Badania podstawowe w medycynie osocza - podejście przepustowe od płynów do komórek

Podsumowanie

Pokazany jest protokół obróbki płynów i komórek zimną plazmą fizyczną o wysokiej przepustowości. Polega ona na ustaleniu różnych składów gazów zasilających do zapłonu plazmy, pomiarze widm emisyjnych plazmy, a następnie analizie cieczy i aktywności komórkowej po obróbce plazmowej.

Streszczenie

W medycynie plazmowej, zjonizowane gazy o temperaturze zbliżonej do temperatury kręgowców są stosowane do komórek i tkanek. Zimna plazma wytwarza reaktywne formy, o których wiadomo, że redoks regulują procesy biologiczne w zdrowiu i chorobie. Dowody przedkliniczne i kliniczne wskazują na korzystne działanie leczenia osoczem w gojeniu przewlekłych owrzodzeń skóry. Inne pojawiające się tematy, takie jak leczenie raka osocza, cieszą się coraz większym zainteresowaniem. Badania medyczne nad osoczem wymagają interdyscyplinarnej wiedzy z zakresu fizyki, chemii i biomedycyny. Jednym z celów badań nad osoczem jest scharakteryzowanie komórek poddanych działaniu osocza w różnych specyficznych zastosowaniach. Obejmuje to na przykład liczbę i żywotność komórek, utlenianie komórek, aktywność mitochondriów, cytotoksyczność i tryb śmierci komórki, analizę cyklu komórkowego, ekspresję markerów powierzchniowych komórek i uwalnianie cytokin. W niniejszym badaniu opisano niezbędny sprzęt i przepływy pracy wymagane do takich badań w biomedycynie osocza. Opisuje prawidłowe działanie strumienia plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym, w szczególności monitorując jego podstawowe widma emisyjne i ustawienia gazu zasilającego w celu modulacji produkcji reaktywnych gatunków. Korzystając z wysoce precyzyjnej tabeli xyz i oprogramowania komputerowego, strumień jest unosił się z dokładnością do milisekund nad wnękami 96-dołkowych płytek z dokładnością do mikrometrów, aby zapewnić maksymalną powtarzalność. Pokazano dalsze testy do analizy cieczy cząsteczek aktywnych redoks, a komórki docelowe są poddawane działaniu plazmy. W szczególności komórki czerniaka są analizowane w efektywnej sekwencji różnych kolejnych testów, ale przy użyciu tych samych komórek: pomiaru aktywności metabolicznej, całkowitej powierzchni komórki i ekspresji markera powierzchniowego kalretykuliny, cząsteczki ważnej dla immunogennej śmierci komórek rakowych. Testy te pobierają bogate w zawartość informacje biologiczne o wpływie na osocza z pojedynczej płytki. Podsumowując, badanie to opisuje podstawowe kroki i protokoły badań medycznych nad osoczem.

Wprowadzenie

Gatunki reaktywne są ważnymi regulatorami redoks w chorobach, w tym w nieprawidłowym gojeniu się ran¹ i raku. ² Co ważne, gatunki te są zaangażowane w patologię, jak również w jej terapeutyczne rozwiązanie. ^3,4 Zimna plazma fizyczna to zjonizowany gaz, który wyrzuca różnego rodzaju reaktywne substancje. ⁵ Od czasu pojawienia się tak zwanych zimnych plazm, które działają w temperaturze ciała⁶, zimna plazma może być stosowana do komórek i tkanek bez szkody termicznej. Wykazując skuteczność i bezpieczne stosowanie urządzeń plazmowych w obserwacjach przedklinicznych i klinicznych, trzy z nich uzyskały akredytację jako wyroby medyczne w Niemczech. ⁷ Szczególnie w odniesieniu do bezpieczeństwa genotoksycznego, kilka badań wykazało brak zdarzeń mutagennych przy użyciu pierwszego urządzenia, strumienia plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym. ^8,9,10 Pozostałe dwa urządzenia to tak zwane dielektryczne wyładowania barierowe (DBD), które działają na innej zasadzie niż strumień plazmy. W szczególności dysze pozwalają na obróbkę powierzchni i ubytków jak skalpel, podczas gdy plazma DBD jest skuteczna w leczeniu większych, ale raczej płaskich obszarów tkanek. Wykorzystując komórkową sygnalizację redoks¹¹, celem tej techniki jest wykorzystanie reaktywnych form generowanych przez plazmę do zastosowań biomedycznych. ¹² Szczególnie obiecującym zastosowaniem klinicznej terapii plazmowej jest wspomaganie gojenia się ran. ^13,14,15 Ponadto wykazano, że osocze ma działanie przeciwnowotworowe w modelach zwierzęcych. ^16,17,18

Przed sprawdzeniem skuteczności i bezpieczeństwa aplikacji plazmy na modelach zwierzęcych, a nawet ludzkich, należy przeprowadzić standaryzowane badania in vitro z użyciem urządzeń plazmowych. Eksperymenty te są niezbędne do zbadania zastosowań plazmy i nakreślenia mechanizmów zachodzących w ich działaniu. Ponadto potrzebne są badania podstawowe, aby zrozumieć wpływ składu gatunków reaktywnych i wynikające z nich skutki biologiczne. Badanie to pokazuje, w jaki sposób osocze może zostać włączone do badań biomedycznych, aby lepiej zrozumieć i kontrolować jego wpływ na komórki. Opisano w nim dostrajanie składu gazu zasilającego, monitorowanie produkcji związków reaktywnych, zastosowanie osocza do cieczy, komórek i tkanek oraz wynikające z tego wyniki chemiczne i biologiczne. Ponadto podano przykłady, które instruują na temat standaryzacji leczenia osoczem i dalszych testów biologicznych, z naciskiem na badania medyczne nad osoczem wykonywane na 96-dołkowych płytkach. Takie podejście ma wyraźne zalety: i) minimalizację liczby komórek potrzebnych na warunek, kosztów odczynników i czasu pracy na próbkę; ii) przyzwolenie na większą dokładność wyników, ponieważ z łatwością można skonfigurować podwójne lub potrójne zabiegi; oraz iii) ułatwienie bezproblemowego oznaczania w dalszych etapach w 96-dołkowym czytniku płytek, obrazowaniu i eksperymentach z cytometrią przepływową.

Protokół

1. Monitorowanie i leczenie gatunków osocza

1. Monitorowanie gatunków osocza
   1. Użyj strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym i maksymalnie dwóch standardowych litrów na minutę strumienia gazu zasilającego.
   2. Prostopadle do osi pióropusza, ustaw dżet przed optycznym spektrofotometrem emisyjnym i zarejestruj fotoemisję oraz długość fali (200 - 1000 nm) za pomocą dedykowanego oprogramowania.
   3. Zmieszaj 0,5% azotu lub tlenu z suchym lub wilgotnym (5%) gazem zasilającym.
   4. Powtórzyć optyczną spektroskopię emisyjną dla każdego stanu gazu.
   5. Analizuj za pomocą oprogramowania odpowiedniego do graficznego przedstawiania danych.
2. Konfiguracja obróbki plazmowej
   1. Przymocuj dyszę do sterowanej komputerowo tabeli xyz.
   2. Zidentyfikuj położenie studzienek i wygeneruj skrypt komputerowy, aby przesunąć dyszę połączoną ze stołem, z odpowiednimi czasami obróbki, powyżej środka każdej studzienki.
   3. Dodać 10⁴ dowolnego rodzaju przylegających komórek ssaków w 100 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych (RPMI1640 z 10% FCS, 2% glutaminą i 1% penicyliny/streptomycyny) do kilku studzienek pod okapem z przepływem laminarnym.
   4. Pozwól, aby adhezja komórkowa zaszła przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla.
   5. Traktuj komórki osoczem przez 20 s na różnych wysokościach (oś z) w odstępach 250 μm.
   6. Dodać 25 μl jodku propidyny w pożywce do hodowli komórkowej do każdego dołka.
   7. Zobrazuj komórki pod mikroskopem, aby określić konkretną wysokość, która nie wywołuje martwicy komórek z powodu gazu zasilającego, który popycha pożywkę hodowlaną na wierzch komórek na bok.
      UWAGA: W przypadku dłuższych czasów uzdatniania, należy zidentyfikować parowanie cieczy na tej konkretnej wysokości, w trybie włączania i wyłączania plazmy, ważąc płytkę przed i po obróbce plazmowej, aby określić ilość mikrolitrów podwójnie destylowanej wody niezbędną do przywrócenia homeostazy osmotycznej w traktowanych studzienkach.
   8. Przygotuj końcowy protokół dla tabeli xyz z odpowiednimi czasami obróbki (tutaj: 20 s, 40 s, 60 s plazmy i 60 s kontroli gazu) i pozycjami studzienek, a także przygotuj wielokanałowe pipety i zbiorniki do obsługi cieczy na płytkach 96-dołkowych w kolejnych testach.

2. Analiza głównych składników reaktywnych w cieczach poddanych obróbce plazmowej

1. Analiza nadtlenku wodoru poddanego obróbce plazmowej
   1. Potraktować 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) osoczem w trzech powtórzeniach na płaskich 96-dołkowych płytkach.
   2. Przygotować mieszankę wzorcową, ładując 100 μl PBS 10 j. peroksydazy chrzanowej i 5 μM odczynnika do wykrywania nadtlenku wodoru (wystarczające na jedną studzienkę; odpowiednio zwiększać).
   3. Dodać 95 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki.
      UWAGA: Poprzedni krok należy wykonać na czystym stole lub w pomieszczeniu oddzielonym od źródła plazmy, ponieważ ozon w powietrzu otoczenia może zmniejszyć czułość testu.
   4. Na osobnej płytce przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń nadtlenku wodoru w PBS o najwyższym stężeniu 100 μM w 100 μl PBS.
   5. Dodać 5 μl próbek lub wzorców nadtlenku wodoru do studzienek zawierających odczynnik do wykrywania.
   6. Dołącz studzienki zawierające odczynnik detekcyjne tylko do odjęcia tła po odczycie.
   7. Inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek mierzących fluorescencję przy λ_ex 535 nm i λ_em 590 nm.
      UWAGA: Jeżeli w próbkach spodziewane są wysokie stężenia nadtlenków, należy zwiększyć rozcieńczenie próbki lub dokonać odczytów z krótszym czasem inkubacji, aby uniknąć nasycenia testu.
   9. Odejmij wartości ślepej próby od wszystkich próbek, oblicz krzywą wzorcową nadtlenku i określ ilościowo nieznane stężenia nadtlenku próbki na podstawie tej krzywej podstawowej.
2. Analiza azotynów poddanych działaniu osocza
   1. Potraktować 100 μl PBS osoczem w trzech egzemplarzach na płaskich 96-dołkowych płytkach.
   2. Przygotować główną mieszaninę roztworu do wykrywania azotynów, dodając 1 μl odczynnika do oznaczania ilościowego do 99 μl podwójnie destylowanej wody (wystarczająca na jeden studzienek; odpowiednio zwiększyć).
   3. Dodaj 100 μl na studzienkę do przezroczystej, płaskiej płytki 96-dołkowej. Skaluj w górę zgodnie z potrzebami dla liczby studni.
   4. Przygotować serię rozcieńczeń wzorców azotynów w wodzie podwójnie destylowanej.
   5. Dodać 10 μl wzorców lub próbek do mieszanki wzorcowej w płytkach 96-dołkowych.
   6. Inkubować płytkę w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Do każdej studzienki dodać 5 μl roztworu wywoływacza do oznaczania ilościowego azotynów.
   8. Odczyt fluorescencji w czytniku mikropłytek przy λ_ex 365 nm i λ_em 450 nm.
   9. Odejmij wartości ślepej próby od wszystkich próbek, oblicz krzywą wzorcową azotynów i określ ilościowo nieznane stężenia azotynów w próbce na podstawie tej krzywej podstawowej.
3. Analiza ponadtlenku poddanego obróbce plazmowej
   1. Przygotować główną mieszaninę utlenionego cytochromu (1 mg/ml) i katalazy (20 μg/ml) w PBS.
   2. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do dołków na klarownej, 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
   3. Mieszaninę wzorcową należy traktować osoczem w trzech egzemplarzach dla każdego warunku poddawania działaniu substancji.
   4. Odczytać absorbancję przy długości fali 550 nm za pomocą czytnika mikropłytek; dane należy narysować na wykresie.
   5. Obliczyć ilość wytworzonego ponadtlenku za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji cytochromu C i długości drogi światła cieczy w studzience.

3. Odpowiedź biologiczna komórek wystawionych na działanie osocza

1. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: aktywność metaboliczna
   1. Użyj okapu z przepływem laminarnym do wszystkich poniższych procedur.
   2. Wysiew 10⁴ komórek (mysi czerniak B16) w 100 μl w pełni uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowej na basenie na płaskie 96-dołkowe płytki.
   3. Pozostawić adhezję komórkową przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla.
   4. Korzystając z tabeli xyz, potraktuj studzienki samą plazmą lub gazem zgodnie z predefiniowanym schematem i dodaj komórki z powrotem do inkubatora na 20 godzin
      UWAGA: W razie potrzeby po 20 godzinach zdjąć supernatanty w celu analizy produktów zewnątrzkomórkowych; Następnie dodać 100 μl świeżej pożywki.
   5. Do każdego dołka dodać 25 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 500 μM rezazuryny (końcowe stężenie 100 μM); przygotować trzy studzienki zawierające samą rezazurynę w pożywce do hodowli komórkowej bez komórek do odejmowania tła.
   6. Inkubować przez 3 godziny w inkubatorze.
   7. Odczyt fluorescencji przy λ_ex 535 nm i λ_em 590 nm w czytniku mikropłytek.
   8. Odejmij fluorescencję tła od wszystkich próbek i znormalizuj dane, aby kontrolować wartości.
2. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: analiza obrazu
   1. Użyć płytki studzienkowej z ppkt 3.1.7 i odrzucić supernatant.
   2. Dodać 100 μl pożywki do hodowli świeżych komórek zawierającej 1 μg/ml jodku propidyny.
   3. Umieść płytkę pod mikroskopem ze zmotoryzowanym stolikiem, aby zobrazować każdą studzienkę.
      UWAGA: Szczegóły obrazowania zależą od pytania eksperymentalnego; w tym przypadku obiektyw 20X został użyty w urządzeniu do obrazowania o wysokiej zawartości do odczytu pól widzenia 3x3 w każdej studzience w kanale jasnego pola, cyfrowym kanale kontrastu fazowego i kanale fluorescencji (jodku propidyny), wykorzystując odpowiednie światło wzbudzenia i filtry emisyjne.
   4. Użyj oprogramowania do ilościowej analizy obrazu, aby określić całkowitą powierzchnię cytozolową na cyfrowych obrazach kontrastu fazowego wszystkich pól widzenia obrazowanych w każdym dołku.
      UWAGA: W razie potrzeby przeanalizuj dalsze parametry, na przykład liczbę żywotnych i/lub martwych komórek lub aktywność mitochondriów za pomocą dedykowanych barwników. W przypadku stosowania innych barwników niż opisane w tej pracy, należy upewnić się, że barwienia fluorescencyjne używane do mikroskopii nie pokrywają się spektralnie z fluorochromami stosowanymi w kolejnych eksperymentach cytometrii przepływowej.
   5. Sporządzić wykres danych i w razie potrzeby przetestować korelację z wartościami uzyskanymi dla aktywności metabolicznej.
3. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: cytometria przepływowa
   1. Do tej analizy należy użyć płytki studzienkowej z kroku 3.2.5.
   2. Odrzucić supernatant i przemyć dwukrotnie 200 μl PBS zawierającego wapń i magnez (odpowiednio 0,9 mM i 0,5 mM).
      UWAGA: Na tym etapie należy utrwalić i/lub przeniknąć komórki w celu uzyskania dalszych odczytów biologicznych nieuwzględnionych w tym wkładzie, takich jak barwienie antygenu wewnątrzkomórkowego lub analiza cyklu komórkowego.
   3. Do każdej studzienki dodać 50 μl PBS z wapniem i magnezem zawierającym 50 ng/ml przeciwciał monoklonalnych przeciwko mysiej kalretykulinie.
   4. Inkubować przez 15 minut w inkubatorze.
   5. Przemyć dwukrotnie 200 μl w pełni uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych i wylać płyn na płytkę.
   6. Dodać 100 μl roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w inkubatorze.
   7. Użyj innego zestawu niebarwionych komórek B16 w zawiesinie, aby skonfigurować protokół akwizycji cytometrii przepływowej, strategię bramkowania oraz wzmocnienia i napięcia fotodetektorów.
   8. Załadować płytkę do cytometru przepływowego wyposażonego w automatyczny próbnik do płytek 96-dołkowych.
   9. Zdobądź co najmniej 1,000 komórek w populacji rozproszonej do przodu i bocznej, zwykle związanej z komórkami żywotnymi.
   10. Skorzystaj z oprogramowania dedykowanego do analizy cytometrii przepływowej, plików .fcs do wyznaczenia interesującej nas populacji i wyznaczenia średniej intensywności fluorescencji kalretykuliny.
   Proszę sporządzić
   11. wykres danych i, w razie potrzeby, przetestować korelację z wartościami uzyskanymi dla aktywności metabolicznej, obrazowania i/lub osadzania utleniacza.

Wyniki

W tym badaniu opisano usprawniony przepływ pracy dla badań medycznych nad wpływem osocza. Zastosowane tutaj multidyscyplinarne podejście analizuje podstawowy profil emisji optycznej strumienia plazmy, główne reaktywne składniki cieczy oraz reakcje biologiczne komórek poddanych działaniu osocza (Rysunek 1).

Aby przeprowadzić ten proces, potrzebne było kilka komponentów do prawidłowego ustawienia źródła plazmy (Rysunek 2). Różne gazy (w tym przypadku głównie argon, tlen i azot) były dostarczane i kontrolowane przez kilka regulatorów przepływu masy. Panel centralny został wykorzystany do cyfrowego dostosowania regulatorów przepływu masowego do wcześniej określonych strumieni gazu zasilającego. Aby uzyskać określony skład gazu zasilającego, gazy zostały fizycznie zmieszane za pomocą panelu zaworów, które łączyły gazy z kilku regulatorów przepływu masowego (Rysunek 2A). Źródło plazmy zostało włączone, a ścieki z plazmy ustawiono przed spektrofotometrem USB (Rysunek 2B) o zakresie optycznym od 200 nm do 1000 nm. W przypadku obróbki płynów i komórek opisano wydajny przepływ pracy przy użyciu 96-dołkowych płytek. Naczynia wielodołkowe były utrzymywane na miejscu za pomocą plastikowej ramy, która była przymocowana do płyty podstawy z wkładkami dopasowanymi do jej odciśniętych otworów (Rysunek 2C). Cały zestaw został umieszczony pod okapem z przepływem laminarnym (Rysunek 2D). Konfiguracja ta obejmowała stół xyz, do którego zamontowany był trzymany w ręku fragment strumienia plazmy. Elementy sterujące silnikiem mogą być umieszczone na zewnątrz stołu, jeśli ten ostatni ma wystarczająco duże porty kablowe od i do stołu xyz. Co ważne, stół był sterowany komputerowo i można go zaprogramować tak, aby unosił się nad środkiem każdej studni z mikrometryczną precyzją przez żądany czas. Co więcej, pozycja startowa (tak jak w naszym setupie, dobrze A1) była dowolnie wybrana (Rysunek 2E). W połączeniu z plastikowym uchwytem na płytkę pozwoliło to na powtarzalną obróbkę plazmową z dowolnymi codziennymi zmianami związanymi wyłącznie z przygotowaniem płynu i eksperymentami biologicznymi.

Optyczna spektroskopia emisyjna (OES) została użyta do śledzenia wyraźnych pików związanych z reaktywnymi składnikami plazmy w różnych warunkach zasilania gazem (Rysunek 3A). Na przykład drugi dodatni układ azotu o pikach od 330 nm do 380 nm reprezentował reaktywne formy azotu, a pik przy 309 nm reprezentował rodniki hydroksylowe (strzałka w Rysunek 3A). W porównaniu z samym argonem, obecność form azotu wzrastała wraz z mieszaniną azotu z gazem zasilającym, podczas gdy dodanie tlenu lub wilgoci odpowiednio zmniejszało lub zmniejszało. Natomiast obecność rodników hydroksylowych zmniejszała się w przypadku tlenu lub azotu, ale znacznie wzrastała, jeśli jako gaz zasilający stosowano wilgotny argon. W przypadku plazmowej obróbki cieczy, najpierw określono parowanie spowodowane przez gaz argonowy i plazmę argonową (Rysunek 3B). Co ważne, oba warunki nie przyniosły podobnych wyników, ponieważ plazma wywiera również wpływ na temperaturę. Zgodnie z wynikami OES dla rodników hydroksylowych, osadzanie się nadtlenku wodoru znacznie zmniejszało się z domieszką tlenu lub azotu, ale wzrastało wraz z nawilżanym gazem zasilającym (Rysunek 3C). Co więcej, dodanie azotu do gazu zasilającego doprowadziło do znacznie wyższych stężeń azotynów w porównaniu z cieczami traktowanymi plazmą argonową (Rysunek 3D). Ten przepływ pracy może być również wykorzystany do zbadania wpływu osocza na ciecze o różnym składzie. Na przykład stężenia nadtlenku wodoru wydawały się być niezależne od obecności płodu w surowicy cielęcej w PBS i pożywce RPMI1640 hodowli komórkowej (Rysunek 3E). W tych samych próbkach obecność surowicy zmniejszyła stężenie azotynów w PBS i pożywce do hodowli komórkowych w porównaniu z ich odpowiednikami niezawierającymi surowicy (Rysunek 3F). Większość ponadtlenków została wyprodukowana w warunkach suchego argonu gazowego z domieszkami tlenu i/lub azotu znacznie wygaszającymi wytwarzanie ponadtlenków, z wyjątkiem nawilżonej plazmy argonowo-tlenowej (Rysunek 3G).

Do obróbki plazmowej komórek w naczyniach wielodołkowych, płytka zawierająca komórki wysiane dzień wcześniej została usunięta z inkubatora i dodana do plastikowego uchwytu. Zastosowano zaprogramowany schemat zabiegu, skompensowano parowanie, a płytkę umieszczono z powrotem w inkubatorze na 20 godzin. Należy zauważyć, że po tej inkubacji, supernatanty z hodowli komórkowych mogły zostać zebrane na nową, pustą 96-dołkową płytkę i przechowywane w temperaturze -80 °C w celu oceny białek będących przedmiotem zainteresowania. Następnie do komórek każdej studzienki dodano rezazurynę. Zamiana niefluorescencyjnej resazuryny do fluorescencyjnej rezorufiny była ułatwiona tylko przez aktywne enzymy generujące NADPH i była skorelowana z ogólną aktywnością metaboliczną (Rysunek 4A). Intensywność fluorescencji była podobna do wizualnej percepcji płytki i wskazywała na cytotoksyczne efekty długotrwałego leczenia osoczem (Ryc. 4B). Nawilżone warunki gazowe były bardziej szkodliwe niż warunki suchego gazu. Te same komórki na płytce wykorzystano do dalszych testów. Komórki na płytce zostały przebadane pod mikroskopem (Ryc. 4C). Za pomocą oprogramowania do obrazowania zbadano kilka dołków płytki w celu porównania jakościowego (Rysunek 4D). Oprogramowanie pozwoliło na ilościowe określenie całkowitego obszaru pokrytego przez komórki w polach widzenia uzyskanych w każdym dołku, a uzyskane dane zostały znormalizowane do odpowiednich kontroli (Rysunek 4E). W próbkach poddanych działaniu osocza zaobserwowano zmniejszenie całkowitej powierzchni komórek, zwłaszcza w warunkach nawilżonego gazu zasilającego. Po zobrazowaniu komórki przemyto, wybarwiono przeciwciałami przeciwko myszym kalretikulinom, odłączono i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 4F). Obliczono średnią intensywność fluorescencji barwienia kalretykuliną w żywotnych komórkach (Ryc. 4G) i porównano między próbkami (Ryc. 4H). Leczenie osoczem indukowało regulację w górę kalretykuliny na powierzchni komórek czerniaka myszy, co odpowiadało czasowi leczenia plazmą zastosowaną w warunkach suchego gazu paszowego. W przypadku wilgotnego gazu zasilającego, 20 s i 40 s leczenia wywołało silniejszą ekspozycję na kalretykulinę w porównaniu z bardziej śmiertelnym czasem leczenia 60 s. Sugeruje to, że istniała nieliniowa regulacja ekspozycji na kalretykulinę w odniesieniu do ilości utleniaczy wprowadzanych do komórek.

Rysunek 1: Przebieg badań medycznych nad plazmą od fizyki do biologii. Wytwarzanie form reaktywnych strumienia plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym jest dostrajane poprzez modulację gazu zasilającego. Wybrane cząsteczki w fazie gazowej plazmy są monitorowane za pomocą spektroskopii. Osocze służy do uzdatniania cieczy i badania osadzania się utleniaczy. Komórki hodowane na mikropłytkach są poddawane obróbce plazmowej i wykonywane są odczyty biologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja stanowiska do badań plazmowych. (A) Różne gazy w rurach ze stali nierdzewnej są wprowadzane do kilku regulatorów przepływu masowego, które są sterowane za pomocą panelu centralnego. Indywidualny skład gazu zasilającego jest następnie mieszany za pomocą panelu zaworów. (B) Niektóre reaktywne składniki plazmy mogą być monitorowane za pomocą optycznej spektroskopii emisyjnej w celu zbadania różnic między różnymi składami gazów zasilających. (C) Do wysokoprzepustowych badań plazmy stosuje się 96-dołkowe mikropłytki. Aby zapewnić stały punkt początkowy dla programowalnej i zautomatyzowanej obróbki plazmowej, płytka jest dodawana do ramy, która gwarantuje tę samą bezwzględną pozycję płyt z dnia na dzień. (D) Strumień plazmy jest przymocowany do sterowanego komputerowo stołu xyz umieszczonego pod okapem z przepływem laminarnym. Wszystkie 96 dokładnych lokalizacji i czas przebywania plazmy nad każdym studiem są zapisywane w pliku programu, który kieruje ruchem źródła plazmy. Główna obudowa aparatu plazmowego, jak również elementy sterujące silnikiem, znajdują się w bliskiej odległości. (E) Zautomatyzowana obróbka plazmowa płytki 96-dołkowej. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza strumienia plazmy i cieczy. (A) Pokazano optyczną spektroskopię emisyjną różnych warunków gazu zasilającego. Drugi dodatni układ azotu (od 330 nm do 380 nm) został zwiększony domieszką azotu, nieobecnego w przypadku domieszki tlenu, i znacznie zredukowany przez wilgotny argon (panele po lewej stronie). Szczyt rodników hydroksylowych przy 309 nm (strzałka) zmniejszył się w warunkach azotu i tlenu, ale znacznie wzrósł wraz z nawilżonym argonem w porównaniu z samym argonem. (B) Narażenie cieczy na gaz prowadzi do parowania. Ilość parowania na studzienkę w 96-dołkowej płytce po traktowaniu samą plazmą i argonem określono przez zważenie płytki przed i po zabiegu przy użyciu drobnej skali. Parowanie w próbkach poddanych działaniu plazmy było wyższe w porównaniu z próbkami poddanymi działaniu argonu. (C) Wytwarzanie nadtlenku wodoru w cieczach poddanych działaniu plazmy korelowało w pewnym stopniu z pikiem 309 nm rodników hydroksylowych w (A). Nawilżona (5%) plazma argonowa zwiększyła stężenie nadtlenku około 4-krotnie. (D) Azotyn był podwyższony, gdy azot został dodany do gazu zasilającego, a efekt ten został zwiększony przez wilgotną plazmę argonową. Dodanie tlenu zmniejszyło wytwarzanie azotynów, ale nie znacząco. (E, F) Stężenia nadtlenku wodoru i azotynów wykazano w różnych rodzajach cieczy, a mianowicie w pożywce RPMI1640 hodowli komórkowych z (R10F) i bez (R0F), a także PBS z surowicą cielęcą płodu i bez niej (FCS). Poziomy nadtlenków nie różniły się między różnymi pożywkami (E), podczas gdy poziomy azotynów były znacznie zmniejszone w obecności surowicy. (G) Produkcja ponadtlenków była najwyższa w przypadku suchego gazu zasilającego argonem; Domieszka azotu, tlenu lub nawilżonego argonu dawała mniejsze osadzanie się ponadtlenku w cieczy. Pokazane dane (B-G) to średnia +SEM z dwóch do trzech eksperymentów. Przeprowadzono analizę statystyczną (C, D) przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji porównującej średnie dla całej grupy suchych lub wilgotnych warunków gazu zasilającego w stosunku do odpowiedniej kontroli (** p <0,01; *** p <0,001). Dodatkowo porównano warunki plazmy z samym argonem za pomocą średniej z całej grupy i testu t (### p <0,001). Dalszą analizę statystyczną (F) przeprowadzono za pomocą testów t porównujących wartości każdego traktowania osoczem i warunków pożywki w próbkach z FCS i bez FCS (* p <0,05; ** p <0,01); Ponadto, roztwory zawierające FCS lub niezawierające FCS były porównywane w każdym czasie leczenia osoczem za pomocą testu t (# p <0,05; ## p <0,001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obróbka plazmą i jej wpływ na komórki. (A) Komórki wystawiono na działanie osocza, a po 20 godzinach dodano rezazurynę w celu oceny aktywności metabolicznej. (B) Aktywność była znacznie zmniejszona w próbkach poddanych działaniu osocza w porównaniu z kontrolami gazowymi. Wyraźny spadek zaobserwowano w przypadku nawilżania gazu zasilającego, podczas gdy dodanie tlenu i/lub azotu prowadzi do toksyczności zarówno w suchych, jak i wilgotnych warunkach argonu. (C) Dodano pożywkę zawierającą jodek propydyny (PI). (D) Pokazano przegląd dołków płytki z cyfrowym kontrastem fazowym (pomarańczowym) reprezentującym frakcję cytozolową każdej komórki i PI (zielonym) w celu identyfikacji martwych komórek. Narzędzia do obrazowania pozwoliły na ilościowe określenie całkowitego obszaru w polu widzenia każdej studzienki pokrytej komórkami. (F) Komórki zostały następnie umyte i inkubowane z przeciwciałami lub innymi markerami komórkowymi w celu scharakteryzowania biologicznych efektów plazmy za pomocą cytometrii przepływowej. (G) Zastosowano strategie bramkowania oraz przeprowadzono analizę markerów i porównano je między próbkami. Przedstawione dane (B, E, H) oznaczają średnią +SEM jednego przedstawiciela trzech niezależnych eksperymentów. Podziałka = 200 μm (D). Porównanie statystyczne przeprowadzono za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (B, H) porównującej, dla każdego stanu gazu, każdą obróbkę plazmową z odpowiednią kontrolą gazową (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001). Dodatkowo, wartości dla każdego stanu domieszek azotu i/lub tlenu zostały porównane z wartościami plazmy gazowej argonu dla warunków suchych i wilgotnych oddzielnie (dwukierunkowa analiza wariancji; ### p <0,001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Badania podstawowe mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia skuteczności i mechanizmów leżących u podstaw leków osoczowych w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Badania podstawowe sprzyjają również badaniom nad nowymi zastosowaniami w leczeniu. Chociaż powszechnie wiadomo, że plazma pośredniczy w swoich efektach biologicznych poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i azotu¹⁹, nadal istnieją trzy główne wyzwania w tej dziedzinie. Po pierwsze, które gatunki są ważne? Częściową odpowiedź na to pytanie można uzyskać, modulując skład gazu zasilającego plazmę za pomocą diagnostyki optycznej i odczytów biologicznych. ²⁰ Po drugie, jakie efekty można zaobserwować w przypadku celów biologicznych, takich jak komórki? Problem ten jest przynajmniej częściowo rozwiązany za pomocą eksperymentów z hodowlami komórkowymi i szeregu testów. W komórkach eukariotycznych efekty są plejotropowe, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego²¹, apoptoza²², martwica²³ i stymulacja komórek skóry 24,25,26, a także wspomaganie lub zmniejszanie ruchliwości komórek lub aktywności metabolicznej 27,28,29. Trzecim wyzwaniem, związanym z tymi efektami plejotropowymi, jest zidentyfikowanie kluczowych cząsteczek, które determinują odpowiedź komórkową na utleniacze pochodzące z osocza, aby wyjaśnić różne efekty często obserwowane w różnych typach komórek. Można to osiągnąć za pomocą technik omicznych 30,31,32 i/lub regulacji w górę lub w dół docelowych genów za pomocą inhibitorów sygnalizacji siRNA (redoks), przeciwutleniaczy i enzymów przeciwutleniających, a także modulacji produkcji reaktywnych składników osocza. 33,34,35 W związku z tym potrzebne są uproszczone protokoły testowe do testowania większych zestawów próbek z dużą liczbą iteracji.

Badanie to jest przykładem wydajnego eksperymentalnego przepływu pracy, od fizyki po biologię, w badaniach medycznych nad plazmą w odniesieniu do wyżej wymienionych wyzwań. Szczegóły dotyczące inżynieryjnych aspektów źródła plazmy i jej wytwarzania zostały opisane wcześniej. 36,37,38 Wszystkie te testy są wykonywane na płytkach 96-dołkowych, co ma wiele zalet. Na przykład próbki, takie jak supernatanty z hodowli komórkowych, można łatwo przenosić z testu na płytki pobraniowe w celu zbadania, na przykład, stężeń białek za pomocą testu immunoenzymatycznego. Jeśli dostępny jest sprzęt naukowy zdolny do odczytu bezpośrednio z 96 dołków, takie podejście minimalizuje koszty na próbkę i czas oczekiwania oraz maksymalizuje wyniki poprzez multipleksowanie różnych testów z tej samej próbki. Zastosowanie pipet wielokanałowych dodatkowo przyspiesza obsługę próbek. Zasadniczo opisany tutaj test można również przeprowadzić przy użyciu płytek studzienkowych o większych średnicach, chociaż wymagałoby to dodatkowych etapów pipetowania do innych probówek i naczyń do dalszych testów. Mniejsze typy płytek, takie jak płytki 384-dołkowe, nie prezentują jednak geometrii odpowiedniej do badań plazmy biomedycznej przy użyciu dżetów o dużych strumieniach gazu zasilającego. W szczególności nie można zagwarantować, że podczas zabiegu naruszone zostaną tylko pojedyncze, ale nie sąsiednie studnie.

Analiza cieczy jest niezbędna do zbadania osadzania się gatunków przez osocze. W analizach eksperckich równoległe ustawienie różnych testów może scharakteryzować ciecze poddane działaniu plazmy w odniesieniu do różnych utleniaczy w tym samym czasie. To multipleksowanie pozwala na opracowanie zróżnicowanego obrazu gatunków pochodzących z plazmy. Opisane podejście jest bardzo czułe w badaniu stężeń nadtlenku wodoru³⁹, co często jest konieczne, ale nie zawsze wystarczające do wyjaśnienia wpływu na plazmę. 40,41,42 Biologicznie istotne efekty można również ocenić w płynach, w których nie uwzględniono tutaj testu glutationu. ⁴³ Specyficzny test azotynów jest zdecydowanie zalecany w porównaniu z konwencjonalnymi testami Griessa ze względu na 10-krotnie wyższą czułość testu (dane nie pokazane). Ciecze poddane działaniu osocza można również badać pod kątem tworzenia się kwasu podchlorawego za pomocą testu DTNB. Jednak wcześniejsze wyniki nie wskazywały na formowanie się tego gatunku z naszym źródłem plazmy. 19,39,44 Po zakończeniu obróbki osoczem, z czasem następuje degradacja gatunków. Azotyn reaguje z azotanem; Z czasem zużywa się również nadtlenek. Procesy te trwają jednak kilka godzin. ³⁵ Absorpcja cytochromu c jest stabilna również przez kilka godzin. W związku z tym, jeśli procesy zachodzą w ciągu pierwszych 30 minut po zabiegu, różnice w stężeniach opisywanych tutaj gatunków długowiecznych są nieistotne. Należy jednak zachować ostrożność podczas badania niektórych rodzajów pożywek (np. Zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco), ponieważ składniki mogą wymiatać do 90% nadtlenku w ciągu 1 godziny (dane nie pokazane), co prowadzi do niedoszacowania osadzania się nadtlenku w osoczu w cieczach.

Przedstawiono test multipleksowy, który obejmuje badanie aktywności metabolicznej w obszarze komórki (morfologia) do ekspresji markerów na powierzchni komórki. Połączenie tych testów może przynieść interesujące wyniki. Na przykład wcześniej wykazaliśmy w monocytach THP1, że aktywność metaboliczna i liczba komórek nie zmniejszają się w sposób liniowy po ekspozycji na osocze. ⁴⁵ Raczej, wraz ze wzrostem czasu leczenia osoczem, zaobserwowano, że komórki zwiększyły się i miały większą masę mitochondrialną, co prowadziło do wyższego tempa metabolizmu w przeliczeniu na komórki. Zasadniczo, połączenie czytnika wielopłytkowego, mikroskopii i cytometrii przepływowej multipleksuje informacje na temat odpowiedzi komórkowych po leczeniu osoczem. W komórkach czerniaka skupiamy się tutaj na działaniu cytotoksycznym i ich immunogenności, w której pośredniczy kalretykulina. ⁴⁶ Zasadniczo za pomocą tego podejścia można odpowiedzieć na wiele innych pytań, łącząc aktywność metaboliczną z wynikami obrazowania i cytometrii przepływowej. Na przykład różnicowanie komórek (np. polaryzacja makrofagów), potencjał błony mitochondrialnej, analiza cyklu komórkowego, ruchliwość komórek, biomechanika lub tworzenie mikrojąder w celu analizy genotoksyczności mogą być również badane w komórkach poddanych działaniu plazmy. Wielokolorowa cytometria przepływowa pozwala na jeszcze więcej zastosowań w różnych populacjach komórek w tym samym czasie. Obejmuje to na przykład analizę stanu fosforylacji białek sygnałowych, takich jak czynniki transkrypcyjne, kwantyfikacja mRNA, pomiar cytokin wewnątrzkomórkowych i/lub ocena całkowitej zredukowanej zawartości tioli na poziomie pojedynczej komórki. Dodatkowe informacje biologicznie istotne, które są dostępne dla każdej próbki, pomagają w dalszym rozwijaniu obrazu efektów redoks w osoczu, aby lepiej zrozumieć obecne i przyszłe zastosowania plazmy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		Zestaw do wykrywania amplex Ultra Red 423201
BioLegend (zawiera peroksydazę chrzanową i H2O2)	Thermo	A36006
argon gazowy	Air Liquide	N50
B16F10 mysie komórki czerniaka	ATCC	CRL-6475
katalaza	Sigma	C30
inkubator	hodowli komórkowychSpoiwo	CB210
plastikowa hodowla komórkowa	NUNC	156545
cytochrom c, utleniona	analiza danych Sigma	C2037
	oprogramowania GraphPad	7.03
płodowa surowica bydlęca	testowana partiami	Sigma
dowolna dokładna skala			z rozdzielczością 0,01 mg
cytometr przepływowy	Beckman-Coulter	CytoFlex S
Zestaw do wykrywania azotynów Measure-iT	Mikroskop Thermo	M36051
	PerkinElmer	Operetta CLS
spektroskopia optyczna emsji	Avantes	AvaSpec-DDDD-2-USB2
pipety do penicyny/streptomycyny	Thermo	15140122
	Eppendorf/Brand	single/multi chanel
czytnik płytek	Tecan	M200pro
jodek propydyny	BioLegend	421301
resazurin	VWR	B21187.06
RPMI1640 podłoża do hodowli komórkowych	PanbioTech	P04-16500
xyz	stół CNC stopień	HIGH-Z S-400/T