Artykuł metodologiczny

Badania podstawowe w medycynie osocza - podejście przepustowe od płynów do komórek

14.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56331

⸱

17 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1ZIK plasmatis, Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazany jest protokół obróbki płynów i komórek zimną plazmą fizyczną o wysokiej przepustowości. Polega ona na ustaleniu różnych składów gazów zasilających do zapłonu plazmy, pomiarze widm emisyjnych plazmy, a następnie analizie cieczy i aktywności komórkowej po obróbce plazmowej.

Streszczenie

W medycynie plazmowej, zjonizowane gazy o temperaturze zbliżonej do temperatury kręgowców są stosowane do komórek i tkanek. Zimna plazma wytwarza reaktywne formy, o których wiadomo, że redoks regulują procesy biologiczne w zdrowiu i chorobie. Dowody przedkliniczne i kliniczne wskazują na korzystne działanie leczenia osoczem w gojeniu przewlekłych owrzodzeń skóry. Inne pojawiające się tematy, takie jak leczenie raka osocza, cieszą się coraz większym zainteresowaniem. Badania medyczne nad osoczem wymagają interdyscyplinarnej wiedzy z zakresu fizyki, chemii i biomedycyny. Jednym z celów badań nad osoczem jest scharakteryzowanie komórek poddanych działaniu osocza w różnych specyficznych zastosowaniach. Obejmuje to na przykład liczbę i żywotność komórek, utlenianie komórek, aktywność mitochondriów, cytotoksyczność i tryb śmierci komórki, analizę cyklu komórkowego, ekspresję markerów powierzchniowych komórek i uwalnianie cytokin. W niniejszym badaniu opisano niezbędny sprzęt i przepływy pracy wymagane do takich badań w biomedycynie osocza. Opisuje prawidłowe działanie strumienia plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym, w szczególności monitorując jego podstawowe widma emisyjne i ustawienia gazu zasilającego w celu modulacji produkcji reaktywnych gatunków. Korzystając z wysoce precyzyjnej tabeli xyz i oprogramowania komputerowego, strumień jest unosił się z dokładnością do milisekund nad wnękami 96-dołkowych płytek z dokładnością do mikrometrów, aby zapewnić maksymalną powtarzalność. Pokazano dalsze testy do analizy cieczy cząsteczek aktywnych redoks, a komórki docelowe są poddawane działaniu plazmy. W szczególności komórki czerniaka są analizowane w efektywnej sekwencji różnych kolejnych testów, ale przy użyciu tych samych komórek: pomiaru aktywności metabolicznej, całkowitej powierzchni komórki i ekspresji markera powierzchniowego kalretykuliny, cząsteczki ważnej dla immunogennej śmierci komórek rakowych. Testy te pobierają bogate w zawartość informacje biologiczne o wpływie na osocza z pojedynczej płytki. Podsumowując, badanie to opisuje podstawowe kroki i protokoły badań medycznych nad osoczem.

Wprowadzenie

Gatunki reaktywne są ważnymi regulatorami redoks w chorobach, w tym w nieprawidłowym gojeniu się ran1 i raku. 2 Co ważne, gatunki te są zaangażowane w patologię, jak również w jej terapeutyczne rozwiązanie. 3,4 Zimna plazma fizyczna to zjonizowany gaz, który wyrzuca różnego rodzaju reaktywne substancje. 5 Od czasu pojawienia się tak zwanych zimnych plazm, które działają w temperaturze ciała6, zimna plazma może być stosowana do komórek i tkanek bez szkody termicznej. Wykazując skuteczność i bezpieczne stosowanie urządzeń plazmowych w obserwacjach przedklinicznych i klinicznych, trzy z nich uzyskały akredytację jako wyroby medyczne w Niemczech. 7 Szczególnie w odniesieniu do bezpieczeństwa genotoksycznego, kilka badań wykazało brak zdarzeń mutagennych przy użyciu pierwszego urządzenia, strumienia plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym. 8,9,10 Pozostałe dwa urządzenia to tak zwane dielektryczne wyładowania barierowe (DBD), które działają na innej zasadzie niż strumień plazmy. W szczególności dysze pozwalają na obróbkę powierzchni i ubytków jak skalpel, podczas gdy plazma DBD jest skuteczna w leczeniu większych, ale raczej płaskich obszarów tkanek. Wykorzystując komórkową sygnalizację redoks11, celem tej techniki jest wykorzystanie reaktywnych form generowanych przez plazmę do zastosowań biomedycznych. 12 Szczególnie obiecującym zastosowaniem klinicznej terapii plazmowej jest wspomaganie gojenia się ran. 13,14,15 Ponadto wykazano, że osocze ma działanie przeciwnowotworowe w modelach zwierzęcych. 16,17,18

Przed sprawdzeniem skuteczności i bezpieczeństwa aplikacji plazmy na modelach zwierzęcych, a nawet ludzkich, należy przeprowadzić standaryzowane badania in vitro z użyciem urządzeń plazmowych. Eksperymenty te są niezbędne do zbadania zastosowań plazmy i nakreślenia mechanizmów zachodzących w ich działaniu. Ponadto potrzebne są badania podstawowe, aby zrozumieć wpływ składu gatunków reaktywnych i wynikające z nich skutki biologiczne. Badanie to pokazuje, w jaki sposób osocze może zostać włączone do badań biomedycznych, aby lepiej zrozumieć i kontrolować jego wpływ na komórki. Opisano w nim dostrajanie składu gazu zasilającego, monitorowanie produkcji związków reaktywnych, zastosowanie osocza do cieczy, komórek i tkanek oraz wynikające z tego wyniki chemiczne i biologiczne. Ponadto podano przykłady, które instruują na temat standaryzacji leczenia osoczem i dalszych testów biologicznych, z naciskiem na badania medyczne nad osoczem wykonywane na 96-dołkowych płytkach. Takie podejście ma wyraźne zalety: i) minimalizację liczby komórek potrzebnych na warunek, kosztów odczynników i czasu pracy na próbkę; ii) przyzwolenie na większą dokładność wyników, ponieważ z łatwością można skonfigurować podwójne lub potrójne zabiegi; oraz iii) ułatwienie bezproblemowego oznaczania w dalszych etapach w 96-dołkowym czytniku płytek, obrazowaniu i eksperymentach z cytometrią przepływową.

Protokół

1. Monitorowanie i leczenie gatunków osocza

  1. Monitorowanie gatunków osocza
    1. Użyj strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym i maksymalnie dwóch standardowych litrów na minutę strumienia gazu zasilającego.
    2. Prostopadle do osi pióropusza, ustaw dżet przed optycznym spektrofotometrem emisyjnym i zarejestruj fotoemisję oraz długość fali (200 - 1000 nm) za pomocą dedykowanego oprogramowania.
    3. Zmieszaj 0,5% azotu lub tlenu z suchym lub wilgotnym (5%) gazem zasilającym.
    4. Powtórzyć optyczną spektroskopię emisyjną dla każdego stanu gazu.
    5. Analizuj za pomocą oprogramowania odpowiedniego do graficznego przedstawiania danych.
  2. Konfiguracja obróbki plazmowej
    1. Przymocuj dyszę do sterowanej komputerowo tabeli xyz.
    2. Zidentyfikuj położenie studzienek i wygeneruj skrypt komputerowy, aby przesunąć dyszę połączoną ze stołem, z odpowiednimi czasami obróbki, powyżej środka każdej studzienki.
    3. Dodać 104 dowolnego rodzaju przylegających komórek ssaków w 100 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych (RPMI1640 z 10% FCS, 2% glutaminą i 1% penicyliny/streptomycyny) do kilku studzienek pod okapem z przepływem laminarnym.
    4. Pozwól, aby adhezja komórkowa zaszła przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla.
    5. Traktuj komórki osoczem przez 20 s na różnych wysokościach (oś z) w odstępach 250 μm.
    6. Dodać 25 μl jodku propidyny w pożywce do hodowli komórkowej do każdego dołka.
    7. Zobrazuj komórki pod mikroskopem, aby określić konkretną wysokość, która nie wywołuje martwicy komórek z powodu gazu zasilającego, który popycha pożywkę hodowlaną na wierzch komórek na bok.
      UWAGA: W przypadku dłuższych czasów uzdatniania, należy zidentyfikować parowanie cieczy na tej konkretnej wysokości, w trybie włączania i wyłączania plazmy, ważąc płytkę przed i po obróbce plazmowej, aby określić ilość mikrolitrów podwójnie destylowanej wody niezbędną do przywrócenia homeostazy osmotycznej w traktowanych studzienkach.
    8. Przygotuj końcowy protokół dla tabeli xyz z odpowiednimi czasami obróbki (tutaj: 20 s, 40 s, 60 s plazmy i 60 s kontroli gazu) i pozycjami studzienek, a także przygotuj wielokanałowe pipety i zbiorniki do obsługi cieczy na płytkach 96-dołkowych w kolejnych testach.

2. Analiza głównych składników reaktywnych w cieczach poddanych obróbce plazmowej

  1. Analiza nadtlenku wodoru poddanego obróbce plazmowej
    1. Potraktować 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) osoczem w trzech powtórzeniach na płaskich 96-dołkowych płytkach.
    2. Przygotować mieszankę wzorcową, ładując 100 μl PBS 10 j. peroksydazy chrzanowej i 5 μM odczynnika do wykrywania nadtlenku wodoru (wystarczające na jedną studzienkę; odpowiednio zwiększać).
    3. Dodać 95 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki.
      UWAGA: Poprzedni krok należy wykonać na czystym stole lub w pomieszczeniu oddzielonym od źródła plazmy, ponieważ ozon w powietrzu otoczenia może zmniejszyć czułość testu.
    4. Na osobnej płytce przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń nadtlenku wodoru w PBS o najwyższym stężeniu 100 μM w 100 μl PBS.
    5. Dodać 5 μl próbek lub wzorców nadtlenku wodoru do studzienek zawierających odczynnik do wykrywania.
    6. Dołącz studzienki zawierające odczynnik detekcyjne tylko do odjęcia tła po odczycie.
    7. Inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek mierzących fluorescencję przy λex 535 nm i λem 590 nm.
      UWAGA: Jeżeli w próbkach spodziewane są wysokie stężenia nadtlenków, należy zwiększyć rozcieńczenie próbki lub dokonać odczytów z krótszym czasem inkubacji, aby uniknąć nasycenia testu.
    9. Odejmij wartości ślepej próby od wszystkich próbek, oblicz krzywą wzorcową nadtlenku i określ ilościowo nieznane stężenia nadtlenku próbki na podstawie tej krzywej podstawowej.
  2. Analiza azotynów poddanych działaniu osocza
    1. Potraktować 100 μl PBS osoczem w trzech egzemplarzach na płaskich 96-dołkowych płytkach.
    2. Przygotować główną mieszaninę roztworu do wykrywania azotynów, dodając 1 μl odczynnika do oznaczania ilościowego do 99 μl podwójnie destylowanej wody (wystarczająca na jeden studzienek; odpowiednio zwiększyć).
    3. Dodaj 100 μl na studzienkę do przezroczystej, płaskiej płytki 96-dołkowej. Skaluj w górę zgodnie z potrzebami dla liczby studni.
    4. Przygotować serię rozcieńczeń wzorców azotynów w wodzie podwójnie destylowanej.
    5. Dodać 10 μl wzorców lub próbek do mieszanki wzorcowej w płytkach 96-dołkowych.
    6. Inkubować płytkę w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Do każdej studzienki dodać 5 μl roztworu wywoływacza do oznaczania ilościowego azotynów.
    8. Odczyt fluorescencji w czytniku mikropłytek przy λex 365 nm i λem 450 nm.
    9. Odejmij wartości ślepej próby od wszystkich próbek, oblicz krzywą wzorcową azotynów i określ ilościowo nieznane stężenia azotynów w próbce na podstawie tej krzywej podstawowej.
  3. Analiza ponadtlenku poddanego obróbce plazmowej
    1. Przygotować główną mieszaninę utlenionego cytochromu (1 mg/ml) i katalazy (20 μg/ml) w PBS.
    2. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do dołków na klarownej, 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
    3. Mieszaninę wzorcową należy traktować osoczem w trzech egzemplarzach dla każdego warunku poddawania działaniu substancji.
    4. Odczytać absorbancję przy długości fali 550 nm za pomocą czytnika mikropłytek; dane należy narysować na wykresie.
    5. Obliczyć ilość wytworzonego ponadtlenku za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji cytochromu C i długości drogi światła cieczy w studzience.

3. Odpowiedź biologiczna komórek wystawionych na działanie osocza

  1. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: aktywność metaboliczna
    1. Użyj okapu z przepływem laminarnym do wszystkich poniższych procedur.
    2. Wysiew 104 komórek (mysi czerniak B16) w 100 μl w pełni uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowej na basenie na płaskie 96-dołkowe płytki.
    3. Pozostawić adhezję komórkową przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla.
    4. Korzystając z tabeli xyz, potraktuj studzienki samą plazmą lub gazem zgodnie z predefiniowanym schematem i dodaj komórki z powrotem do inkubatora na 20 godzin
      UWAGA: W razie potrzeby po 20 godzinach zdjąć supernatanty w celu analizy produktów zewnątrzkomórkowych; Następnie dodać 100 μl świeżej pożywki.
    5. Do każdego dołka dodać 25 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 500 μM rezazuryny (końcowe stężenie 100 μM); przygotować trzy studzienki zawierające samą rezazurynę w pożywce do hodowli komórkowej bez komórek do odejmowania tła.
    6. Inkubować przez 3 godziny w inkubatorze.
    7. Odczyt fluorescencji przy λex 535 nm i λem 590 nm w czytniku mikropłytek.
    8. Odejmij fluorescencję tła od wszystkich próbek i znormalizuj dane, aby kontrolować wartości.
  2. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: analiza obrazu
    1. Użyć płytki studzienkowej z ppkt 3.1.7 i odrzucić supernatant.
    2. Dodać 100 μl pożywki do hodowli świeżych komórek zawierającej 1 μg/ml jodku propidyny.
    3. Umieść płytkę pod mikroskopem ze zmotoryzowanym stolikiem, aby zobrazować każdą studzienkę.
      UWAGA: Szczegóły obrazowania zależą od pytania eksperymentalnego; w tym przypadku obiektyw 20X został użyty w urządzeniu do obrazowania o wysokiej zawartości do odczytu pól widzenia 3x3 w każdej studzience w kanale jasnego pola, cyfrowym kanale kontrastu fazowego i kanale fluorescencji (jodku propidyny), wykorzystując odpowiednie światło wzbudzenia i filtry emisyjne.
    4. Użyj oprogramowania do ilościowej analizy obrazu, aby określić całkowitą powierzchnię cytozolową na cyfrowych obrazach kontrastu fazowego wszystkich pól widzenia obrazowanych w każdym dołku.
      UWAGA: W razie potrzeby przeanalizuj dalsze parametry, na przykład liczbę żywotnych i/lub martwych komórek lub aktywność mitochondriów za pomocą dedykowanych barwników. W przypadku stosowania innych barwników niż opisane w tej pracy, należy upewnić się, że barwienia fluorescencyjne używane do mikroskopii nie pokrywają się spektralnie z fluorochromami stosowanymi w kolejnych eksperymentach cytometrii przepływowej.
    5. Sporządzić wykres danych i w razie potrzeby przetestować korelację z wartościami uzyskanymi dla aktywności metabolicznej.
  3. Wielowymiarowy odczyt komórek poddanych działaniu plazmy: cytometria przepływowa
    1. Do tej analizy należy użyć płytki studzienkowej z kroku 3.2.5.
    2. Odrzucić supernatant i przemyć dwukrotnie 200 μl PBS zawierającego wapń i magnez (odpowiednio 0,9 mM i 0,5 mM).
      UWAGA: Na tym etapie należy utrwalić i/lub przeniknąć komórki w celu uzyskania dalszych odczytów biologicznych nieuwzględnionych w tym wkładzie, takich jak barwienie antygenu wewnątrzkomórkowego lub analiza cyklu komórkowego.
    3. Do każdej studzienki dodać 50 μl PBS z wapniem i magnezem zawierającym 50 ng/ml przeciwciał monoklonalnych przeciwko mysiej kalretykulinie.
    4. Inkubować przez 15 minut w inkubatorze.
    5. Przemyć dwukrotnie 200 μl w pełni uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych i wylać płyn na płytkę.
    6. Dodać 100 μl roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w inkubatorze.
    7. Użyj innego zestawu niebarwionych komórek B16 w zawiesinie, aby skonfigurować protokół akwizycji cytometrii przepływowej, strategię bramkowania oraz wzmocnienia i napięcia fotodetektorów.
    8. Załadować płytkę do cytometru przepływowego wyposażonego w automatyczny próbnik do płytek 96-dołkowych.
    9. Zdobądź co najmniej 1,000 komórek w populacji rozproszonej do przodu i bocznej, zwykle związanej z komórkami żywotnymi.
    10. Skorzystaj z oprogramowania dedykowanego do analizy cytometrii przepływowej, plików .fcs do wyznaczenia interesującej nas populacji i wyznaczenia średniej intensywności fluorescencji kalretykuliny.
      11. Proszę sporządzić
    11. wykres danych i, w razie potrzeby, przetestować korelację z wartościami uzyskanymi dla aktywności metabolicznej, obrazowania i/lub osadzania utleniacza.

Wyniki

W niniejszym badaniu opisano usprawniony schemat postępowania dla badań medycznych nad działaniem plazmy. Zastosowane tutaj podejście multidyscyplinarne obejmuje analizę podstawowego profilu emisji optycznej strumienia plazmy, głównych komponentów reaktywnych w cieczy oraz odpowiedzi biologicznych komórek traktowanych plazmą (Rysunek 1).

Do przeprowadzenia tego procesu niezbędna była liczba komponentów w celu prawidłowego skonfigurowania źródła plazmy (Rysunek 2). Różne gazy (tutaj głównie argon, tlen i azot) były dostarczane i kontrolowane przez kilka kontrolerów przepływu masowego. Do cyfrowej regulacji kontrolerów przepływu masowego do określonych strumieni gazów zasilających wykorzystano panel centralny. Aby uzyskać konkretne składy gazów zasilających, gazy były mieszane fizycznie za pomocą panelu zaworów łączących gazy z kilku kontrolerów przepływu masowego (Rysunek 2A). Włączono źródło plazmy, a strumień plazmy ustawiono przed spektrofotometrem USB (Rysunek 2B) o zakresie optycznym od 200 nm do 1 000 nm. Do obróbki cieczy i komórek opisano wydajny proces z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych. Płytki wielodołkowe utrzymywano na miejscu za pomocą plastikowej ramy przymocowanej do płyty bazowej za pomocą wstawek dopasowanych do jej wytłoczonych otworów (Rysunek 2C). Cały zestaw umieszczono pod laminarną komorą przepływową (Rysunek 2D). Układ ten obejmował stół xyz, do którego zamontowano ręczną końcówkę strumienia plazmy. Elementy sterowania silnikiem mogą znajdować się poza stanowiskiem, jeśli posiada ono wystarczająco duże porty kablowe do i od stołu xyz. Co istotne, stół był sterowany komputerowo i można go zaprogramować tak, aby strumień znajdował się nad środkiem każdego dołka z mikrometryczną precyzją przez pożądany czas. Ponadto pozycja startowa (w naszym układzie dołek A1) była dowolnie wybrana (Rysunek 2E). Wraz z plastikowym uchwytem płytek pozwoliło to na powtarzalną obróbkę plazmową, przy czym wszelkie różnice między dniami wynikały wyłącznie z przygotowania eksperymentów ciekłych i biologicznych.

Spektroskopia emisyjna (OES) została wykorzystana do śledzenia poszczególnych pików powiązanych z reaktywnymi składnikami plazmy w różnych warunkach gazu doprowadzanego (Rysunek 3A). Na przykład drugi układ pozytywny azotu z pikami od 330 nm do 380 nm reprezentował reaktywne formy azotu, a pik przy 309 nm reprezentował rodniki hydroksylowe (strzałka na Rysunku 3A). W porównaniu z samym argonem, obecność form azotu wzrosła po dodaniu azotu do gazu doprowadzanego, natomiast dodatek tlenu lub wilgoci odpowiednio ją osłabił lub zmniejszył. Z kolei obecność rodników hydroksylowych zmalała przy zastosowaniu tlenu lub azotu, ale wyraźnie wzrosła, gdy jako gaz doprowadzający zastosowano wilgotny argon. W przypadku obróbki cieczy plazmą, najpierw określono parowanie wywołane przez gaz argonowy oraz plazmę argonową (Rysunek 3B). Co istotne, obie warunki nie dały podobnych wyników, ponieważ plazma wpływa również na temperaturę. Zgodnie z wynikami OES dla rodników hydroksylowych, osadzanie nadtlenku wodoru znacząco zmalało przy domieszce tlenu lub azotu, ale wzrosło przy zastosowaniu wilgotnego gazu doprowadzającego (Rysunek 3C). Ponadto dodatek azotu do gazu doprowadzającego doprowadził do znacznie wyższych stężeń azotynów w porównaniu z cieczami poddanymi działaniu plazmy argonowej (Rysunek 3D). Ten schemat postępowania można również zastosować do badania wpływu plazmy na ciecze o różnym składzie. Na przykład stężenia nadtlenku wodoru wydawały się być niezależne od obecności płodowego surowicy bydlęcej w PBS i pożywce do hodowli komórkowej RPMI1640 (Rysunek 3E). W tych samych próbkach obecność surowicy zmniejszyła stężenia azotynów w PBS i pożywce do hodowli komórkowej w porównaniu z ich odpowiednikami niezawierającymi surowicy (Rysunek 3F). Najwięcej ponadtlenku produkowano w warunkach suchego argonu, przy czym domieszki tlenu i/lub azotu znacząco tłumiły generowanie ponadtlenku, z wyjątkiem wilgotnej plazmy argonowo-tlenowej (Rysunek 3G).

W celu przeprowadzenia obróbki plazmowej komórek w naczyniach wielodołkowych, płytkę zawierającą komórki wysiane dzień wcześniej wyjęto z inkubatora i umieszczono w plastikowym uchwycie. Zastosowano zaprogramowany wzór obróbki, skompensowano parowanie, a następnie płytkę umieszczono z powrotem w inkubatorze na 20 h. Należy zauważyć, że po tej inkubacji nadnadpłyny z hodowli komórkowych można było zebrać do nowej, pustej płytki 96-dołkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu oceny białek zainteresowania. Następnie do komórek w każdym dołku dodano rezazurynę. Przekształcenie niefluorescencyjnej rezazuryny w fluorescencyjną rezorufinę było możliwe tylko dzięki aktywnym enzymom generującym NADPH i korelowało z ogólną aktywnością metaboliczną (Rysunek 4A). Intensywności fluorescencji były zbliżone do wizualnego odbioru płytki i wskazywały na efekty cytotoksyczne przedłużonej obróbki plazmą (Rysunek 4B). Warunki z nawilżonym gazem były bardziej szkodliwe niż warunki z suchym gazem. Te same komórki w płytce wykorzystano do dalszych analiz. Komórki w płytce poddano badaniu mikroskopowemu (Rysunek 4C). Przy użyciu oprogramowania do obrazowania przebadano kilka dołków płytki w celu porównania jakościowego (Rysunek 4D). Oprogramowanie umożliwiło kwantyfikację całkowitej powierzchni zajętej przez komórki w polach widzenia uzyskanych w każdym dołku, a uzyskane dane znormalizowano względem odpowiednich kontroli (Rysunek 4E). W próbkach poddanych obróbce plazmą zaobserwowano zmniejszenie całkowitej powierzchni komórek, szczególnie w warunkach z nawilżonym gazem zasilającym. Po obrazowaniu komórki przemyto, zabarwiono przeciwciałami przeciwko mysiej kalretikulinie, ododerwano i przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 4F). Obliczono średnie intensywności fluorescencji zabarwienia kalretikuliny w żywych komórkach (Rysunek 4G) i porównano je pomiędzy próbkami (Rysunek 4H). Obróbka plazmą wywołała zwiększenie ekspresji kalretikuliny na powierzchni mysich komórek czerniaka, co odpowiadało czasowi obróbki plazmą zastosowanemu w warunkach z suchym gazem zasilającym. W przypadku nawilżonego gazu zasilającego, obróbka trwająca 20 s i 40 s wywołała silniejszą ekspozycję kalretikuliny w porównaniu do bardziej letalnego czasu obróbki wynoszącego 60 s. Sugeruje to nieliniową regulację ekspozycji kalretikuliny w zależności od ilości utleniaczy wprowadzonych do komórek.

Schemat spektroskopii plazmy; domieszka gazu zasilającego; funkcja komórki; analiza komponentów reaktywnych.
Rycina 1: Schemat badań medycznych nad plazmą od fizyki do biologii. Wytwarzanie gatunków reaktywnych przez strumień plazmy argonowej pod ciśnieniem atmosferycznym jest regulowane poprzez modulację gazu zasilającego. Wybrane cząsteczki w fazie gazowej plazmy są monitorowane za pomocą spektroskopii. Plazma jest wykorzystywana do traktowania cieczy i badania osadzania utleniaczy. Komórki hodowane na mikropłytkach są poddawane działaniu plazmy, a następnie przeprowadzane są odczyty biologiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ spektroskopii emisyjnej z zasilaniem gazowym, strumieniem plazmy, płytką 96-dołkową i sterowaniem komputerowym.
Rysunek 2: Budowa stanowiska badawczego do badań plazmy. (A) Różne gazy w rurkach ze stali nierdzewnej są tłoczone do kilku sterowników przepływu masowego, którymi steruje się za pomocą centralnego panelu. Następnie poszczególne składy gazów zasilających są mieszane przy użyciu panelu zaworów. (B) Niektóre reaktywne komponenty plazmy mogą być monitorowane za pomocą spektroskopii emisyjnej w celu zbadania różnic pomiędzy różnymi składami gazów zasilających. (C) Do wysokoprzepustowych badań plazmy stosuje się mikropłytki 96-dołkowe. Aby zapewnić stały punkt startowy dla programowalnej i zautomatyzowanej obróbki plazmą, płytkę umieszcza się w ramie gwarantującej taką samą bezwzględną pozycję płytek z dnia na dzień. (D) Strumień plazmy jest przymocowany do sterowanego komputerowo stołu xyz znajdującego się pod komorą z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie 96 dokładnych lokalizacji oraz czas przebywania plazmy nad każdym dołkiem są zapisywane w pliku programu sterującym ruchem źródła plazmy. Główna obudowa aparatury strumienia plazmy oraz sterowniki silników znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie. (E) Zautomatyzowana obróbka plazmą płytki 96-dołkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy analizy gazu plazmy przedstawiające liczbę fotonów, szybkości odparowania oraz dane dotyczące stężenia związków chemicznych.
Rycina 3Analiza strumienia plazmy i cieczy. (APrzedstawiono spektroskopię emisyjną dla różnych warunków gazu zasilającego. Drugi układ pozytywny azotu (od 330 nm do 380 nm) uległ wzmocnieniu przy domieszce azotu, był nieobecny w przypadku domieszki tlenu i wyraźnie zmniejszył się przy zastosowaniu wilgotnego argonu (panele po lewej stronie). Pik rodników hydroksylowych przy 309 nm (strzałka) zmniejszył się w warunkach z azotem i tlenem, ale wyraźnie wzrósł przy zastosowaniu wilgotnego argonu w porównaniu do samego argonu.BEkspozycja cieczy na gaz prowadzi do parowania. Ilość odparowanej cieczy z poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej po traktowaniu samą plazmą oraz samym argonem określono poprzez ważenie płytki przed i po zabiegu przy użyciu wagi precyzyjnej. Parowanie w próbkach traktowanych plazmą było większe w porównaniu do próbek traktowanych argonem.C) Generowanie nadtlenku wodoru w cieczach poddanych działaniu plazmy korelowało w pewnym stopniu z pikiem rodników hydroksylowych przy 309 nm w (A). Plazma argonowa z dodatkiem wilgoci (5%) zwiększyła stężenia nadtlenku około 4-krotnie. (DPoziom azotynów wzrósł po dodaniu azotu do gazu zasilającego, a efekt ten nasilił się przy zastosowaniu plazmy argonowej z nawilżeniem. Dodatek tlenu zmniejszył generowanie azotynów, jednak nie w sposób znaczący.E, F) Stężenia nadtlenku wodoru i azotynów przedstawiono dla różnych rodzajów cieczy, mianowicie pożywki do hodowli komórkowej RPMI1640 z (R10F) i bez (R0F) dodatków, a także dla PBS z i bez dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (FCS). Poziomy nadtlenku nie różniły się pomiędzy poszczególnymi pożywkami (E), podczas gdy poziomy azotynów uległy znacznemu obniżeniu w obecności surowicy. (GProdukcja anionorodnika ponadtlenkowego była najwyższa w przypadku zastosowania suchego argonu jako gazu zasilającego; domieszka azotu, tlenu lub nawilżonego argonu skutkowała mniejszym osadzaniem się ponadtlenku w cieczy. Przedstawione dane (B-G) są średnimi ± SEM z dwóch do trzech eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono (C, D) przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w celu porównania średnich dla całych grup w warunkach podawania suchego lub wilgotnego gazu w odniesieniu do odpowiedniej grupy kontrolnej (** p <0,01; *** p <0,001). Ponadto warunki plazmy składającej się wyłącznie z argonu porównano, wykorzystując średnią dla całej grupy oraz test t (### p <0,001). Dalszą analizę statystyczną (F) przeprowadzono z wykorzystaniem testów t, porównując wartości dla każdego rodzaju obróbki plazmą oraz warunków hodowli w próbkach z dodatkiem FCS i bez FCS (* p <0,05; ** p <0,01); ponadto, za pomocą testu t porównano roztwory zawierające FCS i niezawierające FCS w obrębie każdego czasu ekspozycji plazmy (# p <0,05; ## p <0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza fluorescencyjna na mikropłytce; wykresy słupkowe; konfiguracja cytometru; obróbka plazmą gazową; żywotność komórek.
Rysunek 4: Obróbka plazmą i jej wpływ na komórki. (A) Komórki poddano działaniu plazmy, a po 20 h dodano rezazurynę w celu oceny aktywności metabolicznej. (B) Aktywność była znacznie niższa w próbkach traktowanych plazmą w porównaniu do kontroli gazowej. Wyraźny spadek zaobserwowano przy nawilżeniu gazu zasilającego, natomiast dodanie tlenu i/lub azotu prowadziło do toksyczności zarówno w warunkach suchego, jak i wilgotnego argonu. (C) Dodano pożywkę zawierającą jodek propidyny (PI). (D) Przedstawiono widok ogólny studzienek płytki, gdzie cyfrowy kontrast fazowy (pomarańczowy) reprezentuje frakcję cytozolową każdej komórki, a PI (zielony) służy do identyfikacji martwych komórek. Narzędzia obrazowania pozwoliły na ilościowe określenie całkowitego obszaru zajętego przez komórki w polu widzenia każdej studzienki. (F) Następnie komórki przemyto i inkubowano z przeciwciałami lub innymi markerami komórkowymi w celu charakterystyki biologicznych efektów plazmy przy użyciu cytometrii przepływowej. (G) Zastosowano strategie bramkowania, a następnie przeprowadzono i porównano analizę markerów pomiędzy próbkami. Przedstawione dane (B, E, H) określają średnią +SEM z jednego reprezentatywnego z trzech niezależnych doświadczeń. Pasek skali = 200 µm (D). Porównanie statystyczne przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (B, H), porównując dla każdego warunku gazowego każdą obróbkę plazmą z odpowiednią kontrolą gazową (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001). Dodatkowo wartości dla każdego warunku domieszek azotu i/lub tlenu porównano z wartościami dla plazmy argonowej osobno dla warunków suchych i wilgotnych (dwuczynnikowa analiza wariancji; ### p <0.001). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Badania podstawowe mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia skuteczności i mechanizmów leżących u podstaw leków osoczowych w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Badania podstawowe sprzyjają również badaniom nad nowymi zastosowaniami w leczeniu. Chociaż powszechnie wiadomo, że plazma pośredniczy w swoich efektach biologicznych poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu i azotu19, nadal istnieją trzy główne wyzwania w tej dziedzinie. Po pierwsze, które gatunki są ważne? Częściową odpowiedź na to pytanie można uzyskać, modulując skład gazu zasilającego plazmę za pomocą diagnostyki optycznej i odczytów biologicznych. 20 Po drugie, jakie efekty można zaobserwować w przypadku celów biologicznych, takich jak komórki? Problem ten jest przynajmniej częściowo rozwiązany za pomocą eksperymentów z hodowlami komórkowymi i szeregu testów. W komórkach eukariotycznych efekty są plejotropowe, w tym zatrzymanie cyklu komórkowego21, apoptoza22, martwica23 i stymulacja komórek skóry 24,25,26, a także wspomaganie lub zmniejszanie ruchliwości komórek lub aktywności metabolicznej 27,28,29. Trzecim wyzwaniem, związanym z tymi efektami plejotropowymi, jest zidentyfikowanie kluczowych cząsteczek, które determinują odpowiedź komórkową na utleniacze pochodzące z osocza, aby wyjaśnić różne efekty często obserwowane w różnych typach komórek. Można to osiągnąć za pomocą technik omicznych 30,31,32 i/lub regulacji w górę lub w dół docelowych genów za pomocą inhibitorów sygnalizacji siRNA (redoks), przeciwutleniaczy i enzymów przeciwutleniających, a także modulacji produkcji reaktywnych składników osocza. 33,34,35 W związku z tym potrzebne są uproszczone protokoły testowe do testowania większych zestawów próbek z dużą liczbą iteracji.

Badanie to jest przykładem wydajnego eksperymentalnego przepływu pracy, od fizyki po biologię, w badaniach medycznych nad plazmą w odniesieniu do wyżej wymienionych wyzwań. Szczegóły dotyczące inżynieryjnych aspektów źródła plazmy i jej wytwarzania zostały opisane wcześniej. 36,37,38 Wszystkie te testy są wykonywane na płytkach 96-dołkowych, co ma wiele zalet. Na przykład próbki, takie jak supernatanty z hodowli komórkowych, można łatwo przenosić z testu na płytki pobraniowe w celu zbadania, na przykład, stężeń białek za pomocą testu immunoenzymatycznego. Jeśli dostępny jest sprzęt naukowy zdolny do odczytu bezpośrednio z 96 dołków, takie podejście minimalizuje koszty na próbkę i czas oczekiwania oraz maksymalizuje wyniki poprzez multipleksowanie różnych testów z tej samej próbki. Zastosowanie pipet wielokanałowych dodatkowo przyspiesza obsługę próbek. Zasadniczo opisany tutaj test można również przeprowadzić przy użyciu płytek studzienkowych o większych średnicach, chociaż wymagałoby to dodatkowych etapów pipetowania do innych probówek i naczyń do dalszych testów. Mniejsze typy płytek, takie jak płytki 384-dołkowe, nie prezentują jednak geometrii odpowiedniej do badań plazmy biomedycznej przy użyciu dżetów o dużych strumieniach gazu zasilającego. W szczególności nie można zagwarantować, że podczas zabiegu naruszone zostaną tylko pojedyncze, ale nie sąsiednie studnie.

Analiza cieczy jest niezbędna do zbadania osadzania się gatunków przez osocze. W analizach eksperckich równoległe ustawienie różnych testów może scharakteryzować ciecze poddane działaniu plazmy w odniesieniu do różnych utleniaczy w tym samym czasie. To multipleksowanie pozwala na opracowanie zróżnicowanego obrazu gatunków pochodzących z plazmy. Opisane podejście jest bardzo czułe w badaniu stężeń nadtlenku wodoru39, co często jest konieczne, ale nie zawsze wystarczające do wyjaśnienia wpływu na plazmę. 40,41,42 Biologicznie istotne efekty można również ocenić w płynach, w których nie uwzględniono tutaj testu glutationu. 43 Specyficzny test azotynów jest zdecydowanie zalecany w porównaniu z konwencjonalnymi testami Griessa ze względu na 10-krotnie wyższą czułość testu (dane nie pokazane). Ciecze poddane działaniu osocza można również badać pod kątem tworzenia się kwasu podchlorawego za pomocą testu DTNB. Jednak wcześniejsze wyniki nie wskazywały na formowanie się tego gatunku z naszym źródłem plazmy. 19,39,44 Po zakończeniu obróbki osoczem, z czasem następuje degradacja gatunków. Azotyn reaguje z azotanem; Z czasem zużywa się również nadtlenek. Procesy te trwają jednak kilka godzin. 35 Absorpcja cytochromu c jest stabilna również przez kilka godzin. W związku z tym, jeśli procesy zachodzą w ciągu pierwszych 30 minut po zabiegu, różnice w stężeniach opisywanych tutaj gatunków długowiecznych są nieistotne. Należy jednak zachować ostrożność podczas badania niektórych rodzajów pożywek (np. Zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco), ponieważ składniki mogą wymiatać do 90% nadtlenku w ciągu 1 godziny (dane nie pokazane), co prowadzi do niedoszacowania osadzania się nadtlenku w osoczu w cieczach.

Przedstawiono test multipleksowy, który obejmuje badanie aktywności metabolicznej w obszarze komórki (morfologia) do ekspresji markerów na powierzchni komórki. Połączenie tych testów może przynieść interesujące wyniki. Na przykład wcześniej wykazaliśmy w monocytach THP1, że aktywność metaboliczna i liczba komórek nie zmniejszają się w sposób liniowy po ekspozycji na osocze. 45 Raczej, wraz ze wzrostem czasu leczenia osoczem, zaobserwowano, że komórki zwiększyły się i miały większą masę mitochondrialną, co prowadziło do wyższego tempa metabolizmu w przeliczeniu na komórki. Zasadniczo, połączenie czytnika wielopłytkowego, mikroskopii i cytometrii przepływowej multipleksuje informacje na temat odpowiedzi komórkowych po leczeniu osoczem. W komórkach czerniaka skupiamy się tutaj na działaniu cytotoksycznym i ich immunogenności, w której pośredniczy kalretykulina. 46 Zasadniczo za pomocą tego podejścia można odpowiedzieć na wiele innych pytań, łącząc aktywność metaboliczną z wynikami obrazowania i cytometrii przepływowej. Na przykład różnicowanie komórek (np. polaryzacja makrofagów), potencjał błony mitochondrialnej, analiza cyklu komórkowego, ruchliwość komórek, biomechanika lub tworzenie mikrojąder w celu analizy genotoksyczności mogą być również badane w komórkach poddanych działaniu plazmy. Wielokolorowa cytometria przepływowa pozwala na jeszcze więcej zastosowań w różnych populacjach komórek w tym samym czasie. Obejmuje to na przykład analizę stanu fosforylacji białek sygnałowych, takich jak czynniki transkrypcyjne, kwantyfikacja mRNA, pomiar cytokin wewnątrzkomórkowych i/lub ocena całkowitej zredukowanej zawartości tioli na poziomie pojedynczej komórki. Dodatkowe informacje biologicznie istotne, które są dostępne dla każdej próbki, pomagają w dalszym rozwijaniu obrazu efektów redoks w osoczu, aby lepiej zrozumieć obecne i przyszłe zastosowania plazmy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (granty BMBF o numerach 03Z22DN11 i 03Z22DN12) jest z wdzięcznością za uznanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do wykrywania amplex Ultra Red 423201
BioLegend (zawiera peroksydazę chrzanową i H2O2)ThermoA36006
argon gazowyAir LiquideN50
B16F10 mysie komórki czerniakaATCCCRL-6475
katalazaSigmaC30
inkubatorhodowli komórkowychSpoiwoCB210
plastikowa hodowla komórkowaNUNC156545
cytochrom c, utlenionaanaliza danych SigmaC2037
oprogramowania GraphPad7.03
płodowa surowica bydlęcatestowana partiamiSigma
dowolna dokładna skalaz rozdzielczością 0,01 mg
cytometr przepływowyBeckman-CoulterCytoFlex S
Zestaw do wykrywania azotynów Measure-iTMikroskop ThermoM36051
PerkinElmerOperetta CLS
spektroskopia optyczna emsjiAvantesAvaSpec-DDDD-2-USB2
pipety do penicyny/streptomycynyThermo15140122
Eppendorf/Brandsingle/multi chanel
czytnik płytekTecanM200pro
jodek propydynyBioLegend421301
resazurinVWRB21187.06
RPMI1640 podłoża do hodowli komórkowychPanbioTechP04-16500
xyzstół CNC stopieńHIGH-Z S-400/T 
accutase pryzmat Analiza danych cytometrii przepływowej Oprogramowanie do obrazowania G-Platamina Glutamina G7513 Oprogramowanie do obrazowania PerkinElmer Harmony 4.5 Regulator przepływu masowego Thermo Maxisafe 2020 MKS G-series

Bibliografia

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667(2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868(2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653(2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048(2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576(2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041(2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401(2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072(2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872(2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401(2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203(2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098(2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518(2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695(2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Plazmowy jet argonowy pod ciśnieniem atmosferycznymspektroskopia emisyjnapozycjonowanie na stole XYZtesty na płytkach 96-dołkowychpomiar aktywności metabolicznejanaliza ekspresji kalretikulinyanaliza cytometrycznafluorometryczny test z rezazurynątraktowanie komórek czerniaka
Badania podstawowe w medycynie osocza - podejście przepustowe od płynów do komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.