Artykuł metodologiczny

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

DOI:

10.3791/56333

⸱

23 listopada 2017

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

siRNA i metody regulacji ekspresji genów za pośrednictwem shRNA są nieocenionymi narzędziami do zrozumienia funkcji genów i białek. Jednakże w przypadku, gdy KD białka będącego przedmiotem zainteresowania ma śmiertelny wpływ na komórki lub przewidywany efekt KD jest zależny od czasu, bezwarunkowe metody KD nie są właściwe. Systemy warunkowe są bardziej odpowiednie w tych przypadkach i były przedmiotem dużego zainteresowania. Należą do nich systemy nadekspresji indukowane ekdyzonem, system indukcji cytochromu P-4501 oraz systemy ekspresji genów regulowane tetracykliną.

System ekspresji genów regulowany tetracykliną umożliwia odwracalną kontrolę ekspresji białek poprzez indukcję ekspresji shRNA w obecności tetracykliny. W niniejszym protokole przedstawiono projekt eksperymentalny z wykorzystaniem funkcjonalnego systemu Tet-ON w ludzkich liniach komórkowych nowotworowych do warunkowej regulacji ekspresji genów. Następnie demonstrujemy zastosowanie tego systemu w badaniu interakcji komórka nowotworowa - monocyty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi związane z nowotworami (TAM) przyczyniają się do rozwoju nowotworu, promując jego wzrost, przerzuty i regulując odpowiedź immunologiczną2. Komórki nowotworowe rekrutują zapalne monocyty, które naciekają guz i różnicują się w pronowotworowe TAMs3. Naciekanie guza za pomocą TAM koreluje ze słabymi wynikami klinicznymi i zostało powiązane z immunosupresyjną rolą makrofagów4,5. Jednak mechanizmy rekrutacji makrofagów do guza nie są dobrze zbadane, a lepsze zrozumienie zaangażowanych szlaków ma kluczowe znaczenie dla dalszego postępu w tej dziedzinie i obiecujących terapii. Jednym z wyzwań w badaniu interakcji między komórkami nowotworowymi a normalnymi komórkami w mikrośrodowisku guza (TME) jest złożoność zaangażowanych mechanizmów i komórek, co wymaga podejść in vitro, które umożliwiają rozbiór przesłuchów. W tym miejscu przedstawiamy wszechstronną metodologię, którą można zastosować do badania parakrynnego wpływu białka pochodzącego z komórek nowotworowych, wydzielanego przez komórkę nowotworową na migrację innych typów komórek, takich jak makrofagi, in vitro. Korzystając z systemu, w którym ekspresja shRNA przeciwko białku pochodzącemu z komórek nowotworowych biorącemu udział w rekrutacji monocytów jest pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną, określa się ilościowo wpływ parakrynny wydzielanego białka na monocyty. W tym protokole przedstawiono klonowanie sekwencji shRNA do wektora regulowanego tetracykliną, a następnie generowanie stabilnych linii komórek rakowych. Ponadto oczyszczanie pierwotnych ludzkich monocytów i test w komorze Boydena są wykorzystywane do analizy parakrynnego wpływu białka pochodzącego z komórek rakowych na migrację monocytów.

Regulacja w dół genów kodujących białka jest powszechnie stosowana w technikach siRNA i shRNA, choć nie bez ograniczeń w jej użyciu. Długotrwały knock-down (KD) genów może wywoływać wtórne reakcje adaptacyjne komórek, które zakłócają wyniki eksperymentalne. Brak czasowej kontroli nad ekspresją genów sprawia, że trudno jest badać dynamiczną rolę białka w czasie lub rolę białka kluczowego dla przetrwania komórki. Kwestia ta jest szczególnie ważna w warunkach in vivo, gdzie rola białka w rozwoju i progresji guza może wymagać regulacji w dół ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania dopiero po ustaleniu guza. Warunkowa KD ma tę zaletę, że zapobiega zbyt wczesnemu letalnemu wpływowi KD na komórki i umożliwia analizę roli białka na różnych etapach wzrostu guza, podczas gdy bezwarunkowa KD może skutkować brakiem rozwoju guza.

Wiele warunkowych systemów KD zostało opracowanych w celu rozwiązania ograniczeń stabilnego KD. Systemy warunkowej ekspresji genów obejmują systemy nadekspresji indukowane ekdyzonem, system indukcji cytochromu P-4501 oraz systemy ekspresji genów regulowane tetracykliną. Systemy ekspresji genów regulowane przez tetracyklinę umożliwiają kontrolę nad ekspresją shRNA po dodaniu antybiotyku tetracykliny (lub jej bardziej stabilnego analogu - doksycykliny). W układach Tet-ON ekspresja shRNA jest indukowana w obecności tetracykliny/doksycykliny, co prowadzi do ekspresji genu KD, podczas gdy w systemach Tet-OFF ekspresja shRNA jest tłumiona w obecności tetracykliny, co prowadzi do ekspresji genu. Wadą systemu indukowanego tetracykliną jest wcześniej zgłaszany niski poziom ekspresji shRNA przy braku doksycykliny - tzw. nieszczelność6,7. W opisanym tutaj układzie Tet-ON, po podaniu tetracykliny, wiązanie białka represora tetracykliny o konstytutywnej ekspresji (TetR) z sekwencją elementu reagującego na Tet (TRE) w regionie promotora H1 interesującego shRNA jest tłumione. Powoduje to ekspresję shRNA i zahamowanie translacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w sposób zależny od tetracykliny8,9.

Inne dostępne systemy Tet-ON obejmują jednoczesne wprowadzanie sekwencji TetO między skrzynką TATA a proksymalnym elementem sekwencji (PSE) oraz między skrzynką TATA a miejscem rozpoczęcia transkrypcji opracowanym przez Chan et al. 10 Ten system wymaga mniejszych niż toksyczne dawki tetracykliny do regulacji ekspresji shRNA, jednak w stanie nieindukowanym dochodzi do niskiego poziomu shRNA. System Tet-ON oparty na Krüppel-associated box (KRAB)11 zawiera KRAB, białko palca cynkowego, które poddaje geny znajdujące się w zakresie 3 kb miejsca wiązania KRAB supresji transkrypcji. Chimeryczne białko tTRKRAB może wiązać się z TetO, a ze względu na duży zakres zdolności kontrolowanych DNA, TetO nie musi być ograniczone między miejscem początkowym transkrypcji a promotorem i ma niewielki wpływ na aktywność promotora. W stanie nieindukowanym, ten kontrolowany system interferencji RNA wykazał niższy poziom wycieku ekspresji shRNA11,12; Wymaga to jednak sekwencyjnego, dwuwektorowego podejścia do klonowania. W porównaniu z wcześniej opracowanymi warunkowymi systemami KD, takimi jak system nadekspresji indukowany ekdyzonem lub system indukcji cytochromu P-450, system regulowany tetracykliną ma tę zaletę, że jest wytrzymały i odwracalny, a zatem jest najczęściej używanym systemem13. System zastosowany w tym protokole ma przewagę nad podwójnym systemem knock-in TetO i systemem KRAB Tet-ON, ponieważ wymaga prostego, pojedynczego klonowania wektorów, co pozwala na szybkie generowanie wielu klonów i wykazuje bardzo niski poziom nieszczelności przy braku doksycykliny.

TME ma kluczowe znaczenie dla rozwoju raka. Aby ułatwić wzrost guza, komórki rakowe rekrutują monocyty zapalne poprzez wydzielanie białek chemotaktycznych. Zrekrutowane monocyty naciekają guz i różnicują się w pronowotworowe TAM, które przyczyniają się do wzrostu guza i przerzutów. Badania in vitro rekrutacji komórek odpornościowych wykorzystują testy migracji, przy czym szeroko stosowany jest test komorowy Boydena14,15,16,17. W tym teście źródło białka chemoatraktantu, na przykład komórki rakowe lub oczyszczone białko, umieszcza się w dolnej komorze. Komórki odpornościowe umieszcza się w górnej komorze oddzielonej porowatą błoną od dolnej komory. Komórki migrujące w kierunku rosnącego gradientu chemoatraktantu oraz te znajdujące się na dolnej stronie błony są barwione i liczone pod mikroskopem. Tutaj testujemy funkcję chemoatraktantu inhibitora aktywatora plazminogenu 1 (PAI-1) na monocytach, generując stabilne, indukowalne linie komórek rakowych, w których ekspresja PAI-1 jest regulowana przez dodanie doksycykliny. Używamy ludzkich pierwotnych monocytów w teście migracji w komorze Boydena, aby ocenić rolę PAI-1 w migracji monocytów. Opisano różnice między ludzkimi pierwotnymi monocytami a szeroko stosowanymi liniami komórek monocytowych, takimi jak THP1, które obejmują różne wzorce ekspresji cytokin18; na przykład 5-10-krotny wzrost poziomu ekspresji TNF-α przez komórki THP1 w porównaniu z ludzkimi monocytami19. Komórki THP1 pochodzą z ludzkich komórek monocytowych białaczki, są łatwe w utrzymaniu i namnażają się ze średnim czasem podwojenia wynoszącym 19 - 50 h20. Wręcz przeciwnie, ludzkie monocyty charakteryzują się krótką żywotnością przy braku czynników wzrostu. Ponieważ monocyty są oczyszczane z krwi dawców, wśród osobników występuje spora zmienność i w zależności od metody oczyszczania może dojść do zanieczyszczenia innymi typami komórek. Niemniej jednak pierwszorzędowe monocyty są istotne i zalecono użycie lub potwierdzenie wyników uzyskanych z liniami komórek monocytowych przy użyciu pierwotnych monocytów w badaniach biologicznych19. Tutaj opisujemy protokół oczyszczania ludzkich pierwotnych monocytów z krwi obwodowej. Alternatywne metody oczyszczania monocytów obejmują gradient gęstości i protokoły adhezji oraz dwuetapową procedurę z pojedynczymi gradientami Ficoll-Hypaque, po których następuje gradient Percoll21. Czystość populacji monocytów uzyskana tymi metodami waha się w granicach 70 - 90%. Opisana tutaj metoda wykorzystuje gradient gęstości, po którym następuje negatywna selekcja immunologiczna22 i umożliwia oczyszczanie ludzkich monocytów bez bezpośredniego kontaktu z przeciwciałami, unikając w ten sposób ich przypadkowej aktywacji i uzyskując >95% czystą populację monocytów.

Przedstawiony tutaj protokół służy do stworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON do ekspresji genów KD w ludzkich liniach komórkowych nowotworowych w celu zbadania wpływu chemoatraktantu wydzielanego przez raka białka PAI-1 na monocyty. PAI-1 ulega nadekspresji w różnych nowotworach, a jego ekspresja paradoksalnie koreluje ze słabymi wynikami klinicznymi23,24. Pronowotworowa rola PAI-1 wynika z jego funkcji proangiogennej i antyapoptotycznej25,26. Wykazano, że PAI-1 przyczynia się do stanu zapalnego poprzez promowanie rekrutacji makrofagów do miejsca zapalenia27. Wykazano, że PAI-1 promuje migrację komórek mięśni gładkich28,29 i uczestniczy w migracji makrofagów zależnych od Mac-130. Wykazano również, że nadekspresja PAI-1 znacznie zwiększa rekrutację surowych makrofagów 264.7 do guzów czerniaka B16F1031. Rola PAI-1 w migracji TAM nie została jednak szczegółowo zbadana. Za pomocą opisanego protokołu odpowiadamy na pytanie, czy PAI-1 przyciąga monocyty do komórek nowotworowych. Metodologia ta pozwala na rozbiór przesłuchów między nowotworem a TME poprzez wyciszenie wydzielanego białka w komórkach nowotworowych i analizę składników TME.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekcja protokołu, która wykorzystuje ludzkie monocyty uzyskane od zdrowych ochotników, jest zgodna z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Klinicznych Szpitala Dziecięcego w Los Angeles i została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną pod numerem Protokołu Materiału Ludzkiego: CCI 08-00208.

1. Przygotowanie linii komórek rakowych z ekspresją shRNA regulowaną tetracykliną

  1. Klonowanie shRNA PAI-1 do wektora Tet-pLKO-puro8,9
    1. Zaprojektuj oligomery shRNA, które zawierają miejsce rozszczepienia AgeI i EcoRI na końcu 5', sekwencję sensacyjną, pętlę 6 nukleotydów i sekwencję antysensowną.
      UWAGA: Typowe oligonukleotydy są zaprojektowane w następujący sposób: Oligo do przodu: 5' CCGG - 19 - 21 bp sense - CTCGAG - 19 - 21 bp antysens - TTTTT, Odwrotny oligo: 5' AATTAAAAAA- 19-21 bp sense - CTCGAG - 19 - 21 bp antysens 3'. Szczegółowy protokół projektowania oligomerów można znaleźć w 8. W tym badaniu przetestowano 3 sekwencje shRNA przeciwko PAI-1 pod kątem najsilniejszego efektu wyciszania: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333 i scrambled33 są zawarte w tabeli 1.
    2. Wyżarzanie oligomerów shRNA i zaszyfrowanych oligomerów shRNA.
      1. Rozpuść oligonukleotydy do 100 μM w wodzie i wymieszaj 1 μl oligonukleotydu do przodu, 1 μl odwróconego oligonukleotydu i 8 μl H2O.
      2. Aby wyżarzać oligonukleotydy, wymieszaj następujące elementy: 1 μl mieszaniny oligonukleotydów, 5 μl buforu 10 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris) pH 7,5, 50 mM chlorku sodu (NaCl), 10 mM chlorku magnezu (MgCl2), 1 mM ditioerytrytolu (DTE) i 44 μLH2O.
      3. Mieszaninę inkubować w termocyklerze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w temperaturze 95 °C przez 5 minut, wyłączyć przyrząd i poczekać, aż zostanie osiągnięta temperatura pokojowa (RT).
    3. Wytrącić wyżarzone oligonukleotydy, dodając 5 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 do 50 μl wyżarzonych oligonukleotydów.
      1. Dodać 100 μl zimnego 100% etanolu (EtOH) i inkubować przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Odwirować w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      2. Usunąć sklarowany osad, dodać 500 μl zimnego 70% EtOH, odwirować przez 30 minut, usunąć supernatant i rozpuścić osad w 20 μl H2O.
      3. Ocenić stężenie wyżarzonych oligonukleotydów za pomocą spektrofotometrii, mierząc absorbancję przy 260 nm. Rozcieńczyć oligonukleotydy do końcowego stężenia 1 ng/μL.
    4. Przygotuj podłoże Luria Bertani (LB) i płytki agarowe LB.
      1. W przypadku podłoża LB rozpuść 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl w 1 l wody. Dostosować pH pożywki do pH 7,0 za pomocą 1 N NaOH i autoklawu.
      2. W przypadku płytek agarowych LB dodaj 15 g/l agaru do podłoża LB. Autoklaw i schłodzić do temperatury około 50 °C. Dodać antybiotyk i wlać płytki.
    5. Bakterie smugowe transdukowane wektorem Tet-pLKO-puro (patrz tabela materiałów) na płytce agarowej LB uzupełnionej ampicyliną 100 μg/ml i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
    6. Zaszczepić 100 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny (LB/ampicyliny) 1 kolonią z płytki i wyhodować O/N przez wytrząsanie w temperaturze 37 °C.
    7. Wyizolować Tet-pLKO-puro ze 100 ml kultury bakteryjnej za pomocą zestawu do izolacji plazmidu.
    8. Przygotować reakcję restrykcyjną dla wektora Tet-pLKO-puro z enzymami restrykcyjnymi EcoRI i AgeI w następujący sposób: 1 μL EcoRI, 1 μL AgeI, 5 μL 10x bufor, 1 μL plazmidowego DNA (1 μg), 42 μL H2O. Inkubować 1 h w temperaturze 37 °C. Aby uzyskać wystarczającą ilość rozszczepionego wektora, należy przygotować do 5 x 50 μL reakcji.
    9. Użyj 1% żelu agarozowego, aby oczyścić rozszczepiony wektor z żelu agarozowego za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Aby zwiększyć wydajność DNA, zminimalizuj stosunek agarozy do DNA w żelu, używając grzebienia z żelem agarozowym do dużych studzienek i ostrożnie usuwając większość agarozy z pasma za pomocą skalpela.
    10. Przygotować mieszaninę reakcyjną ligacji w następujący sposób: 1 ng wyżarzonych oligonukleotydów, 50 ng rozszczepionego wektora, 2 μl 10x buforu ligazy, 1 μl ligazy i wody do 20 μl. Zligować wektor wyżarzonymi oligonukleotydami shRNA w temperaturze 16 °C O/N.
      1. Przygotuj dodatkowo reakcję kontroli ujemnej bez oligonukleotydów, aby uwzględnić nierozszczepiony, częściowo rozszczepiony i samoligowany wektor, który spowoduje fałszywie dodatnie kolonie.
    11. Stosując standardowe techniki transformacji, przekształć mieszaniny ligacji w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne zaprojektowane tak, aby zapobiec homologicznej rekombinacji wektorów lentiwirusowych zawierających bezpośrednie powtórzenia.
    12. Hodować bakterie na płytkach z ampicyliną O/N w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli nastąpi wzrost kolonii satelitarnych, powtórz transformację i hoduj bakterie w temperaturze 30 °C, aby spowolnić wzrost, a tym samym zapobiec tworzeniu się kolonii satelitarnych.
    13. Aby potwierdzić powodzenie ligacji, wybierz między 10 a 20 pojedynczymi koloniami, zaszczepiając 2 ml kultur LB / ampicyliny i płytkę ampicyliny jako płytkę podstawową (do późniejszego użycia jako dodatni klon). Hodować płynne kultury, wytrząsając O/N w temperaturze 37 °C. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C.
    14. Uszczelnić płytkę parafilmem i przechowywać w temperaturze 6 °C.
    15. Wyizolować plazmidowe DNA z płynnych kultur za pomocą zestawu do izolacji plazmidu.
    16. Wykonaj analizę restrykcyjną plazmidowego DNA wyizolowanego z kolonii opornych na ampicylinę przy użyciu enzymu XhoI. Dla każdego klonu należy przygotować następującą mieszaninę reakcyjną: 0,5 μl XhoI, 2,5 μl 10x buforu, 1 μl plazmidowego DNA (0,5 μg) i 21 μLH2O. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przeanalizować wynik reakcji restrykcyjnej, przeprowadzając reakcję na 1% żelu agarozowym.
      UWAGA: Analiza restrykcyjna wektora WT rozszczepionego przez XhoI wygeneruje 3 fragmenty: 8,447, 1,800 i 200 pz. Sekwencja nadziewarki w wektorze Tet-pLKO-puro o sile 1,800 pz nie występuje w dodatnich klonach zawierających shRNA-PAI-1, a trawienie XhoI spowoduje powstanie fragmentów DNA o wielkości: 8,447, 190 i 130 pz. Jak pokazano w Rysunek 1, fragment o długości 2000 pz nie występuje w DNA wyizolowanym z kolonii opornych na ampicylinę o numerach: 3, 8 i 11. W zależności od konstrukcji oligonukleotydów, długość i liczba uzyskanych fragmentów w DNA z dodatnich kolonii może się różnić.
    17. Sprawdź poprawność insercji shRNA do wektora Tet-pLKO-puro, sekwencjonując8,9.
    18. Zaszczepić 100 ml kultury LB/Ampicillin kolonią zawierającą właściwy klon i wyhodować O/N w temperaturze 37 °C.
    19. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu.
  2. Wytwarzanie cząsteczek lentiwirusa.
    1. Pokryj 15-centymetrowe naczynie do hodowli tkankowej poli-L-lizyną, pokrywając powierzchnię naczynia sterylnym roztworem wodnym 0,01% poli-L-lizyny i inkubując w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Usuń roztwór przez aspirację i wysusz naczynia na powietrzu.
    2. Nasienie 5 x 106 ludzkich komórek embrionalnych nerek (HEK293) komórek w 15-centymetrowym naczyniu pokrytym poli-L-lizyną i hodowla w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% FBS i 1% mieszaniną penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do osiągnięcia 70% konfluencji.
    3. Aby wytworzyć cząsteczki wirusa, transfekuj komórki HEK293 za pomocą 25 μg pLKO-Tet-On-shRNA, 25 μg psPAX (plazmid pakujący) i 5 μg plazmidów pMD2.G (plazmid eksprymujący otoczkę) za pomocą odczynnika do transfekcji.
      UWAGA: plazmidy psPAX i pMD2.G są prezentem od laboratorium Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Szwajcaria).
    4. Indukuj komórki HEK293 następnego dnia, zmieniając pożywkę na DMEM uzupełnioną 10 mM maślanu sodu i 20 mM HEPES pH 7,2 i hodując przez 8 godzin.
    5. Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodać 25 ml świeżej pożywki DMEM zawierającej 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 7,2. Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, ostrożnie zebrać pożywkę zawierającą wirusa za pomocą pipetowania; Unikaj rozlania.
    6. Przefiltruj zebrane podłoże przez filtr strzykawkowy 0,45 μM, aby usunąć komórki HEK293. Pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  3. Generowanie stabilnie transfekowanych linii komórkowych
    1. Wysiewaj komórki raka jelita grubego HCT116 i komórki raka piersi MDA-MB-231 w 50 000 komórek / dołku w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% Pen / Strep w 12-dołkowej płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 do momentu, gdy komórki zlewają się w 60 - 70%.
    2. Przemyć komórki PBS i dodać 1 ml pożywki zawierającej wirusa do komórek nowotworowych i inkubować O/N w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Jako kontrolę, dodaj 1 ml świeżej pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% Pen/Strep do 2 dołków z komórkami rakowymi.
    3. Ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa przez aspirację. Umyj komórki PBS i zmień pożywkę na DMEM z 10% (v/v) FBS bez tetracyklin (bez Tet) i 1% Pen/Strep.
    4. Po 72 godzinach umyj komórki PBS i zmień pożywkę na DMEM 10% Tet-free FBS 1% Pen/Strep, 1 μg/ml puromycyny do selekcji komórek transfekowanych wirusem.
      1. W zależności od użytej linii komórkowej dostosuj stężenie puromycyny w celu optymalnego wyboru, testując zakres stężeń puromycyny (0,1, 0,5, 1, 2 i 5 μg/ml) w komórkach nietransdukowanych i wybierając najniższe stężenie, w którym żadne komórki kontrolne nie przeżywają po 3 dniach hodowli.
    5. Wybierz komórki transdukowane wirusem, hodując komórki w obecności puromycyny przez 3 - 14 dni. Jako kontrole przygotuj dwie dodatkowe studzienki z komórkami nietransdukowanymi, jedną z pożywką zawierającą puromycynę i jedną bez puromycyny. Obserwuj częściowe zabijanie komórek przez puromycynę w studzience z komórkami transdukowanymi wirusem w porównaniu z dołkami kontrolnymi.
      UWAGA: Komórki nietransdukowane nie będą rosły w obecności puromycyny.
    6. Sprawdź skuteczność warunkowego KD w komórkach raka jelita grubego HCT116 opornego na puromycynę i raka piersi MDA-MB-231.
      UWAGA: Skuteczne stężenie doksycykliny będzie się różnić w zależności od użytej linii komórkowej i musi być miareczkowane (zwykle od 100 ng / ml do 2 μg / ml).
      1. Określ stężenie doksycykliny, która nie jest toksyczna dla komórek, ale skutecznie obniża ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym protokole 1 μg/ml został z powodzeniem zastosowany in vitro.
      2. Hodować komórki przez 72 godziny w obecności i pod nieobecność 0,1, 1 i 2 μg/ml doksycykliny. Sprawdź poziom ekspresji białka regulowanego w dół (tutaj PAI-1) w lizacie komórkowym za pomocą analizy Western blot. Porównaj komórki HCT116 i MDA-MB-231 warunkowo eksprymujące shRNA z zaszyfrowanymi komórkami kontrolnymi.
  4. Przygotowanie kondycjonowanej pożywki
    1. Nasiona 1 x 106 komórek stabilnie transfekowanych doksycykliną regulowanych pLKO-shRNA zawierających lentiwirusy w 10 cm szalkach.
    2. Hoduj linie komórkowe na pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 10% FBS wolnym od Tet i 1% Pen/Strep przy braku i obecności 1 μg/ml doksycykliny przez 72 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 , dodając codziennie świeżą doksycyklinę.
      UWAGA: Pożywka RPMI jest zgodna z warunkami hodowli monocytów. Doksycyklina jest związkiem wrażliwym na światło. Chroń kultury komórkowe przed światłem, przykrywając folią aluminiową i unikaj pracy w bezpośrednim naświetleniu.
    3. Zebrać pożywkę przez pipetowanie, przefiltrować przez filtr 0,45 μm i zamrozić w temperaturze -80 °C w porcjach.

2. Izolacja monocytów od ludzkiej krwi

  1. Wyizolować monocyty z ludzkiej krwi obwodowej.
    UWAGA: Ludzkie pierwotne monocyty izoluje się z 7 ml białych krwinek skoncentrowanych w filtrze leukocytarnym uzyskanym od zdrowych dawców płytek krwi. W zależności od dawcy jeden filtr leukocytów wytwarza od 1 x 109 do 2 x 109 komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), z których około 10% stanowią monocyty.
    1. Przygotuj stanowisko pracy w komorze laminarnej.
    2. Sterylizuj nożyczki i komorę z przepływem laminarnym światłem ultrafioletowym (UV) przez 30 minut.
    3. Spryskaj filtr leukocytów 70% EtOH i wysusz na powietrzu w komorze laminarnej.
    4. Odetnij oba końce filtra leukocytów nożyczkami i opróżnij zawartość filtra do probówki o pojemności 50 ml.
    5. Rozcieńczyć do 90 ml przez dodanie PBS zawierającego 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
    6. Przygotować 3 probówki o pojemności 50 ml z 15 ml roztworu gradientu gęstości. Powoli nakładaj 30 ml rozcieńczonej krwi PBS/FBS na roztwór gradientu gęstości za pomocą kontrolera pipet ustawionego na przepływ grawitacyjny, aby uniknąć mieszania się warstw.
    7. Wirować w wirniku obrotowym o sile 400 x g przy dopuszczalnej sile względnej bez hamulców przez 25 minut.
    8. Wyrzuć górną warstwę i przenieś środkową warstwę zawierającą PBMC do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
    9. Dodać PBS/FBS do 50 ml i odwirować przy 120 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min. Usunąć supernatant zawierający płytki krwi. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
    10. Zawiesić osad w 50 ml PBS/FBS i policzyć PBMC za pomocą hemocytometru. Odwirować przy 120 x g w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w PBS/FBS zawierającym 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) do końcowego stężenia 5 x10,7 komórek/ml.
    11. Użyj zestawu selekcji negatywnej, aby wzbogacić monocyty poprzez zubożenie komórek niemonocytowych.
      UWAGA: Zestaw do selekcji negatywnej wykorzystuje koktajl przeciwciał (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 i glikoforyny A) przeciwko limfocytom T, komórkom NK, neutrofilom, limfocytom B, granulocytom i erytrocytom. Kompleksy przeciwciał wiążą się z powierzchnią tych komórek niemonocytarnych oraz z cząstkami magnetycznymi dekstranu. Po umieszczeniu probówki w magnesie kulki przylegają do ścianek rurki i usuwają komórki niemonocytowe z roztworu.
      1. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał do 1 ml 5 x 107 PBMCs/ml, wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 50 μl kulek magnetycznych do PBMC z koktajlem przeciwciał, wymieszaj pipetą i inkubuj przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Dodaj PBS/FBS/EDTA do 25 ml i umieść mieszaninę PBMC w magnesie, który może pomieścić probówkę o pojemności 50 ml. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Kulki magnetyczne przylegają do ścianek probówki i sekwestrują komórki niemonocytowe z roztworu.
    12. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml usunąć roztwór zawierający monocyty z probówki w magnesie. Uważaj, aby nie dotknąć pipetą boków probówki.
    13. Odwirować roztwór przy 250 x g w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający monocyty w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS wolnego od Tet i 1% Pen/Strep.

3. Test migracji w komorze Boydena

  1. Przygotować 1% (w/v) roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 1 g BSA w 100 ml ultraczystej wody i przefiltrować przez pory o wielkości 0,2 μm w celu sterylizacji.
  2. Inkubować porowate wkładki membranowe w 1% sterylnym roztworze BSA O/N w celu poprawy przylegania makrofagów do membrany. W przypadku monocytów/makrofagów należy użyć wkładek o wielkości porów 5 - 8 μm.
    1. Napełnij sterylne naczynie do hodowli tkankowych 1% roztworem BSA i umieść wkładki w naczyniu. Nanieść 200 μl 1% roztworu BSA wewnątrz wkładek.
  3. Umyj wkłady dwukrotnie, umieszczając je w naczyniu wypełnionym sterylnym PBS i nakładając PBS wewnątrz filtra.
  4. Wysiewaj 40 000 komórek HCT116 lub MDA-MB-231 w pożywce o pojemności 0,5 ml RPMI zawierającej 10% FBS wolnego od Tet i 1% Pen/Strep na studzienkę, na 24-dołkowej płytce, w trzech powtórzeniach. Alternatywnie umieść 0,5 ml wcześniej wytworzonej kondycjonowanej pożywki w studzience jako źródło chemoatraktantu.
  5. Następnego dnia umieścić 8 000 monocytów w przygotowanej wstawce w 0,3 ml objętości pożywki RPMI zawierającej 10% FBS wolnego od Tet i 1% Pen/Strep, w trzech egzemplarzach i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  6. Zebrać wkładki po 48 godz.
    UWAGA: Długość eksperymentu musi być zoptymalizowana w zależności od konkretnych warunków i użytych komórek, poprzez przeprowadzenie eksperymentu w czasie, w którym wkładki są zbierane w różnych czasach inkubacji.
    1. Strząśnij nadmiar podłoża i precyzyjnie przetrzyj wewnętrzną powierzchnię aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby usunąć komórki, które nie migrowały.
    2. Zewnętrzną stronę wkładek należy zabarwić metodą Wrighta-Giemsa.
    3. Ostrożnie zamontuj 3 wkładki/szkiełko w mikroskopowym oleju immersyjnym o wysokiej lepkości, upewniając się, że strona filtra z migrującymi makrofagami jest skierowana do góry.
  7. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu świetlnego z obiektywem 20X. Zrób zdjęcia 9 pól/filtra. Policz migrowane makrofagi w 9 polach/filtrze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy sekwencje shRNA zostały przetestowane pod kątem najbardziej efektywnego KD PAI-1. W tym celu sekwencje shRNA przeciwko PAI-1 i zakodowane (Tabela 1) sklonowano do wektora ekspresji Tet-pLKO-puro zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Linię komórkową włókniakomięsaka HT-1080 stabilnie transfekowano wygenerowanymi konstruktami, a komórki leczono doksycykliną przez 3 dni. Ekspresję PAI-1 zweryfikowano za pomocą Western blotting (Figu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Składa się z różnych typów komórek, TME ma kluczowe znaczenie dla rozwoju raka. Aby zapewnić optymalne warunki wzrostu, komórki nowotworowe przyciągają monocyty poprzez wydzielanie czynników chemotaktycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół badania mechanizmu rekrutacji monocytów przez komórki nowotworowe in vitro. W tym celu stosuje się kombinację indukowalnego systemu ekspresji genów, oczyszczanie pierwotnych monocytów ludzkich, a jako przykład testu migracji stosuje się test komory Boydena.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Jacqueline Rosenberg za korektę rękopisu. Prace te były wspierane przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych/Narodowe Instytuty Zdrowia grantem dla YA DeClerck (grant 5R01 CA 129377) oraz Fundacji TJ Martell. MH Kubala jest laureatem stypendium Research Career Development Fellowship przyznawanego przez The Saban Research Institute w Szpitalu Dziecięcym w Los Angeles.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tet-pLKO-puro wektor lentiwirusowyAddgene21915
FBS (bez tetracyklinOmega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
Zestaw wzbogacający ludzkie monocyty EasySepStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Inteligentny buforNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel i system czyszczenia PCRWektor psPAX PROMEGAA9281
Addgene12260
pMD2.G wektorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemicznie kompetentny E. coliThermo Fisher ScientificC737303
zestaw barwników Hema 3 do barwienia Wrighta-GiemsaProtokół123-869
Komórki HEK293ATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
Enzym restrykcyjny XhoINEBR0146S
LigazaNEBM0202S
Bufor ligazyNEBM0202S
EDTA 0,5 M roztwórThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0,1% roztwór poli-L-lizynySigma-AldrichP8920
Octan soduSigma-AldrichS7670
Maślan soduSigma-AldrichB5887
0,45 μ Filtry strzykawkowe MVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Invitrogen15504-020
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
ditioerytrytol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
etanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptonAmrescoJ859-500g
ekstrakt drożdżowyFluka70161-500g
Agar baktoBD214010
ampicylinaSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning21-031-CV
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycynaSigma-AldrichP9620
Hyklalat doksycyklinySigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0,5 M EDTA pH 8,0Thermo Fisher ScientificR1021
Przepuszczalne wsparcie Falcon do 24-dołkowej płytki z 8,0 i mu; m Przezroczysta membrana PETBecton Dickinson353097
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906
Aplikator z bawełnianą końcówką PakietMDS202000
STAT Medline Hema 3 Fisher Scientific Company123-869
Resolve Olejek immersyjny, wysoka lepkośćRichard Allan ScientificM4004
Penicylina StreptomycynaGibco15140122
)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Conditional KnockdownTet ON SystemGene ExpressionCancer Cell LinesMonocyte MigrationTumor MicroenvironmentWestern Blot AnalysisDensity Gradient CentrifugationBoyden Chamber AssayPAI 1 Protein

Powiązane artykuły