Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Shubhendu Sen Roy; Huy Cong Xuan Nguyen; Thomas A. Angelovich; Anna C. Hearps; Diana Huynh; Anthony Jaworowski; Theodoros Kelesidis

doi:10.3791/56325

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56325

⸱

12 października 2017

Shubhendu Sen Roy¹ , Huy Cong Xuan Nguyen¹ , Thomas A. Angelovich²^,³ , Anna C. Hearps² , Diana Huynh¹^,⁴ , Anthony Jaworowski²^,⁴ , Theodoros Kelesidis¹

¹University of California, Los Angeles, ²Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, ³School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, ⁴Department of Infectious Diseases, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Streszczenie

Niski poziom cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL-C) jest jednym z najpotężniejszych niezależnych negatywnych predyktorów miażdżycowej choroby sercowo-naczyniowej (CVD). Struktura i funkcja HDL, a nie HDL-C, może dokładniej przewidywać miażdżycę. W stanach zapalnych, takich jak miażdżyca, występuje kilka zmian w składzie białka HDL i lipidów, które upośledzają funkcję HDL. Funkcja HDL jest zwykle określana za pomocą testów komórkowych, takich jak test wypływu cholesterolu, ale testy te mają wiele wad, brak standaryzacji. Testy bezkomórkowe mogą dawać bardziej wiarygodne pomiary funkcji HDL w porównaniu z testami opartymi na komórkach. Utlenianie HDL upośledza funkcję HDL. HDL odgrywa główną rolę w transporcie nadtlenku lipidów, a duża ilość nadtlenków lipidów jest związana z nieprawidłową funkcją HDL. Interakcje między lipidem a sondą powinny być brane pod uwagę przy interpretacji wyników nieenzymatycznych testów fluorescencyjnych do pomiaru stanu utlenienia lipidów. To zmotywowało nas do opracowania bezkomórkowej biochemicznej metody enzymatycznej do oceny zawartości nadtlenku lipidów HDL (HDLox), który przyczynia się do dysfunkcji HDL. Metoda ta opiera się na enzymie peroksydazie chrzanowej (HRP) i fluorochromie Amplex Red, które mogą określić ilościowo (bez oksydazy cholesterolowej) zawartość nadtlenku lipidów na mg HDL-C. Tutaj opisano protokół oznaczania peroksydacji lipidów HDL za pomocą odczynnika fluorochromowego. Zmienność testu można zmniejszyć poprzez ścisłą standaryzację warunków eksperymentalnych. Wyższe wartości HDLox są związane ze zmniejszoną funkcją przeciwutleniającą HDL. Odczyt tego testu jest powiązany z odczytami zwalidowanych testów komórkowych, zastępczych miar chorób sercowo-naczyniowych, ogólnoustrojowych stanów zapalnych, dysfunkcji immunologicznych oraz powiązanych fenotypów ryzyka sercowo-naczyniowego i metabolicznego. To podejście techniczne jest solidną metodą oceny funkcji HDL w chorobach ludzkich, w których ogólnoustrojowy stan zapalny, stres oksydacyjny i utlenione lipidy odgrywają kluczową rolę (takich jak miażdżyca).

Wprowadzenie

Miażdżycowa choroba sercowo-naczyniowa (CVD) jest główną przyczyną zgonów na całym świecie^1,². Badania epidemiologiczne wykazały, że niski poziom cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości (HDL) jest na ogół odwrotnie proporcjonalny do ryzyka rozwoju miażdżycy¹^,². Chociaż kilka badań potwierdza rolę miażdżycową HDL¹^,², mechanizm, dzięki któremu HDL osłabia inicjację i progresję miażdżycy, jest złożony ³^,⁴. W związku z tym zasugerowano, że złożona struktura i funkcja HDL, a nie poziom bezwzględny, może dokładniej przewidywać miażdżycę ⁵^,⁶^,⁷^,⁸. W stanach zapalnych, takich jak miażdżyca, występuje kilka zmian w składzie białka HDL i lipidów, które upośledzają funkcję HDL. I) zmniejszają potencjał wypływu cholesterolu ⁹, ii) zmniejszają działanie przeciwzapalne i zwiększają białka prozapalne związane z HDL ⁶^,⁷, iii) zmniejszają poziom i aktywność czynników antyoksydacyjnych oraz zdolność HDL do hamowania utleniania lipoprotein o niskiej gęstości (LDLox)¹⁰ oraz iv) zwiększają zawartość wodoronadtlenku lipidów i aktywność redoks (HDLox)⁹^,¹¹. Solidne testy, które oceniają pleotropowe funkcje HDL (takie jak wypływ cholesterolu, funkcja przeciwutleniająca) mogą uzupełniać oznaczanie HDL-HDL-C w klinice.

funkcja HDL jest zwykle oceniana za pomocą metod opartych na komórkach, takich jak test wypływu cholesterolu⁸^,¹²^,¹³^,¹⁴. Metody te mają poważne ograniczenia, w tym znaczną niejednorodność w odniesieniu do typów używanych komórek, rodzaju zgłaszanego odczytu, braku standaryzacji i zakłócających skutków triglicerydów ⁷^,¹⁵. Te wady stwarzają trudności w przypadku dużych badań klinicznych¹⁶. Testy bezkomórkowe mogą dawać bardziej wiarygodne pomiary funkcji HDL w porównaniu z testami opartymi na komórkach. Wypływ cholesterolu jest jedną z najważniejszych funkcji HDL, ale można go określić tylko za pomocą testów komórkowych. Inne podejścia do określania funkcji HDL, takie jak proteomika¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴ i komórkowe testy chemotaksji monocytów funkcji HDL ¹⁷^,²²^,²⁵ nie zostały ustandaryzowane i nie mogą być używane w badaniach na dużą skalę na ludziach.

HDL ma znaczące działanie przeciwutleniające, przeciwmiażdżyco-protekcyjne⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Funkcja przeciwutleniająca HDL została określona w obecności LDL w poprzednich testach fluorometrycznych bez komórek ²⁶. Te biochemiczne metody fluorometryczne funkcji przeciwutleniacza HDL zostały pierwotnie opracowane przez Mohamada Navaba i Alana Fogelmana oraz ich kolegów²⁶. Chociaż w wielu badaniach na ludziach wykorzystano te metody do określenia funkcji HDL ¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴, interakcje lipidowe (HDL)-lipidowe (LDL) i lipidowo-fluorochromowe mogą ograniczać odtwarzalność tych bezkomórkowych nieenzymatycznych testów biochemicznych funkcji HDL²⁷^,²⁸.

Ostatnie zainteresowanie skupiło się na funkcjonalnych konsekwencjach utleniania HDL, które jest wynikiem utleniania zarówno lipidów, jak i białek w HDL ²⁷^,²⁹^,³⁰. Wcześniejsze badania wykazały, że utlenianie HDL upośledza funkcję HDL ²⁷^,²⁹^,³⁰. HDL odgrywa główną rolę w transporcie nadtlenku lipidów, a duża ilość nadtlenków lipidów jest związana z nieprawidłową funkcją HDL. W ten sposób zawartość nadtlenku lipidów HDL może być wykorzystana do określenia funkcji HDL ⁹^,¹⁷^,²⁰^,³¹ i biorąc pod uwagę znane ograniczenia wcześniejszych testów funkcji HDL⁷^,¹⁵^,²⁷^,³²opracowaliśmy alternatywną metodę fluorometryczną, która określa ilościowo zawartość nadtlenku lipidów HDL (HDLox) ³². Metoda ta opiera się na enzymie peroksydazie chrzanowej (HRP) i fluorochromie Amplex Red, które mogą określić ilościowo (bez oksydazy cholesterolowej) zawartość nadtlenku lipidów na mg HDL-C 32. Zasada biochemiczna testu jest pokazana w Rysunek 1. Wykazaliśmy, że to podejście oparte na fluorescencji nie ma ograniczeń wynikających z wcześniejszych testów funkcji HDL²⁷^,²⁸. Test ten został dodatkowo udoskonalony i ustandaryzowany w naszym laboratorium, dzięki czemu może być niezawodnie stosowany w badaniach na dużą skalę na ludziach, nawet z kriokonserwowanym osoczem ³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴². Odczyt tego testu jest powiązany z odczytami zwalidowanych testów opartych na komórkach, zastępczych miar chorób sercowo-naczyniowych, ogólnoustrojowych stanów zapalnych, dysfunkcji immunologicznych i powiązanych fenotypów ryzyka sercowo-naczyniowego i metabolicznego³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹. Tutaj opisujemy tę prostą, ale solidną metodę pomiaru zawartości nadtlenku lipidów HDL (HDLox). Test ten może być wykorzystany jako narzędzie do udzielenia odpowiedzi na ważne pytania badawcze dotyczące roli funkcji HDL w chorobach człowieka, w których ogólnoustrojowe zapalenie, stres oksydacyjny i utlenione lipidy odgrywają kluczową rolę (np. miażdżyca)³².

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem ludzkich próbek biologicznych zostały przeprowadzone po uzyskaniu zgody etycznej z University of California Los Angeles, Los Angeles oraz komisji etyki ds. ludzi w Alfred Hospital, Melbourne.

UWAGA: Istnieje wiele wariantów testu funkcji fluorochromowej HDL (patrz dyskusja)³². Poniżej opisano protokół, który daje najbardziej spójne i powtarzalne wyniki. Przegląd testu przedstawiono na Rysunku 2.

1. Przetwarzanie próbek

Należy użyć świeżego, niehemolizowanego surowicy (może być pobrana do probówek z separatorem surowicy) lub osocza z cytratem pobranego po 12–14 godzinach postu. W przypadku korzystania z próbek kriozamrożonych należy dołączyć odpowiednią kontrolę, zgodnie z opisem w niniejszym protokole.

2. Dzień 0 – Przygotowanie do analizy

Przygotuj schemat rozmieszczenia doświadczenia z odpowiednimi kontrolami, próbkami i powtórzeniami. Każdą próbkę analizuj co najmniej w trzech powtórzeniach. Reprezentatywny schemat dla płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 3.
Oblicz objętości wszystkich odczynników, które zostaną wykorzystane w analizie, w zależności od liczby próbek i powtórzeń.
UWAGA: Uwzględnij dodatkowe 10% objętości w każdym roztworze roboczym, aby upewnić się, że ilość każdego odczynnika jest wystarczająca dla danego eksperymentu.
Oznakuj wszystkie wymagane probówki dla poszczególnych etapów analizy, np. do separacji HDL, pomiaru HDL-C (opcjonalnie) oraz analizy fluorochromowej.

3. Dzień 1 – Przygotowanie kontroli

Przygotowanie specyficznej dla badania puli kontrolnej
1. Przygotować próbkę kontrolną z puli osocza lub surowicy wszystkich próbek badawczych. W przypadku analizy 20 próbek na płytce w trzech powtórzeniach, połączyć 10 µL z każdej próbki w 200 µL puli kontrolnej. Przekazać osobną alikwot tej puli kontrolnej do laboratorium klinicznego w celu oznaczenia wartości HDL-C tej kontroli.
  UWAGA: Należy użyć tej puli kontrolnej do standaryzacji testu i uwzględnienia wszystkich możliwych znanych (np. rodzaj macierzy: surowica względem osocza, cykle zamrażania i rozmrażania, kriokonserwacja) i nieznanych czynników zakłócających, które mogą wpływać na zmienność eksperymentalną²⁷^,²⁸.
Przygotowanie laboratoryjnych kontroli jakości (QC)
1. Przygotować w każdym laboratorium duży zapas HDL (na przykład HDL wyizolowany z 5 mL osocza od 10 zdrowych dawców) i kriokonserwować kilka alikwotów tego zapasu, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.
2. Wykorzystać co najmniej 10 różnych powtórzeń z tego zapasu do wyznaczenia średniej wartości HDLox. Akceptowalny zakres zmierzonych wartości HDLox dla każdej próbki QC zawartej w każdym teście mieści się w granicach <15% współczynnika zmienności tej wartości średniej.
3. Przekazać osobną alikwot tej puli kontrolnej do laboratorium klinicznego w celu oznaczenia wartości HDL-C tej kontroli (np. 40 mg/dL).
  UWAGA: Szczegółowe podejście do wykorzystania krwi z banków krwi w celu stworzenia tych kontrol zostało opisane wcześniej ²⁷^,²⁸^,³². Stosować dodatkowe QC w razie potrzeby (np. jedną od zdrowego dawcy o znanej prawidłowej funkcji HDL i jedną od dawcy o znanej w znacznym stopniu nieprawidłowej funkcji HDL).
Optymalizacja sygnału tła i wartości blanku (opcjonalnie)
1. Aby zminimalizować tło, dodać odpowiednią ilość katalazy (1-4 U/mL) do medium inkubacyjnego w celu szybkiego usunięcia H₂O₂ powstałego w wyniku spontanicznego utleniania buforów przez powietrze.
  UWAGA: Ponieważ wartości z dołków blanku (bez HDL) są odejmowane od wartości próbek HDL, a wyniki są raportowane w odniesieniu do puli kontrolnej (zawartej na tej samej płytce 96-dołkowej), stwierdzono, że krok ten nie wpływa praktycznie na wyniki. Zatem optymalizację sygnału tła za pomocą katalazy można pominąć, jeśli jest to konieczne.

4. Dzień 1 – Wyodrębnianie cholesterolu HDL za pomocą precypitacji HDL

UWAGA: W celu wyizolowania surowicy pozbawionej apoB należy użyć dostępnego komercyjnie, wystandaryzowanego odczynnika do wytrącania cholesterolu HDL, zgodnie z instrukcjami producenta. Odczynniki te są powszechnie stosowane w testach kolorymetrycznych do oznaczania poziomu cholesterolu HDL.

Należy użyć świeżej (lub rozmrożonej) próbki osocza lub surowicy.
Wymieszać równe objętości (np. 80 µL) osocza i odczynnika do wytrącania cholesterolu HDL (20% w/v glikolu polietylenowego w buforze glicynowym o pH 10,0 (25 °C)).
Dokładnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół.
Wirować z prędkością 1000-2000 x g przez 10 min.
Odssać nadsącz (frakcja HDL).
Wyizolowane HDL należy najlepiej niezwłocznie wykorzystać do testu fluorochromowego na peroksydację lipidów HDL. Jeśli jednak w tym samym dniu analizowanych jest wiele próbek i wykonywane są inne etapy, takie jak pomiar stężenia cholesterolu HDL, wyizolowane HDL należy przechowywać w temperaturze 4 °C i wykorzystać następnego dnia do testu fluorochromowego funkcji HDL.

5. Dzień 1 – Oznaczenie HDL-C w wyizolowanym HDL

UWAGA: Krok ten jest opcjonalny, jeśli wartość HDL-C z laboratorium klinicznego jest wykorzystywana do normalizacji HDLox względem ilości HDL-C.

Oznacz ilość cholesterolu HDL w plazmie, stosując standardowe testy kolorymetryczne²⁷. Dodaj 50 µL odczynnika do cholesterolu do każdego dołka i wyznacz stężenie cholesterolu za pomocą kolorymetrycznego czytnika płytek oraz standardu cholesterolu dołączonego do każdego zestawu.

6. Dzień 2 – Przygotowanie odczynników

Przygotować roztwory HRP oraz cholesterolu w stężeniu 5 U/mL HRP (zakres 1-10 U/mL).
Przygotować roztwory fluorochromu (np. Amplex Red) o stężeniu 20 mM: rozmrozić fiolkę z odczynnikiem fluorochromowym i DMSO w temperaturze pokojowej. Przed użyciem rozpuścić odczynnik fluorochromowy (1 mg) w 200 µL DMSO. Roztwór zapasowy przechowywać w zamrażarce w temperaturze ≤-20 °C, chroniąc przed światłem.
Przygotować kontrole pozytywną i negatywną: jako kontrolę negatywną zastosować 1X „bufor reakcyjny” bez cholesterolu, a jako kontrolę pozytywną roboczy roztwór 20 mM H₂O₂.

7. Dzień 2 – Analiza fluorochromowa

Dodaj 50 µL buforu reakcyjnego 1x jako próbę blank (kontrolę negatywną).
Opcjonalnie: Dodaj 20 mM roztwór roboczy H₂O₂ jako kontrolę pozytywną na każdej płytce.
Aby zminimalizować zmienność eksperymentalną i zapewnić spójne oraz terminowe dodawanie odczynników i próbek, wykonaj wszystkie aplikacje próbek w oddzielnej, 96-dołkowej, przezroczystej płytce z polistyrenu lub polipropylenu o okrągłym dnie (Płytka 1). Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść określone objętości do trzech 96-dołkowych płytek (Płytki 2-4: polipropylenowe, z płaskim dnem, czarne) o identycznym układzie (Rysunek 2, Rysunek 3).
1. Na przykład, najpierw dodaj 160 µL wyizolowanego HDL do każdego dołka/próbki na płytce 1, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 µL HDL-cholesterolu z każdego dołka/próbki do czarnych płytek 96-dołkowych. Wymieniaj końcówki pomiędzy każdym rzędem/kolumną i używaj końcówek bez filtra do wszystkich transferów.
Pozostaw próbki w dołkach. Nie odrzucać. Między dodawaniem odczynników nie wykonuje się etapów płukania.
Dodaj 50 µL roztworu HRP o stężeniu 5 U/mL (0,25 U) do każdego dołka.
UWAGA: Użyj HRP przed dodaniem odczynnika fluorochromowego.
Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37 °C. Nie odrzucaj próbek po inkubacji (brak etapów płukania między dodawaniem odczynników).
Dodaj 50 µL odczynnika fluorochromowego do uzyskania stężenia końcowego 300 µM. W tym momencie całkowita objętość reakcji wynosi 150 µL. Wymieszaj dokładnie i chroń przed światłem.
Kieruj odczyt fluorescencji (w ciemności) co minutę przez 120 min w temperaturze 37 °C za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (filtry 530/590 nm).
UWAGA: W przypadku świeżych próbek zastosuj krótszy interwał 60 minut. Stwierdzono, że test trwający 120 minut daje bardziej powtarzalne dane przy użyciu próbek kriokonserwowanych.
Zapisz dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

8. Dzień 3 – Analiza danych

Zapisz jednostki fluorescencji (jednostki umowne) po 120 minutach od dodania odczynnika fluorochromowego dla wszystkich próbek, w tym dla dołków blank i wszystkich kontroli.
Oblicz średnią wartość jednostek fluorescencji (na podstawie co najmniej trzech powtórzeń) (HDL_{ox_sample}). Nie bierz pod uwagę wartości odstających (> 2 SD od wartości średniej).
Odejmij fluorescencję tła, korzystając z następującego równania:
Normalizacja do ilości cholesterolu HDL (HDL-C): Znormalizuj wartość peroksydacji lipidów HDLox dla każdej próbki (w tym dla kontroli z próbek połączonych) do wartości HDL-C (mg/dl). W sekcji wyników HDL_ox jest prezentowany jako pomiar n_(HDL-C) HDLox, aby odzwierciedlić korektę o HDL-C. Użyj następującego równania:
Zestandaryzuj wyrażenie wartości peroksydacji lipidów HDLox każdej próbki względem wartości kontroli z próbek połączonych. Znormalizuj wartość peroksydacji lipidów n_(HDL-C) HDLox dla każdej próbki (skorygowaną o HDL-C) przez wartość peroksydacji lipidów n_(HDL-C) HDLox kontroli z próbek połączonych. W sekcji wyników HDL_ox jest prezentowany jako pomiar nHDL_ox, aby odzwierciedlić korektę o zmienność eksperymentalną i HDL-C. Użyj następującego równania:

UWAGA: Podejście to jest podobne do innych uznanych metod eksperymentalnych służących do redukcji zmienności pomiarów, takich jak międzynarodowy wskaźnik zakrzepemialności (INR)⁴⁴^,⁴⁵. Metoda ta została zwalidowana w badaniach klinicznych³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹.
Przeprowadź kontrolę jakości wyników eksperymentalnych przy użyciu standardowych próbek kontroli jakości. Każde laboratorium powinno ustanowić własne kontrole jakości (QC). Idealnie powinna istnieć kontrola QC dla nHDLox z próbki o znanej dysfunkcji HDL oraz kontrola QC dla nHDLox z próbki od zdrowych dawców [np. użycie próbek połączonych od młodych dorosłych, którzy są stałymi dawcami krwi i nie mają znanych chorób współistniejących ani czynników ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego, w tym palenia tytoniu]. Ta ostatnia kontrola standaryzuje wyniki między różnymi laboratoriami. Średnie wartości tych QC ustala się na podstawie co najmniej 5 powtórzeń (zazwyczaj w tym ważnym kroku stosujemy 10 powtórzeń).
1. Sprawdź, czy zmierzone wartości QC w każdym teście mieszczą się w oczekiwanym zakresie. Zakładając dopuszczalną maksymalną zmienność eksperymentalną na poziomie 15%, wszystkie zmierzone wartości eksperymentalne powinny mieścić się w granicach 15% znanych wartości średnich ustanowionej kontroli QC. Użyj następujących równań:
  
  UWAGA: Jeśli któraś z uwzględnionych próbek kontroli jakości (normalny w porównaniu z dysfunkcyjnym HDL) daje wartości HDLox poza oczekiwanym zakresem (ustanowionym w danym laboratorium), należy powtórzyć eksperyment.
Przeprowadź kontrolę jakości wyników eksperymentalnych, używając współczynnika zmienności (CV) do określenia zmienności eksperymentalnej: Powtórz wszystkie próbki z CV% > 15%. Użyj następującego równania:

UWAGA: Typowa zmienność eksperymentalna wewnątrz serii (na tej samej płytce) i między seriami (między różnymi płytkami) wynosi < 15%. 2) Typowe CV wewnątrz serii mieści się w przedziale 1-7%, a typowe CV między seriami w przedziale 3-10%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do każdej studzienki dodaje się 50 µL każdej próbki HDL, zgodnie z krokiem 7.3. Następnie do każdej studzienki dodaje się 50 µL roztworu HRP 5 U/mL (0,25 U), zgodnie z krokiem 7.5. Próbki inkubuje się przez 30 min w temperaturze 37 °C, zgodnie z krokiem 7.6. Następnie do każdej studzienki dodaje się 50 µL odczynnika fluorochromowego zgodnie z krokiem 7.7 (stężenie końcowe 300 µM). Odczyt fluorescencji (w ciemności) jest następnie oceniany co minutę przez 120 minut w temperaturze 37 °C za ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół stanowi solidne narzędzie do udzielenia odpowiedzi na ważne pytania badawcze dotyczące roli funkcji HDL w miażdżycy i chorobach człowieka. Test określa ilościowo zawartość nadtlenku lipidów HDL na mg HDL-C za pomocą amplifikacji enzymatycznej (HRP). Podejście to pozwala uniknąć znanych ograniczeń wcześniejszych testów funkcji HDL (np. testu wypływu cholesterolu), w tym znacznej heterogeniczności w odniesieniu do typów użytych komórek, rodzaju zgłaszanego odczytu, braku standaryzacji i zakłócających...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Ten protokół i test są istotne dla patentu PCT/US2015/018147.

Podziękowania

Autorzy dziękują za pracę dr Mohamada Navaba, Alana Fogelmana i Srinivasy Reddy'ego za ich kluczową rolę w rozwoju wcześniejszych wersji tego modelu. T.A.A. jest wspierany przez stypendium podoktorskie rektora Uniwersytetu RMIT. AJ i AH są wspierane przez grant projektu NHMRC 1108792. TK jest wspierany przez NIH granty NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # μL1TR000124.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Eksperymentalne odczynniki
HDL PEG (Polyethyle Glycol) Odczynnik strącający	Pointe Scientific	H7511
Amplex Red.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
DMSO.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
Peroksydaza chrzanowa (HRP)	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
Esterazy cholesterolu.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chroń przed światłem
Cholesterol Reference standard	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
Wzorzec referencyjny fluorescencji Rezorufiny	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
5x bufor reakcyjny.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Zestaw do oznaczania czerwonego cholesterolu Amplex. • ≤ – 20&stopni; C i byk; Desykat i byk; Chronić przed światłem
HDL Cholesterol Automated Reagent	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	TR39601
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Plasticware
96-dołkowe płytki (polipropylenowe, płaskie dno, przezroczyste).	Płytki 96-dołkowe Sigma Aldrich	M0687
(polipropylenowe, płaskie dno, czarne).	Sigma Aldrich	M9936
1,5 ml probówki Eppendorf	Eppendorf	0030 125.150
ClipTip 200, sterylne	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	14-488-058
Pipety wielokanałowe Thermo Scientific, 8-kanałowe, 125	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, Kalifornia, Stany Zjednoczone.	14-387--955
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
Gen5 2.01 oprogramowanie	Biotek, Vermont, USA	NA
strong>Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipment
Gen5 Czytnik płyt	Biotek, Vermont, USA	NA

Bibliografia

Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza peroksydacji lipid w bezkom rkowy test biochemiczny fluorometryczna metoda enzymatyczna peroksydaza chrzanowa odczynnik Amplex Red fluorometryczny czytnik p ytek zawarto nadtlenk w lipidowych w HDL pomiar funkcji HDL analiza utleniania HDL

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości