Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Podsumowanie

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5⁺) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy charakteryzuje się niezwykle szybkim tempem rotacji. U ssaków cała wyściółka nabłonka odnawia się w ciągu 4-5 dni. Dorosłe jelitowe komórki macierzyste znajdują się na dnie krypt Lieberkühn, są oznaczone ekspresją genu Lgr5 i zachowują homeostazę dzięki charakterystycznemu dla nich wysokiemu wskaźnikowi proliferacji¹. W całym jelicie cienkim komórki macierzyste Lgr5⁺ mieszają się z wyspecjalizowanymi komórkami wydzielniczymi zwanymi komórkami Panetha. Komórki Panetha wydzielają związki przeciwbakteryjne (tj. lizozym i kryptyny/defensyny) i odgrywają rolę kontrolną we florze jelitowej. Niedawno odkryto nową funkcję komórek Panetha, a mianowicie ich zdolność do zapewniania niszowego wsparcia komórkom macierzystym Lgr5 ⁺ za pośrednictwem kilku kluczowych ligandów, takich jak Wnt3, EGF i Dll1².

Po wyizolowaniu ex vivo i hodowli w obecności specyficznych czynników wzrostu i składników macierzy zewnątrzkomórkowej, całe krypty jelitowe dają początek długotrwałym i samoodnawiającym się strukturom 3D zwanym organoidami, które bardzo przypominają architekturę nabłonka krypty i kosmków dorosłego jelita cienkiego³. Hodowle organoidów, gdy są zakładane z całych krypt, pozwalają na badanie samoodnawiania się i różnicowania niszy jelitowych komórek macierzystych, choć bez zajmowania się wkładem ich poszczególnych składników, a mianowicie komórek Lgr5⁺ i Panetha.

Tutaj opisujemy nowatorskie podejście do testu organoidowego, które wykorzystuje zdolność komórek Paneth i Lgr5⁺ do łączenia i tworzenia organoidów podczas wspólnej hodowli. To podejście, zwane tutaj "testem rekonstytucji organoidów" (ORA), umożliwia genetyczną i biochemiczną modyfikację komórek macierzystych Paneth lub Lgr5⁺, a następnie rekonstytucję w organoidy. W związku z tym umożliwia analizę funkcjonalną dwóch głównych składników niszy jelitowych komórek macierzystych.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy jest najszybciej samoodnawiającą się tkanką w ciele ssaków i jako taki był przedmiotem mnóstwa badań mających na celu identyfikację i funkcjonalną charakterystykę dorosłych komórek macierzystych znajdujących się na dnie krypty Lieberkühn, oznaczonych ekspresją genu Lgr5 i zależnych od kanonicznych sygnałów Wnt¹. Warto zauważyć, że komórki macierzyste Lgr5⁺ są flankowane i wspierane przez wyspecjalizowane komórki niszowe, tj. komórki Panetha, które również zależą od sygnalizacji Wnt w swoim dojrzewaniu². Razem te dwa typy komórek leżą u podstaw samoodnawiania się wyściółki nabłonka jelitowego i utrzymują codzienną równowagę homeostatyczną: komórki macierzyste Lgr5⁺ szybko dzielą się i dają początek progenitorowym i bardziej wyspecjalizowanym komórkom nabłonka jelitowego; Komórki Panetha dostarczają niezbędnych czynników niszowych (np. Dll1, Wnt3, EGF) komórkom macierzystym Lgr5^{+ 2}. Zdolność krypt jelitowych po posianiu ex vivo do tworzenia zorganizowanych i samoodnawiających się struktur zwanych organoidami lub "mini-jelitami" została wykorzystana jako narzędzie eksperymentalne w celu uzyskania wglądu w procesy takie jak samoodnawianie i różnicowanie w normalnych i patologicznych stanach, w tym raku⁴. Hodowle organoidów zostały stworzone z kilku tkanek, w tym z jelita, trzustki, wątroby i nerki, zarówno z próbek mysich, jak i ludzkich⁴. Metoda ekstrakcji i czynniki wzrostu zastosowane do opracowania tych kultur organoidowych są specyficzne dla tkanki i zaprojektowane tak, aby napędzać różnicowanie wieloliniowe i jak najwierniej naśladować pierwotną niszę komórek macierzystych in vivo. Organoidy mogą mieć potencjalne zastosowania, w tym w leczeniu chorób genetycznych, ocenie skuteczności terapeutycznej w leczeniu raka, analizie toksyczności leków lub badaniu organogenezy in vitro⁵.

Ogólnie rzecz biorąc, głównym ograniczeniem kultur organoidowych tworzonych na podstawie próbek tkanek jest brak specyficzności komórkowej. Na przykład organoidy jelitowe utworzone z całych krypt jelitowych nie pozwalają na analizę poszczególnych składników komórkowych zawartych w źródle tkankowym (np. całe krypty zawierają Lgr5⁺, Paneth i komórki progenitorowe).

Tutaj opisujemy nowatorską metodę, określaną jako ORA, która łączy zalety hodowli organoidów jelitowych z funkcjonalną analizą jej najbardziej podstawowych składników, a mianowicie komórek macierzystych (Lgr5⁺) i niszowych (Paneth). Osiąga się to dzięki unikalnej zdolności komórek Paneth i Lgr5⁺ do fizycznego łączenia się ze sobą podczas wspólnej inkubacji i powstawania organoidów^2,6,10. Wykorzystaliśmy tę cechę i poddaliśmy wstępnie obie typy komórek indywidualnej obróbce, zanim pozwoliliśmy im na odtworzenie organoidów. W ten sposób każdy składnik komórki może być wystawiony na działanie dowolnego leku, czynnika wzrostu, inhibitora biochemicznego, modyfikacji genetycznej lub leczenia chemicznego przed odtworzeniem i utworzeniem organoidów. W związku z tym zastosowanie testu ORA pozwoli na określenie, czy określone leczenie farmakologiczne lub modyfikacja genetyczna ma określony wpływ na komórki macierzyste, czy ich niszowy odpowiednik.

Protokół

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z lokalnymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

1. Autoklaw 1 zestaw nożyczek jelitowych, normalnych nożyczek i kleszczyków w sterylnym pojemniku.
2. Umieścić 96-dołkowe (z płaskim dnem) naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Przygotować 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej z odczynnikami wymienionymi w tabeli materiałów.
4. Inkubować kompletną pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
5. Rozmrozić odtworzoną błonę podstawną, umieszczając ją w pojemniku na lód. Odtworzona błona podstawna stanie się płynna w temperaturze 4 °C.
6. Napełnić 4 szalki Petriego zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub w skrócie PBS (4 °C).

2. Izolacja krypt jelita cienkiego

1. Ofiarowanie przez wdychanie CO₂ myszy Lgr5-eGFP-IRES-CreER^t2 na tle C57BL6/J. Wytnij otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek.
2. Przytrzymaj brzuch kleszczami i przetnij go poprzecznie na pół.
3. Za pomocą nożyczek jelitowych od teraz wyciągnij jelito i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS.
   UWAGA: Nożyczki jelitowe mają ostrą i końcówkę. końcówka tych nożyczek ma za zadanie nie uszkodzić architektury krypty-kosmków podczas otwierania jelita.
4. Zacznij od umieszczenia końcówki w żołądku i delikatnie przepchnij ją przez odźwiernik. Kontynuuj, tnąc nożyczkami i ciągnąc kleszczami.
5. Gdy całe jelito cienkie zostanie otwarte wzdłużnie, umyj je w zimnym PBS, trzymając je kleszczami i delikatnie spłucz w roztworze PBS ruchami w kształcie litery U.
6. Gdy wszystkie resztki stolca zostaną usunięte, przystąp do spłaszczania jelita na desce do krojenia, świetlistą stroną do góry. Strona luminalna jest łatwo rozpoznawalna po braku naczyń krwionośnych i bladym wyglądzie w porównaniu z częścią zewnętrzną.
7. Za pomocą szkiełka delikatnie usuń kosmki, zeskrobując spłaszczone jelito. Wykonaj ten krok dwukrotnie na całej długości tkanki.
8. Przeciąć jelito cienkie sterylnym ostrzem chirurgicznym na kawałki o średnicy 2 - 5 mm.
9. Umieść fragmenty jelita cienkiego w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego PBS.
10. Oczyść fragmenty tkanki, usuwając wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pipetując je w górę i w dół w PBS. Odrzucić supernatant i powtarzać ten krok, aż PBS będzie całkowicie czysty.
11. Dodaj 15 ml zimnego PBS, aby całkowita końcowa objętość PBS wynosiła 25 ml. Dodać 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i inkubować przez 45 minut na walce w temperaturze 4 °C.
12. Wyrzuć PBS/EDTA.
13. Dodać 10 ml PBS i odłączyć krypty, ostro pipetując fragmenty tkanek w górę iw dół (co najmniej trzy razy). Zebrać supernatant.
14. Powtórz krok 2.13 cztery razy. Dodaj pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć końcową objętość 50 ml.
15. Granulować komórki przez odwirowanie (300 x g przez 5 min).
16. Zawiesić osad w 10 ml pożywki hodowlanej i osadzać krypty przez odwirowanie (80 x g przez 3 min).

3. Przygotowanie pojedynczej komórki

1. Odrzucić supernatant z granulowanych krypt i ponownie zawiesić go w 1 ml enzymów podobnych do trypsyny razem z 50 μl DNAzy (50 μg/ml).
2. Inkubować komórki w łaźni wodnej w temperaturze 32 °C przez 2 minuty.
3. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej. Rozdziel krypty na pojedyncze komórki, ostro pipetując w górę iw dół co najmniej 5 razy.
4. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm (w celu wyeliminowania grudek i innych zanieczyszczeń) i granulować pojedyncze komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.

4. Cytometria przepływowa i posiewanie

1. Przygotuj 50 ml 1x buforowanego roztworu soli Hanka lub HBSS/2% roztworu surowicy płodowej krowy (FCS) i ponownie zawieś osad w 1 ml na każde 10⁶ komórek
2. Dodać do zawiesiny komórkowej BV421 Lin^- (CD31, CD45, TER119) w stężeniu 1:100 oraz CD24-APC i CD117-PE oba w stężeniu 1:250 przeciwciała przez 30 min.
3. Sortuj komórki macierzyste Lgr5⁺ i komórki Panetha do oddzielnych probówek o niskim poziomie wiązania. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat protokołów sortowania komórek Lgr5⁺ i Panetha, zobacz Roth i wsp.⁷ oraz Schewe et al.⁶
   1. Odwirować posortowane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w pożywce o objętości 100 μl ze składnikami opisanymi jak w ppkt 1.3 (patrz Tabela Materiałów).
4. Leczyć (np. poprzez modyfikację chemiczną lub genetyczną) komórki Panetha (n = 2000) lub komórki macierzyste Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. Do leczenia komórek należy użyć 5 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów w całkowitej objętości 100 μl pożywki hodowlanej i małego interferującego RNA (siRNA) o stężeniu 100 nM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C dla siRNA lub przez czas niezbędny do wybranej modyfikacji.
5. Umyj komórki dwukrotnie w pożywce hodowlanej o pojemności 500 μl.
6. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 10 μl pożywki hodowlanej.
7. Połączyć dwa składniki komórkowe (komórki Paneth lub Lgr5⁺) w całkowitej objętości 20 μl i wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Współinkubować komórki Paneth i Lgr5⁺ przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Usunąć 10 μl supernatantu i pozostawić menisk z płynem, aby upewnić się, że nie zasysają osadu komórkowego.
10. Dodać 30 μl odtworzonej błony podstawnej do komórek, aby uzyskać całkowitą objętość 40 μl, ponownie zawiesić komórki i płytkę na wstępnie ogrzanej 96-dołkowej płytce. Po 10 minutach dodać 200 μl kompletnej pożywki (patrz tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co 48 godzin.
11. Policz liczebność organoidów w 5 dniu.

Wyniki

Test rekonstrukcji organoidów umożliwia oddzielną analizę funkcjonalną niezbędnych komponentów niszy oraz komórek macierzystych nabłonka jelitowego, co w niniejszym przypadku wykazano z użyciem małych interferujących RNA (siRNA) skierowanych przeciwko genowi Apc.

Aby osiągnąć ten cel, w pierwszej kolejności wykorzystaliśmy fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) do wyizolowania 8000 komórek Lgr5⁺ ...

Dyskusja

ORA pozwala na wyrafinowaną analizę funkcjonalną dwóch podstawowych składników jelitowej niszy komórek macierzystych, a mianowicie komórek Lgr5⁺ i Panetha. To podejście było wcześniej stosowane przez nas i innych z niewielkimi modyfikacjami ^6,10,11. W tym miejscu przedstawiamy procedurę ORA jako powtarzalny i ustandaryzowany protokół laboratoryjny. Informujemy również o skutkach regulacji w dół Apc w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stężenie końcowe: 10 mM
Penicylina/streptomycyna *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Stężenie końcowe: 1%
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Stężenie końcowe: 10 mM
Rekombinowany mysi EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Stężenie końcowe: 50 ng/ml
Rekombinowany mysi Noggin *	Peprotech	250-38	Stężenie końcowe: 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Stężenie końcowe: 10 &mikro; M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Stężenie końcowe: 1 &mikro; M
Rekombinowana mysia R-spondyna *	R& Systemy D	3474-RS-050	Stężenie końcowe: 1 mg/ml
Flexitube Gene roztwór siRNA APC	Qiagen GS11789		Stężenie końcowe: 100 nM
Lipofektamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
zestaw PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-LGR5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Rurki o niskim poziomie wiązania	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* Połączenie tych odczynników stanowi kompletną pożywkę

102424 hodowlaną