Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Summary

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Abstract

Test przerzutów do płuc (PuMA) to system eksplantacji płuc ex vivo i hodowli komórek zamkniętych, który pozwala badaczom badać biologię kolonizacji płuc w kostniakomięsaku (OS) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis protokołu i omawia przykłady uzyskiwania danych obrazowych dotyczących wzrostu przerzutów za pomocą platform mikroskopii fluorescencyjnej szerokopolowej lub konfokalnej. Elastyczność modelu PuMA pozwala naukowcom nie tylko badać wzrost komórek OS w mikrośrodowisku płuc, ale także oceniać efekty terapii przeciwprzerzutowych w czasie. Mikroskopia konfokalna pozwala na bezprecedensowe obrazowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji komórek OS z miąższem płuca. Co więcej, gdy model PuMA zostanie połączony z barwnikami fluorescencyjnymi lub fluorescencyjnymi reporterami genetycznymi białek, naukowcy mogą badać mikrośrodowisko płuc, struktury komórkowe i subkomórkowe, funkcję genów i aktywność promotora w przerzutowych komórkach OS. Model PuMA stanowi nowe narzędzie dla badaczy kostniakomięsaka do odkrywania nowej biologii przerzutów i oceny aktywności nowych leków przeciwprzerzutowych, celowanych.

Introduction

Poprawa wyników dla pacjentów pediatrycznych z kostniakomięsakiem z przerzutami (OS) nadal pozostaje krytyczną, niezaspokojoną potrzebą kliniczną ¹. Podkreśla to znaczenie opracowywania nowych terapii ukierunkowanych molekularnie. Konwencjonalne chemioterapeutyki, które są ukierunkowane na proliferację komórek nowotworowych, nie okazały się skuteczne w leczeniu choroby przerzutowej, a zatem nowe strategie muszą być ukierunkowane na sam proces przerzutowy ². W niniejszym artykule omówiono praktyczne aspekty stosunkowo nowego typu modelu przerzutów do płuc ex vivo, testu przerzutów do płuc (PuMA) opracowanego prze....

Protocol

Wszystkie protokoły na zwierzętach, z których uzyskano dane obrazowe, zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt National Cancer Institute, National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt omówione i przedstawione w artykule wideo zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

1. Przygotowanie komórek nowotworowych do iniekcji i materiałów do modelu PuMA

UWAGA: Ilość roztworów i komórek wystarczy na 1 mysz. W razie potrzeby zwiększ skalę, jeśli w badaniu wykorzystano więcej myszy. Przepisy dotyczące pożywek znajdu....

Results

Mikroskopia fluorescencyjna szerokokątna o małym powiększeniu

Dla szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej wycinków płuc PuMA, reprezentatywne obrazy i dane kwantyfikacyjne są pokazane w Rysunek 2C, oraz Rysunek 4A i B. Skłonności przerzutowe do linii komórkowych o wysokich i niskich przerzutach są wizualnie widoczne w postęp.......

Discussion

Poniższy artykuł techniczny opisuje niektóre praktyczne aspekty modelu PuMA w badaniu kolonizacji płuc w OS. Niektóre krytyczne kroki w protokole, w których badacze powinni zachować szczególną ostrożność, obejmują:

a) Kaniulacja tchawicy. Tchawica może zostać łatwo uszkodzona podczas preparowania otaczających mięśni i tkanki łącznej. Ponadto igłę cewnika można łatwo przepchnąć przez tchawicę. Zwróć szczególną uwagę na to, jak skos igły wchodzi do tchawicy podczas wprowadzania kaniuli.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tabela 2
Odczynniki do hodowli komórkowych dla pożywek A, B-pożywki i pożywek kompletnych
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	wysoce przerzutowa linia komórkowa OS
HOS	ATCC	CRL-1543	słabo przerzutowa linia komórkowa OS
MG63.3	Laboratorium Amy LeBlanc (NCI)	N/A	wysoce przerzutowa linia komórkowa OS
MG63	ATCC	CRL-1427	słabo przerzutowa linia komórkowa OS
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Podłoże bazowe dla pożywki A i B-pożywki
Woda destylowana (sterylizowana)	Thermofisher	15230-147	Składnik pożywki A i B-media
7,5% roztwór wodorowęglanu sodu	Thermofisher	25080094	Składnik A-media & B-media
Hydrokortyzon	Sigma-Alrich	H6909	Składnik A-media & B-media
Octan retinolu - rozpuszczalny w wodzie	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Składnik A-media & B-media
Penicylina/Streptomycyna 10X skoncentrowany (10000 U/ml) roztwór	Thermofisher	15140122	Składnik A-pożywki & B-media, kompletne media.
Roztwór insuliny bydlęcej (10 mg / ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Składnik A-media i B-pożywka
DMEM, wysoka zawartość glukozy	Thermofisher	11965092	Pożywka bazowa Complete
Podłoże L-glutamina (200 mM)	Thermofisher	25030081	Składnik pożywki kompletnej
Surowica bydlęca		Thermofisher 16000044	Składnik pożywki Complete
Dulbecco' s Buforowany fosforanem sól fizjologiczna	Thermofisher	14190144	Stosowany w hodowli komórkowej.
Hank' s Roztwór soli buforowych, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Thermofisher	14175095	Służy do ponownego zawieszenia osadu komórkowego przed wstrzyknięciem
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Thermofisher	25200114	Stosowany w hodowlach komórkowych.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Służy do oznaczania miąższu płuc.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 3
Materiały dla PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Pionowy LSM konfokalny mikroskop
Zeiss 780 Konfokalny LSM	Zeiss	N/A	Odwrócony mikroskop konfokalny LSM
Myszy SCID	Charles River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, kobieta, wiek 6-8 tygodni
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Stosowany jako podparcie dla skrawków tkanki płucnej.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Stosowany podczas wdmuchiwania płuc.
Strzykawka 1 ml z igłą o rozmiarze 27 Fisherscientific		14-826-87	Służy do wstrzykiwania żyły ogonowej.
Strzykawka 10 ml	BD	309604	Służy do wdmuchiwania płuc.
Cewnik o rozmiarze 20	Terumo	SR-OX2032CA	Stosowany podczas wdmuchiwania płuc.
Zestaw przedłużający Abbott IV (30", sterylny)	Medisca	8342	Używany podczas wdmuchiwania płuc.
Waciki nasączone alkoholem	BD	326895	Do wycierania żyły ogonowej przed wstrzyknięciem
Sterylne rękawice chirurgiczne	Fisherscientific	Różni się rozmiarem	Sceptyczne podawanie płuc myszy
Linijka 30 cm	Zszywki		Służy do wdmuchiwania płuc.
Podstawka podporowa do linijki	Pipette.com	HS29022A	Służy do wdmuchiwania płuc.
Naczynie hodowlane ze szklanym dnem 35 mm	Ibidi	81158	Używane podczas obrazowania plastrów płuc
Chłonne podkładki z wodoodporną barierą przeciwwilgociową	VWR	56617-014	Służy do wykładania sterylnego obszaru roboczego w okapie biologicznym.
Catgut Zwykły wchłanialny szew	Braun	N/A	Służy do wiązania kaniulowanej tchawicy.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 4
Narzędzia chirurgiczne do PuMA
Micro nożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre/ostre	Roboz	RS-5910	Do cięcia odcinków płuc
4" (10 cm) Długa ząbkowana, prosta, bardzo delikatna końcówka 0,5 mm	Roboz	RS-5132	Do manipulowania/przytrzymywania sekcji płuc.
4" (10 cm) Długa ząbkowana lekka krzywa końcówka 0,8 mm	Roboz	RS5135	Do manipulowania / przytrzymywania odcinków płuc.
kleszcze opatrunkowe do kciuka; Ząbkowane; Delikatny; 4,5" Długość; Szerokość końcówki 1,3 mm	Roboz	RS-8120	Do ogólnego rozwarstwienia.
Kleszcze opatrunkowe do kciuków 4,5 "ząbkowane 2,2 mm Szerokość końcówki	Roboz	RS-8100	Do ogólnego rozwarstwienia.
Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne 3,5" proste ostre / ostre, ostrze 20 mm	Roboz	RS-5880	Do ogólnego rozwarstwienia.
Nożyczki Knappa; Prosty; ostry-; 27mm Długość ostrza; 4 "Całkowita długość	Roboz	RS-5960	Do ogólnego rozwarstwienia.