$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie protokoły na zwierzętach, z których uzyskano dane obrazowe, zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt National Cancer Institute, National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt omówione i przedstawione w artykule wideo zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.
1. Przygotowanie komórek nowotworowych do iniekcji i materiałów do modelu PuMA
UWAGA: Ilość roztworów i komórek wystarczy na 1 mysz. W razie potrzeby zwiększ skalę, jeśli w badaniu wykorzystano więcej myszy. Przepisy dotyczące pożywek znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2.
- Podgrzej 5 ml A-Media w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC.
- Rozpuść 1,2% niskotopliwy roztwór agarozy (w sterylnej wodzie) za pomocą laboratoryjnej kuchenki mikrofalowej.
- Przenieść 5 ml stopionej agarozy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC. Upewnij się, że stopiona agaroza ma temperaturę 37 oC i płyn przed etapem wdmuchiwania płuc.
- Wstępnie schłodzić 30 ml PBS klasy hodowli komórkowej uzupełnionej 1X długopisem/paciorkowcami w wiadrze na lód.
- W jednym dołku na 6-dołkowej płytce namocz wstępnie gąbkę żelatynową w 1,5 ml pożywki z roztworem B. Gąbka będzie kotwicą podporową dla plastrów płuc.
- Upewnij się, że komórki OS są zlewające się w około 70-90% w dniu zabiegu. Nie używaj komórek, które nadmiernie się zlewają lub jeśli podłoże jest pomarańczowe do żółtego, ponieważ komórki są zwykle zestresowane i mają w tym momencie zmniejszoną żywotność. W przypadku linii komórkowych kostniakomięsaka, MNNG i HOS, 5 x 105 w objętości 100 μl zostanie użyte do wstrzyknięcia do żyły ogonowej 1 myszy. Odpowiednio przeskaluj, jeśli do badania użyto więcej myszy.
- Zbierz komórki nowotworowe za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (3 ml dla kolby T75 lub 2 ml w 10 cm naczyniu hodowlanym). Kiedy komórki zaczną odrywać się od płytki, zneutralizuj trypsynę-EDTA za pomocą kompletnego podłoża. Odwiruj komórki i spłucz raz PBS klasy hodowli komórkowej. Zawiesić osad w 5 ml PBS.
- Zliczanie komórek należy wykonywać metodami standardowymi. Najlepiej jest wykonać więcej zawiesiny komórek niż jest to faktycznie potrzebne, ponieważ utrata zawiesiny komórek często występuje podczas pobierania igły i nieudanych prób wstrzyknięcia.
- Wykonać test wykluczający trypan-błękit na próbce zawiesiny komórek, aby ocenić żywotność komórek. Kontynuuj tylko wtedy, gdy komórka wykazuje 90% lub wyższą żywotność.
- Wstrzyknąć 5 x 105 komórek w objętości 100 μl. Aby przygotować nadmiar 2X tej ilości, 1 x 106 komórek należy odwirować i ponownie zawiesić w 0,2 ml HBSS.
- Umieść zawiesinę komórek w wiaderku z lodem, przygotowując myszy do wstrzyknięcia.
2. Iniekcja do żyły ogonowej i wdmuchiwanie płuc
UWAGA: Ilość roztworów i komórek w tej sekcji wystarczy dla 1 myszy. W razie potrzeby zwiększ skalę, jeśli w badaniu wykorzystano więcej myszy. Wykaz sprzętu, materiałów i narzędzi chirurgicznych używanych w poniższych krokach znajduje się w Tabeli 3 i Tabeli 4.
- Ogrzej samicę myszy (w wieku 6-8 tygodni) pod lampą grzewczą przez 5 minut, aby bardziej uwidocznić żyłę ogonową. W przypadku mysich komórek K7M2 lub K12 użyj myszy Balb / c; w przypadku ludzkich komórek MG63.3, MG63, MNNG i HOS należy użyć myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności.
- Upewnij się, że zawiesina komórek jest jednolita, delikatnie potrząsając rurką. Ostrożnie pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły. Owinąć strzykawkę igłą o rozmiarze 27. Upewnij się, że skos igły znajduje się po tej samej stronie, co oznaczenia objętości na igle.
- Umieść mysz w uchwycie i przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem.
- Przystąp do wykonania iniekcji do żyły ogonowej i wstrzyknij 100 μl zawiesiny komórek. 5 minut po wstrzyknięciu umieść mysz w komorze CO2 i rozpocznij standardową procedurę operacyjną eutanazji (zgodnie z zaleceniami instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami). Zwichnięcie szyjki macicy nie powinno być stosowane jako środek eutanazji, ponieważ zabieg uszkodzi tchawicę.
- Po ueutanazji myszy rozpocznij przygotowanie okapu z przepływem laminarnym do wdmuchiwania płuca myszy roztworem agarozy/pożywki A. W okapie z przepływem laminarnym ustaw obszar roboczy ze sterylną podkładką. Na tej podkładce umieścisz wysterylizowane narzędzia, cewnik dożylny, zestaw do przedłużania kroplówek i aparat do perfuzji grawitacyjnej (patrz rysunek uzupełniający 1).
- Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej. Sterylnymi małymi nożyczkami ostrożnie wypreparuj mostek, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Należy uważać, aby nie przebić płuca, ponieważ do wdmuchiwania płuc zostanie użyty roztwór agarozy/A-media.
- Podczas wycinania mostka należy przeprowadzić sekcję obok wlotu klatki piersiowej po obu stronach tchawicy. Odsłoń tchawicę, wycinając otaczającą tkankę miękką.
- Kankalować tchawicę za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 20. Luźno zawiąż węzeł chirurgiczny za pomocą sterylnego szwu katgutowego wokół kaniulowanej tchawicy.
- Podłącz zestaw przedłużający dożylnie z cewnikowanej tchawicy do strzykawki 10 ml aparatu do perfuzji grawitacyjnej.
- Połącz wstępnie podgrzaną agarozę o temperaturze 37 oC (5 ml) i pożywkę A (5 ml) w mieszaninę w stosunku 1:1. Wlać płynny roztwór agarozy/pożywki A do strzykawki o pojemności 10 ml urządzenia do perfuzji grawitacyjnej. Przed insuflacją płuc roztworem agarozy/pożywki A-pożywki należy upewnić się, że cała długość zestawu przedłużającego została zagruntowana agarozą/pożywką A, zapobiegając w ten sposób niezamierzonemu wdmuchiwaniu próbek płuc powietrzem.
- Napełnij płuca roztworem agarozy/A-media, aż płuca zostaną całkowicie wdmuchiwane.
- Gdy płuco zostanie całkowicie wdmuchnięte, wyjmij kaniulę i mocno zawiąż węzeł chirurgiczny, aby zapobiec wyciekowi roztworu agarazy/A-media przez tchawicę.
- Przystąp do wycinania wyrywki (tchawicy, serca i płuca) z jamy klatki piersiowej. Należy uważać, aby nie przebić ani nie uszkodzić powierzchni płuc.
- Umieść oskubanie (w dowolnej orientacji) we wstępnie schłodzonych 30 ml PBS uzupełnionych 1X długopisem / paciorkowcami i pozwól agarozie/pożywce A zestalić się przez 20 minut.
- Za pomocą cienkich nożyczek i pęsety odetnij małe kawałki płuca (3 mm x 1,5 mm), jak pokazano na Rysunek 1A. Mniejsze wycinki płuc można łatwo zobrazować za pomocą obiektywu 2,5X. W jednym warunku eksperymentalnym można pokroić wiele plasterków, zwykle 4-10 plasterków na grupę.
UWAGA: Dla każdej grupy eksperymentalnej umieść plastry płuc w oddzielnym dołku (płytka 6-dołkowa) zawierającym gąbkę żelatynową o wymiarach 2 x 2 cm wstępnie nasączoną pożywką B. Ilość pożywki na studzienkę powinna wynosić 1,5 ml. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni. W przypadku badań nad lekami częstotliwość zmiany pożywki/leku jest określana przez użytkownika.
3. Szerokokątne obrazowanie fluorescencyjne wycinków płuc i analiza
UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego szerokokątnego, mniejsze plastry są wycinane (3 mm x 1,5 mm x 1 mm) w celu dopasowania sekcji płuc do 1 obrazu za pomocą obiektywu 2,5x.
Akwizycja obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu:
- Wycinki płuc są zwykle obrazowane po 0, 3, 7 i 14 dniach po wstrzyknięciu. W sterylnym środowisku szafki biologicznej ostrożnie przenieś plastry płuc z gąbek żelatynowych do sterylnego okrągłego naczynia o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Uważaj, aby usunąć nadmiar płynu z wycinka płuca, ponieważ nadmiar płynu będzie działał jak lustro i odbijał światło fluorescencyjne pochodzące z komórek nowotworowych.
- Ułóż plastry płuc w podobny sposób przedstawiony na Rysunek 1A. Każda kolumna reprezentowałaby inny warunek eksperymentalny. Uważaj, aby nie zanieczyścić krzyżowo płuc pęsetą. Spłucz 70% etanolem i wysusz przed kontaktem z plastrami płuc z innej grupy eksperymentalnej.
- Zoptymalizuj parametry obrazowania (tj. wzmocnienie, przesunięcie, czas ekspozycji, binning), aby zapewnić najlepszy kontrast między fluorescencyjnymi komórkami nowotworowymi a tłem tkanki płucnej w grupie kontrolnej (nośnik nieleczony). Użyj tych samych parametrów z grupy kontrolnej, aby zobrazować grupy eksperymentalne. Zapisz jako format obrazu tiff.
- Aby uzyskać odniesienie do skali, zrób cyfrowe zdjęcie mikrometru przy tym samym obiektywie.
- Ponieważ autofluorescencja płuc zmienia się w czasie, parametry obrazowania muszą być dostosowywane do płuc kontrolnych podczas każdej sesji obrazowania. Parametry obrazowania dla jednej sesji niekoniecznie muszą być optymalne dla kolejnych sesji obrazowania.
Analiza obrazu:
UWAGA: Poniższe kroki przetwarzania obrazu są wykonywane za pomocą pakietu oprogramowania ImageJ 1.51h 17.
- Otwórz plik obrazu w ImageJ (Rysunek 3A).
- Odejmij tło: Przetwarzaj > Odejmij tło > Promień toczącej się piłki (zacznij od 50 pikseli), odznacz "Jasne tło" (Rysunek 3B).
- Konwertuj obraz do formatu 8-bitowego: Typ > obrazu > 8-bitowy (Rysunek 3C).
- Ustaw jednostki na piksele: Obraz > Wpisz "Piksele" w Jednostce długości, wprowadź 1 w "Szerokość pikseli", "Wysokość piksela", "Głębokość woksela". Zaznacz pole "Globalne", aby zastosować do kolejnych obrazów.
- Za pomocą narzędzia Zaznaczanie wielokątów obrysuj kształt całego wycinka płuc i określ obszar (piksel2) całego wycinka płuca. Wartość ta zostanie wykorzystana do obliczenia procentowego obciążenia guzem płuc.
- Obraz progowy: Obraz > Dostosuj próg > > podświetl "Domyślny" i "Czarno-biały" > użyj suwaka, aby ustawić próg obrazu w taki sposób, aby większość komórek nowotworowych była dokładnie podświetlona. Naciśnięcie przycisku "Zastosuj" spowoduje wyświetlenie czarno-białego obrazu, na którym płuco jest całe czarne, a zmiany fluorescencyjne są białe (Rysunek 3D). Naciśnięcie przycisku "Zastosuj" po raz drugi spowoduje odwrócenie obrazu, na którym wszystkie struktury fluorescencyjne są teraz czarnymi kształtami (Rysunek 3E).
- Kwantyfikacja liczby i kształtu zmian chorobowych:
Analizuj > ustaw pomiary > zaznacz "Obszar". Odznacz wszystkie inne pola.
Analizuj cząstki > rozmiar (piksel2): 0-nieskończoność reprezentuje zakres kształtów, które zostanie wyliczony przez ImageJ. Empirycznie określ najmniejszą zmianę, która jest uważana za pojedynczą komórkę nowotworową na obrazach nośników dnia 0. Użyj obszaru tej pojedynczej komórki nowotworowej jako dolnego limitu dla pozostałych obrazów w zestawie danych. W przypadku pracy przedstawionej w tym artykule jako dolną granicę ustawiono 11 pikseli2. W przypadku pracy przedstawionej w przykładzie wideo jako dolny limit ustawiono 24 piksele2. Pozostaw zakres "Cyrkularność" jako 0-1. "Pokaż" można ustawić na "Nic". Alternatywnie, jeśli wybrano opcje "Pokaż" i "Kontury", generowany jest rysunek wszystkich konturów kształtów. Zaznacz "Wyświetl wyniki", aby wyświetlić osobne okno pomiarów. Opcjonalnie zaznaczenie pola "Dodaj do menedżera" spowoduje zapisanie wszystkich kształtów określonych ilościowo w menedżerze ROI, które można zapisać do wykorzystania w przyszłości. Po naciśnięciu OK pojawi się okno "Wyniki" zawierające wszystkie wyliczone kształty i pomiary powierzchni (Rysunek 3F).
- Skopiuj i wklej dane z okna "Wyniki" do arkusza kalkulacyjnego. Użyj funkcji matematycznej SUMA w programie Excel, aby zsumować wszystkie obszary zmian przerzutowych dla tego konkretnego wycinka płuca. Aby ocenić procentowe obciążenie guzem płuca w wycinku płuca, podziel sumę obszarów zmian przerzutowych przez całkowitą powierzchnię wycinka płuca. Ten parametr jest również znany jako ułamek powierzchni (AA), który jest szczegółowo opisany przez Underwooda 18.
Obciążenie guzem płuc = Suma obszarów zmian przerzutowych/całkowita powierzchnia wycinka płuca
- Oblicz obciążenie guzem płuc dla pozostałych odcinków płuc w grupie kontrolnej i pozostałych grupach. Wykreśl średnie obciążenie guzem płuc na grupę w ciągu 0, 3, 7 i 14 dni. Pokazano reprezentatywne szerokokątne obrazy fluorescencyjne ludzkich komórek OS o wysokim i niskim przerzutach rosnących w modelu PuMA w progresywnych punktach czasowych (Rysunek 4A). Pokazano wykres liniowy przedstawiający zmianę krotności (znormalizowanej do dnia 0) procentowego obciążenia guzem z przerzutami w czasie (Rysunek 4B).
4. Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne modelu PuMA
UWAGA: W przypadku obrazowania konfokalnego, przetwarzanie tkanek jest podobne do tego w poprzedniej sekcji, z wyjątkiem tego, że wycinane są większe wycinki płuc (pełne przekroje poprzeczne, grubość 1-2 mm), aby umożliwić obrazowanie większej liczby ROI.
Oznaczanie miąższu płuc za pomocą DAR4M:
- Zanurzyć plastry płuc w 10 μμM DAR4M (w HBSS) na 45 minut w temperaturze 37 °C. DAR4M znakuje reaktywne formy azotu w komórkach płuc.
- Po 45 minutach inkubacji przepłukać plastry płuc świeżym HBSS.
- Umieść plasterek płuca w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i umieść go w mikroskopie konfokalnym.
- Parametry obrazowania dla przykładowych obrazów pokazanych w Rysunek 5 są wymienione w Tabeli 5.
- Zdobądź stos Z dla interesującego Cię regionu. Użyj sugerowanej grubości warstwy Z do pobierania próbek Nyquista. Reprezentatywny film stosu 3D pokazujący zielone fluorescencyjne komórki systemu operacyjnego w tkance płucnej znakowanej DAR4M znajduje się w filmie 1 i filmie uzupełniającym 1.
Dla przykładowych obrazów konfokalnych pokazanych w Rysunek 5, sesja obrazowania była terminalna. Jeśli wymagane jest obrazowanie podłużne, zaleca się użycie konfokalnego mikroskopu LSM wyposażonego w 2 lub wiele fotonów do obrazowania, ponieważ istnieje mniej fotouszkodzeń żywych tkanek19,20.
Obrazowanie mito-RFP z ekspresją komórek MG63 w modelu PuMA:
- Wykonaj protokół PuMA zgodnie z konspektem w krokach 1 i 2 przy użyciu komórek MG63 wyrażających konstrukcję mito-RFP.
- Umieść plasterek płuca w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i umieść go w mikroskopie konfokalnym.
- Parametry obrazowania dla przykładowych obrazów pokazanych w Rysunek 6 są wymienione w Tabeli 6. Reprezentatywny film stosu 3D przedstawiający zielone fluorescencyjne komórki systemu operacyjnego z mitochondriami z czerwoną fluorescencyjną mitochondriami znajduje się w filmie 2 i filmie uzupełniającym 2.