcze ciepłym, do nowego pojemnika.
      4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór można przechowywać do 1 roku w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotować 85% roztwór glikolu propylenowego.
      1. Dodaj 85 ml 100% glikolu propylenowego do 15 ml ddiH₂O. Mieszaj, aż się wymieszają. Roztwór może być przechowywany przez okres do 1 roku w RT.
2. Przygotowanie płytek zabiegowych
   1. Przygotować płytkę 24-dołkową zgodnie z metodą opisaną w sekcji 3.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 24 godziny.
3. Leczenie resztek mieliny
   1. Dodać 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).
   2. Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niestrawione resztki mieliny.
      Uwaga: W tym momencie płytki mogą zostać poddane natychmiastowemu utrwaleniu lub można dodać nowy CMCM, a komórki powrócić do inkubacji w celu uzyskania dodatkowych punktów czasowych.
   4. Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS, a następnie poddaj barwieniu.
4. Barwienie i analiza ORO
   1. Umyć płytkę stałą 3 razy za pomocą ddiH₂O.
   2. Dodać 400 μl 100% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zmniejszy to przenoszenie ddiH₂O.
   3. Odessać glikol propylenowy i dodać 400 μl roztworu ORO do każdej studzienki.
   4. Inkubować przez 8 minut w temperaturze 60 °C.
   5. Zassać roztwór ORO. Następnie dodaj 400 μl 85% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Umyj płytkę 3 razy za pomocą ddiH₂O.
   7. Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   8. Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.
   9. Do każdego dołka dodać 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris.
   10. Obrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. ORO można obrazować przy użyciu standardowego zestawu filtrów Texas Red lub DsRed.
   11. Określ ilościowo względną retencję lipidów, określając obszar dodatni ORO w każdym polu obrazu i dzieląc go przez liczbę jąder.
   12. Płytki należy przechowywać przez 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

Leczenie BMDM resztkami mieliny znakowanymi CFSE powinno przynieść wyraźną internalizację (Rysunek 2). Podczas gdy 3-godzinny czas interakcji jest wystarczający, aby BMDM fagocytozą fagocytozą wystarczającą ilość dodanych resztek mieliny w celu solidnego wykrywania w dalszej kolejności, akumulację wewnątrzkomórkową można zaobserwować już po 1 godzinie interakcji. Jednak niektóre resztki mieliny mogą być nadal obecne na powierzchni komórki po umyciu. Może to być spowodowane niewystarczającym myciem lub cząsteczkami, które nie są w pełni internalizowane we wczesnych stadiach fagocytozy.

Chociaż BMDM mogą szybko internalizować resztki mieliny, przetwarzanie lizosomalne jest wymagane zanim powstaną plamiste kropelki lipidów OR. Aby to zademonstrować, BMDM inkubowano z resztkami mieliny przez 90 minut, myto i hodowano przez dodatkowy czas przed utrwaleniem i barwieniem (Ryc. 3). Rysunek 4 pokazuje, że występuje opóźnienie między rozpoczęciem leczenia a neutralnym pojawieniem się lipidów. Należy również zauważyć, że retencja lipidów nie jest stabilna podczas hodowli. BMDM zaczną metabolizować nagromadzone lipidy wkrótce po utworzeniu kropelki. W związku z tym zalecamy odczekanie nie dłużej niż 24 godziny między zmyciem niepochłoniętych resztek mieliny a utrwaleniem.

Kwantyfikacja obszaru barwionego ORO pokazuje tempo metabolizmu lipidów mielinowych w BMDM (Rysunek 5). Po 90-minutowym okresie interakcji komórki powrócono do inkubacji w świeżym CMCM. We wczesnym okresie pościgu w świeżej pożywce BMDM metabolizują składnik lipidowy fagocytozowanych resztek mieliny do neutralnych lipidów barwiących OR. Stały wzrost obszaru dodatniego ORO jest typowy w ciągu kilku godzin po interakcji. Jednak po 24 godzinach BMDM wypłyną lub zmetabolizują znaczną część wewnątrzkomórkowych lipidów.

Rysunek 1: Reprezentatywne kultury BMDM. Początkowo zaobserwuje się kilka przylegających komórek. W 3 dniu usuwa się wszelkie nieprzylegające komórki. Do 7 dnia obserwuje się dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego. Skala = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy testu fagocytozy szczątków mieliny BMDM. Komórki traktowano resztkami mieliny znakowanymi 1 mg / ml CFSE przez 1 godzinę przed myciem i utrwalaniem 4% PFA. Zinternalizowane szczątki mieliny można wizualizować za pomocą standardowych zestawów filtrów GFP na mikroskopie zdolnym do epifluorescencji. Skala = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat eksperymentalnego projektu Oil Red O (ORO). BMDM traktuje się resztkami mieliny o stężeniu 1 mg/ml (rozcieńczenie 1:100) przez 90 minut, a następnie myje i hoduje w świeżej pożywce przed utrwaleniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Barwienie ORO BMDM po fagocytozie resztek mieliny. Po utrwaleniu z 4% PFA we wskazanych punktach czasowych, BMDM wybarwiono ORO i Hoechst 33258. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy dla każdego punktu czasowego. Skala = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ilościowa analiza obrazu barwienia ORO. W celu ilościowego określenia barwienia ORO 3 dołki zobrazowano z prędkością 20X po 5 obrazów na dołek. Wszystkie ustawienia akwizycji obrazu były identyczne. Słupki błędów = SEM. (n=3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.