Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56322

⸱

30 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

Streszczenie

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) to dojrzałe leukocyty, które pełnią kluczową rolę fizjologiczną jako profesjonalne fagocyty zdolne do usuwania różnych cząstek. Zwykle BMDM są ograniczone do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ale po urazie mogą łatwo infiltrować. Po dotarciu do uszkodzonej tkanki OUN BMDM są podstawowym typem komórek odpowiedzialnym za usuwanie resztek komórkowych pochodzących z urazu, w tym dużych ilości bogatych w lipidy resztek mieliny. Neuropatologiczne konsekwencje naciekania BMDM i fagocytozy resztek mieliny w obrębie OUN są złożone i nie są dobrze poznane. Opisane tutaj protokoły pozwalają na bezpośrednie badanie in vitro BMDM w kontekście uszkodzenia OUN. Zajmujemy się izolacją i hodowlą mysiego BMDM, przygotowaniem resztek mieliny oraz testami oceniającymi fagocytozę szczątków mieliny BMDM. Techniki te dają solidne, wymierne wyniki bez konieczności stosowania znacznego specjalistycznego sprzętu lub materiałów, a mimo to można je łatwo dostosować do potrzeb badaczy.

Wprowadzenie

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) są ważnym ogniwem między wrodzonym i adaptacyjnym układem odpornościowym. Jako komórki prezentujące antygen (APC) mogą komunikować się z limfocytami zarówno poprzez prezentację antygenu, jak i uwalnianie cytokin1,2,3. Jednak jako profesjonalne fagocyty, ich podstawową funkcją jest usuwanie patogenów, starzejących się komórek i resztek komórkowych1,4. Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) znaczne ilości mieliny są generowane z umierających oligodendrocytów, typu komórek odpowiedzialnych za mielinizację aksonów OUN5. My i inni wykazaliśmy, że usuwanie resztek mieliny jest przede wszystkim odpowiedzialne za infiltrację BMDMs5,6,7. Sugeruje się jednak, że w obrębie miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego pochłonięcie resztek mieliny przesuwa te normalnie przeciwzapalne komórki w stan prozapalny5,8,9. Jako kluczowe mediatory zapalenia układu nerwowego w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, BMDM są ważnymi celami klinicznymi.

Aby pomóc w zbadaniu wpływu BMDM na uszkodzony rdzeń kręgowy, opracowaliśmy model in vitro, aby bezpośrednio badać, jak BMDM reagują na resztki mieliny. Aby poprawić znaczenie biologiczne, w badaniach tych wykorzystuje się zarówno pierwotne mysie BMDM, jak i świeżo wyizolowane szczątki mieliny. W związku z tym przedstawione tutaj metody szczegółowo opisują również izolację i hodowlę pierwotnych mysich BMDM oraz zmodyfikowaną technikę gradientu sacharozy stosowaną do izolowania resztek mieliny pochodzących z mysich OUN 10,11,12. Szczątki mieliny można łatwo oznaczyć barwnikiem fluorescencyjnym, estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), w celu śledzenia jej internalizacji przez BMDM. CFSE dobrze nadaje się do tego zastosowania, ponieważ nie jest cytotoksyczny, a jego wąskie spektrum fluorescencyjne pozwala na multipleksowanie z innymi sondami fluorescencyjnymi13,14. Po fagocytozie lipidy resztki mieliny są transportowane przez lizosomy i pakowane jako obojętne lipidy w wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów5. Aby określić ilościowo tę wewnątrzkomórkową akumulację lipidów, przedstawiamy metodę barwienia czerwienią olejową O (ORO) zoptymalizowaną pod kątem ilościowej analizy obrazu. Ta prosta metoda barwienia daje solidne, powtarzalne wyniki i kwantyfikację15. Metody te ułatwiają badanie fagocytozy resztek mieliny i retencji lipidów przy użyciu ograniczonego specjalistycznego sprzętu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Metody opisane tutaj i w sekcji 2 zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Florydy (IACUC) i są zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8. Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tym protokole są trzymane w dedykowanym pomieszczeniu dla zwierząt laboratoryjnych do czasu wykorzystania. Nie przeprowadzono żadnych eksperymentów in vivo przed uśmierceniem. Liczebność zwierząt oparto na potrzebach eksperymentalnych, wykorzystując średnie zbiory komórek i mieliny jako wskazówkę w celu zminimalizowania użycia.

UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) (Sekcja 1), przygotowanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu (Sekcja 2), ogólną procedurę analizy fagocytozy resztek mieliny (Sekcja 3) oraz ogólną procedurę analizy akumulacji lipidów w resztkach mieliny (Sekcja 4). Przygotowanie odczynników, pobieranie i manipulowanie komórkami, pobieranie i znakowanie mieliny oraz wykonywanie testów powinny być zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza.

1. Wytwarzanie pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

  1. Przygotowanie kompletnej pożywki do hodowli makrofagów (CMCM)
    UWAGA:     Wytwarzanie makrofagów ze szpiku kostnego wymaga użycia czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Preparat ten wykorzystuje pożywkę kondycjonowaną mysimi fibroblastami L929 jako źródło M-CSF.
    1. Wytwarzaj mysie pożywki kondycjonowane fibroblastami L929 poprzez hodowlę komórek w 145 mm szalkach z 50 ml wysokiej glukozy (4500 mg / L glukozy) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 5% surowicą nowonarodzonych cieląt (NCS) i penicyliną/streptomycyną przez 7 dni.
    2. Zebrać pożywkę z kultur do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 3500 x g, 4 °C.
    3. Przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kondycjonowane media można przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
    4. Do DMEM o wysokim poziomie glukozy dodaj 5% obj. / obj. NCS, 15% obj. / obj. L929 mysiego fibroblastu kondycjonowanego DMEM i 1% penicyliny / streptomycyny. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące. Przed użyciem podgrzać do 37 °C.
  2. Pobieranie pierwotnych komórek szpiku kostnego i indukcja makrofagów
    nuta: Korzystając z tego protokołu, jedna mysz wygeneruje około 20 milionów makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).
    1. Poddaj eutanazji pożądaną liczbę myszy w wieku 8-10 tygodni, stosując standardowe wytyczne dotyczące uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
    2. Zdezynfekuj zwierzę za pomocą 70% (obj./obj.) etanolu:H2O, nasycając futro.
    3. Wytnij mały otwór w jamie brzusznej i ostrożnie odciągnij skórę, aby odsłonić znajdującą się pod spodem tkankę. Uważaj, aby nie przebić jamy otrzewnej.
    4. Usuń obie tylne nogi, zaczynając od biodra i kończąc na kostce. Umieść pobraną tkankę na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną.
      nuta: Podczas przetwarzania kilku zwierząt upewnij się, że naczynia są na lodzie, aby ograniczyć degradację tkanek.
    5. Usuń mięśnie i tkankę łączną z kości za pomocą skalpela. Tylko kość udowa i piszczelowa są używane do pobierania komórek, kość strzałkową można wyrzucić.
    6. Odsłoń jamę szpikową pobranych kości, przycinając niewielką część z każdego końca skalpelem.
    7. Za pomocą igły o wadze 25 g przepłukać jamy szpiku za pomocą CMCM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kości będą wydawały się białe, gdy zostaną wystarczająco zarumienione.
    8. Po zakończeniu zbierania mieszadło zasysa igłą 18 g przez 30-90 s, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.
      nuta: W tym momencie można przeprowadzić opcjonalny etap lizy krwinek czerwonych (RBC). Ostatnio zasugerowano, że wewnątrzkomórkowa zawartość żelaza może wpływać na wpływ resztek mieliny na polaryzację makrofagów16. Aby uzyskać informacje na temat włączenia etapu lizy RBC, patrz Trouplin i wsp. 17.
    9. Przefiltruj zawiesinę przez sitko sterylne o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    10. Nasiona zebrały komórki równomiernie do 145 mm szalek do hodowli komórkowych zawierających 15-20 ml CMCM. Użyj około trzech naczyń hodowlanych na każdą ofiarowaną mysz. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    11. Po 72 godzinach umyj płytki sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki, a następnie dodaj 15-20 ml świeżego CMCM. Inkubować kultury przez dodatkowe 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 7 dniach całkowitej hodowli, początkowo wyizolowane krwiotwórcze komórki szpiku kostnego będą dojrzałymi BMDM (Ryc. 1).

2. Wytwarzanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu

UWAGA: Wszystkie odczynniki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

  1. Przygotowanie odczynników do zbierania resztek mieliny
    1. Przygotować roztwór buforowy Tris·Cl.
      1. Do 800 ml destylowanego dejonizowanego H2O (ddiH2O) dodać 20 ml 1 M Tris·Cl, pH 7,45 (20 mM stężenie końcowe) i 20 ml 100 mM Na2EDTA (2 mM stężenie końcowe).
      2. Dostosuj pH do 7,45. Dostosuj objętość do 1000 ml za pomocą ddiH2O. Roztwór filtrujący przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.
    2. Przygotować 1 M roztwór sacharozy.
      1. Do 100 ml roztworu buforowego Tris·Cl dodać 68,46 g sacharozy. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl. Roztwór filtracyjny przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.
    3. Przygotować 200 ml 0,32 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (vol/vol).
    4. Przygotować 150 ml 0,83 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (obj./obj.).
  2. Zbieranie surowych szczątków mieliny pochodzących z mózgu
    nuta: Opisana tutaj metoda zbierania służy do izolacji surowych szczątków mieliny.
    1. Poddaj eutanazji 10-12 myszy w wieku 8-10 tygodni przy użyciu standardowych wytycznych dotyczących uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
    2. Wypreparuj mózgi i umieść je w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 10 ml 0,32 M roztworu sacharozy. Trzymaj danie na lodzie.
    3. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych pokrój mózg na kawałki o wielkości około 5mm3.
    4. Przenieść tkankę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać około 30 ml 0,32 M roztworu sacharozy.
    5. Homogenizować za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego, aż do uzyskania gładkiego roztworu.
    6. Rozcieńczyć homogenizowane mózgi do końcowej objętości 90 ml 0,32 M roztworem sacharozy.
    7. Do sześciu cienkościennych probówek ultrawirówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml dodaj 20 ml 0,83 M roztworu sacharozy.
    8. Delikatnie dodać homogenizowany roztwór mózgu do wierzchu 0,83 M roztworu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać dwóch warstw.
    9. Zrównoważyć każdą probówkę 0,32 M roztworem sacharozy.
    10. Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirnika na ich minimalne wartości, aby zmniejszyć utratę resztek mieliny.
    11. Zbierz resztki mieliny z granicy faz dwóch gęstości sacharozy.
      UWAGA: Zanieczyszczenia powinny pojawiać się jako biały pasek w kierunku środka rury.
    12. Połączyć surowe resztki mieliny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dostosować objętość do około 35 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl.
    13. Homogenizuj surowe resztki mieliny za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego przez 30-60 s.
    14. Równomiernie podzielić zawiesinę między 6 czystych probówek ultrawirówek i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.
    15. Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.
    16. Ponieważ stałe białe granulki będą teraz widoczne, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osadki w 10-15 ml roztworu buforowego Tris·Cl.
    17. Równomiernie podzielić zawiesinę między 2 czyste probówki ultrawirówki i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.
    18. Ponownie odwirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, używając odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.
    19. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 5-6 ml sterylnego PBS i podzielić zawiesinę między odpowiednią liczbę wstępnie zważonych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    20. Wirować przy 22 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    21. Odrzucić supernatant i określić masę osadków mieliny.
    22. Ponownie zawiesić granulki w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml.
      UWAGA: Dziesięć do dwunastu mózgów wystarcza do wytworzenia 10-15 ml resztek mieliny o stężeniu 100 mg/mL. Resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
  3. Etykietowanie fluorescencyjne resztek mieliny
    1. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór 50 μM estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE).
      1. Używając sterylnego PBS, rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy CFSE przygotowany ze 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia roboczego 50 μM.
      2. Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    2. Rozmrozić żądaną ilość resztek mieliny 100 mg/ml i ponownie zawiesić sterylną igłą 29 g.
      UWAGA: Zamrożenie resztek mieliny spowoduje, że wypadnie ona z roztworu, co wymaga ponownego zamieszania przed użyciem.
    3. Przenieś resztki mieliny do wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    4. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
    5. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 μl roztworu CFSE na 100 μl granulowanych szczątków mieliny.
    6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.
    7. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    8. Zawiesić osad w 600-800 μl buforu do przemywania (filtr 0,2 μm wysterylizowany 100 mM glicyny w PBS).
    9. Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    10. Powtórz kroki 2.3.8-2.3.9 jeszcze dwa razy.
    11. Po ostatnim przemyciu określić masę osadu resztek mieliny i ponownie zawiesić do 100 mg/ml za pomocą sterylnego PBS.
      Uwaga: Oznaczone resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.

3. Test fagocytozy szczątków mieliny

UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji fagocytozy fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.

  1. Przygotowanie płytek zabiegowych
    1. Na każdą płytkę o średnicy 145 mm zebrać dojrzałe BMDM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, używając 5-6 ml 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (dPBS) (pH 7,4) firmy Dulbecco.
      nuta: Nie należy stosować trypsyny, ponieważ może ona zmienić stan aktywacji komórek18.
    2. Dodaj równą objętość wstępnie podgrzanego CMCM do każdej probówki z zebranymi komórkami.
    3. Wirować przy 180 x g przez 8 minut w temperaturze 20 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawieś komórki w CMCM i zlicz.
    5. Do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dodać 1x105 komórek w 1 ml CMCM.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  2. Oczyszczanie i analiza resztek mieliny
    1. Dodaj 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny znakowanych CFSE do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).
    2. Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niepochłonięte resztki mieliny.
    4. Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS.
    6. Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    7. Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.
    8. Dodaj 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris do każdego dołka, aby zmniejszyć fotowybielanie.
    9. Obrazowanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego.
      nuta: Długości fal wzbudzenia i emisji CFSE wynoszą odpowiednio 494 nm i 521 nm.
    10. Podziel liczbę komórek CFSE dodatnich przez liczbę jąder, aby określić względny wychwyt resztek mieliny.
    11. Przed przystąpieniem do obrazowania płytki należy przechowywać do 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

4. Kwantyfikacja lipidów wewnątrzkomórkowych za pomocą barwienia olejem Red-O

UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji wewnątrzkomórkowych lipidów pochodzących z resztek mieliny. Stosowanie resztek mieliny znakowanych CFSE nie jest zalecane do fluorescencyjnej kwantyfikacji barwienia ORO ze względu na nakładanie się widma. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.

  1. Przygotowanie roztworów barwiących
    1. Przygotować 0,5% roztwór barwiący Oil Red-O (ORO).
      1. Powoli dodawać 100 ml 100% glikolu propylenowego (1,2-propanodiolu) do 0,5 g ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol), mieszając.
      2. Podgrzewać roztwór w temperaturze 95 °C przez 15 minut lub do momentu, gdy wszystkie duże cząstki się rozpuszczą.
        UWAGA: Nie podgrzewać powyżej 100 °C.
      3. Przefiltruj roztwór przez kawałek bibuły filtracyjnej, będąc jeszcze ciepłym, do nowego pojemnika.
      4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór można przechowywać do 1 roku w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować 85% roztwór glikolu propylenowego.
      1. Dodaj 85 ml 100% glikolu propylenowego do 15 ml ddiH2O. Mieszaj, aż się wymieszają. Roztwór może być przechowywany przez okres do 1 roku w RT.
  2. Przygotowanie płytek zabiegowych
    1. Przygotować płytkę 24-dołkową zgodnie z metodą opisaną w sekcji 3.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Leczenie resztek mieliny
    1. Dodać 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).
    2. Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niestrawione resztki mieliny.
      Uwaga: W tym momencie płytki mogą zostać poddane natychmiastowemu utrwaleniu lub można dodać nowy CMCM, a komórki powrócić do inkubacji w celu uzyskania dodatkowych punktów czasowych.
    4. Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS, a następnie poddaj barwieniu.
  4. Barwienie i analiza ORO
    1. Umyć płytkę stałą 3 razy za pomocą ddiH2O.
    2. Dodać 400 μl 100% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zmniejszy to przenoszenie ddiH2O.
    3. Odessać glikol propylenowy i dodać 400 μl roztworu ORO do każdej studzienki.
    4. Inkubować przez 8 minut w temperaturze 60 °C.
    5. Zassać roztwór ORO. Następnie dodaj 400 μl 85% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj płytkę 3 razy za pomocą ddiH2O.
    7. Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    8. Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.
    9. Do każdego dołka dodać 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris.
    10. Obrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. ORO można obrazować przy użyciu standardowego zestawu filtrów Texas Red lub DsRed.
    11. Określ ilościowo względną retencję lipidów, określając obszar dodatni ORO w każdym polu obrazu i dzieląc go przez liczbę jąder.
    12. Płytki należy przechowywać przez 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Inkubacja BMDM z resztkami mieliny znakowanymi CFSE powinna wykazać wyraźną internalizację (Rysunek 2). Chociaż 3-godzinny czas interakcji jest wystarczający, aby BMDM fagocytowały ilość dodanych resztek mieliny umożliwiającą silną detekcję w dalszych etapach, akumulacja wewnątrzkomórkowa może być obserwowana już po 1 godzinie interakcji. Niemniej jednak, po przemyciu na powierzchni komórek mogą nadal znajdować się niektóre resztki mieliny. Może to wynikać z niewystarczającego przemycia lub ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj procedury wykorzystują zarówno świeżo wyizolowane surowe szczątki mieliny OUN, jak i pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego. Aby zmniejszyć wydatki zwierząt, zalecamy, aby zarówno mózg, jak i komórki szpiku kostnego były pobierane od każdej myszy w momencie składania ofiary. Dwóch badaczy współpracujących ze sobą może przygotować oba materiały jednocześnie. Alternatywnie, mózgi mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w PBS uzupełnionym antybiotykami przed izolacją resztek mieliny. Z naszego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Glennowi Sanger-Hodgsonowi, specjaliście ds. mediów w FSU College of Medicine, za całą jego pracę przy produkcji wideo, edycji i podkładaniu głosu.

Ta praca była wspierana przez Narodowe Instytuty Zdrowia (R01GM100474 i R01GM072611).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMGE Healthcare Life SciencesSH30243.01Wysoka glukoza z L-glutaminą, pirogronianem sodu
Roztwór penicyliny-streptomycyny Corning30-002-CI100X Roztwór
Surowica dla noworodków cielęcych (NCS)Rocky Mountain BiologicsNBS-BBT-5XMPochodzenie ze Stanów Zjednoczonych
Klon NCTC 929 [komórka L, L-929, pochodna szczepu L] ATCCCCL-1L929 Linia komórkowa do przygotowania kondycjonowanych pożywek
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychVWR10062-896 
Naczynie do hodowli komórkowychGreiner Bio-One639960Polistyren, 145/20mm
Zestaw do proliferacji komórek CFSEThermo FisherC34570DMSO do rekonstytucji
Dostarczony Fluoro-żel z buforem Tris Mikroskopia elektronowa Nauki17985-11
Olej Czerwony OSigma AldrichO0625
Sprzęt
MateriałyFirmaNumer katalogowy>Uwagi
UltrawirówkiRedlica Beckman326823cienkościenna, polipropylen, 38,5 mL, 25 x 89 mm
SW 32 Ti Ultrawirówka RotorBeckman Coulter369650SW 32 Ti Rotor, Wahadłowa łyżka, Tytanowy
ręczny homogenizator obrotowyFisher Science08-451-71

Bibliografia

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
  3. Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
  4. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
  5. Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
  6. Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
  7. Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).
  8. Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380(2010).
  9. Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
  10. Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
  11. Larocca, J. N., Norton, W. T. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
  13. Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
  14. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  15. Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
  16. Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
  17. Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  18. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
  19. Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48(2016).
  20. Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).
  21. Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
  22. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
  23. Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
  24. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
  25. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fagocytoza szczątków mielinyultrawirowanie w gradiencie sacharozyznakowanie CFSEbarwienie Oil Red Oizolacja szpiku kostnegohodowla makrofagówprzygotowanie szczątków mielinytest fagocytozymikroskopia epifluorescencyjna
In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.