Artykuł metodologiczny

Produkcja i walidacja systemu Organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego ilościowego określania przezśródbłonkowej rezystancji elektrycznej

DOI:

10.3791/56334

⸱

26 września 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIOS Lab on a Chip group, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, MESA+ Institute for Nanotechnology and Max Planck Center for Complex Fluid Dynamics, University of Twente, 2Microsystems, Eindhoven University of Technology, 3Applied Stem Cell Technologies, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja opisuje produkcję urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami do bezpośredniego oznaczania oporu elektrycznego przezśródbłonka (TEER). W celu walidacji bariera krew-mózg została naśladowana wewnątrz tego urządzenia mikroprzepływowego i monitorowano jego funkcję bariery. Przedstawione metody integracji elektrod i bezpośredniego oznaczania ilościowego TEER mają ogólne zastosowanie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narządy na chipach, modele in vitro polegające na hodowli (ludzkich) tkanek wewnątrz urządzeń mikroprzepływowych, szybko się rozwijają i obiecują dostarczyć użytecznych narzędzi badawczych do badania ludzkiego zdrowia i chorób. Aby scharakteryzować funkcję barierową warstw komórkowych hodowanych wewnątrz urządzeń typu narząd na chipie, często mierzy się przezśródbłonkową lub przeznabłonkową oporność elektryczną (TEER). W tym celu elektrody są zwykle integrowane z chipem za pomocą metod mikroobróbki, aby zapewnić bardziej stabilne pomiary niż osiąga się to przy ręcznym wprowadzaniu elektrod do wlotów chipa. Jednak elektrody te często utrudniają wizualną kontrolę badanej warstwy ogniw lub wymagają kosztownych procesów produkcyjnych w pomieszczeniach czystych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opisywane tutaj urządzenie zawiera cztery łatwe do zintegrowania elektrody, które są umieszczane i mocowane poza obszarem hodowli, co umożliwia kontrolę wzrokową. Za pomocą tych czterech elektrod można określić ilościowo rezystancję sześciu ścieżek pomiarowych, od których można bezpośrednio odizolować TEER, niezależnie od rezystancji mikrokanałów wypełnionych pożywką hodowlaną. Bariera krew-mózg została zreplikowana w tym urządzeniu, a jego TEER był monitorowany, aby wykazać możliwość zastosowania urządzenia. Układ ten, zintegrowane elektrody i metoda oznaczania TEER są powszechnie stosowane w narządach na chipach, zarówno do naśladowania innych narządów, jak i do włączenia do istniejących systemów narząd na chipie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narządy na chipach szybko wyłaniają się jako nowa i obiecująca klasa modeli tkanek in vitro. 1 W tych modelach, komórki są hodowane w urządzeniach mikroprzepływowych, które są zaprojektowane w taki sposób, aby naśladowały fizjologiczne mikrośrodowisko tych komórek. 1,2 Skutkuje to bardziej realistycznym fizjologicznym lub patologicznym zachowaniem tych komórek, niż można oczekiwać od konwencjonalnych modeli in vitro o prostej konstrukcji i podstawowej funkcji. 3,5,6 Ponadto narządy na chipach zapewniają lepiej kontrolowane środowisko niż modele in vivo i mogą zawierać zarówno zdrowe, jak i chore tkanki pochodzenia ludzkiego, aby wiernie odwzorować zarówno ludzką fizjologię, jak i patologię. Niedawno podsumowane postępy w rozwoju barier krew-mózg na chipach (BBBs-on-chips) pokazują, że dziedzina ta szybko się do przodu. 7

Kolejną zaletą organów na chipach jest to, że umożliwiają one ciągłe monitorowanie w czasie rzeczywistym tkanki hodowanej wewnątrz urządzenia za pomocą mikroskopii, analiz biochemicznych on-line i zintegrowanych czujników. 1,2 Na przykład, pomiar przezśródbłonkowego lub transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) jest skuteczną metodą nieinwazyjnego monitorowania rozwoju i uszkodzenia tkanek tworzących barierę. 8,9,10 TEER to opór elektryczny na barierze komórkowej, a zatem wskazuje na integralność i przepuszczalność bariery. 10 W organach na chipach, bariery komórkowe są zazwyczaj hodowane na błonie, która oddziela dwa kanały płynowe, reprezentujące wierzchołkowe i podstawno-boczne przedziały tej tkanki barierowej. W takich układach pomiary TEER można wygodnie przeprowadzać za pomocą elektrod umieszczonych we wlotach i wylotach dwóch kanałów. 3,4,11,12,13,14,15 Jednak ręczne wkładanie i ponowne wkładanie elektrod może łatwo spowodować błędy umieszczenia, a tym samym zmiany mierzonej rezystancji, jak np. Różnice w oporności dłuższych lub krótszych ścieżek przez mikrokanały są znaczące w porównaniu z opornością bariery komórkowej. 16 Aby wyeliminować błędy ponownego wstawiania, zaproponowano urządzenia ze zintegrowanymi elektrodami. Jednak większość z tych zintegrowanych elektrod zasłania widok podczas inspekcji hodowli tkankowej17,18,19,20,21 i/lub wymagają specjalistycznych procesów w pomieszczeniu czystym do produkcji. 17,22

Urządzenie typu organ-on-chip opisane w tej publikacji, po raz pierwszy zastosowane we wcześniejszej publikacji,16 łączy stabilność zintegrowanych elektrod z widocznością mierzonej warstwy komórek i łatwą produkcją. Projekt i wykonanie tego chipa przedstawiono na Rysunek 1. Krótko mówiąc, urządzenie to składa się z dwóch części z polidimetylosiloksanu (PDMS) z odciskami kanałów, które są połączone ze sobą bez wycieków za pomocą membrany poliwęglanowej z porami 0,4 μm pomiędzy nimi. Cztery elektrody z drutu platynowego są wprowadzane i mocowane na miejscu za pomocą fotoutwardzalnego kleju daleko poza obszarem hodowli. Wszystkie te etapy produkcji można przeprowadzić przy użyciu ogólnego sprzętu laboratoryjnego, bez konieczności stosowania środowiska w pomieszczeniu czystym. Ponadto za pomocą tych czterech elektrod można wykonać sześć pomiarów impedancji, co pozwala na bezpośrednią izolację mierzonego TEER, niezależnie od rezystancji mikrokanałów prowadzących do przekroju poprzecznego, a tym samym minimalizuje wpływ niebiologicznych zmian w systemie, takich jak błędy (ponownego) wstawienia. 16

Aby pokazać możliwość zastosowania tego urządzenia i bezpośrednie pomiary TEER, bariera krew-mózg (BBB) została zreplikowana w tym chipie. Ta bariera biologiczna składa się z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka i reguluje transport między krwią a mózgiem, aby zapewnić homeostazę mózgu. 23,24 Aby naśladować barierę krew-mózg, górny kanał urządzenia mikroprzepływowego został wyłożony ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego z linii komórkowej hCMEC/D3 (dzięki uprzejmości dostarczonej przez Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paryż, Francja). 25 Przedstawiona metoda jest jednak bardziej ogólnie stosowana do każdego urządzenia typu organ-on-chip z dwoma komorami, umożliwiając bezpośrednie określenie TEER za pomocą łatwo zintegrowanych elektrod.

W tym manuskrypcie najpierw opisany jest proces produkcji urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami. Następnie wyjaśniona jest procedura wysiewu i hodowla komórek śródbłonka mózgu wewnątrz urządzenia, a także pomiary TEER na chipie. W sekcji wyników pokazane są reprezentatywne pomiary TEER i wyjaśnione jest przetwarzanie danych. Na koniec przedstawiono funkcję barierową BBB-on-chip, monitorowaną przez 3 dni, pokazującą możliwość zastosowania prezentowanego urządzenia i metod monitorowania TEER.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzenia typu organ-on-chip

  1. Wykonaj replikę formy PDMS z projektami kanałów, wykonanymi przy użyciu standardowych technik fotolitografii, i uzyskaj części PDMS układu mikroprzepływowego.
    1. Zważyć około 27 g środka bazowego PDMS i 2,7 g utwardzacza; stosunek masowy musi wynosić 10:1. Jest to dobre rozwiązanie dla płyty PDMS o grubości 3 mm na formie o średnicy 130 mm (5 cali). Dokładnie wymieszaj te składniki.
    2. Odgazować mieszaninę w eksykatorze przez około 45 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    3. W międzyczasie przygotuj formę na płynną mieszaninę PDMS, przyklejając przezroczystą taśmę wokół formy lub umieść formę w odpowiednim uchwycie na wafle.
    4. Wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na formę. Jeśli w mieszaninie PDMS lub na powierzchni formy pozostały jakiekolwiek pęcherzyki powietrza, należy ją ponownie odgazować przez około 30 minut.
    5. Mieszaninę PDMS utwardzić w suszarce w temperaturze 60 °C przez 4 godziny. Pozostawić do ostygnięcia.
    6. W okapie z przepływem krzyżowym wyciągnij utwardzony PDMS z formy; forma może być natychmiast ponownie użyta do produkcji większej liczby replik PDMS.
    7. Pokrój replikę PDMS na oddzielne górne i dolne części chipa za pomocą linii cięcia w PDMS.
    8. Przebij cztery otwory w górnych częściach za pomocą ostrego stempla do biopsji o średnicy 1 mm, aby utworzyć wloty i wyloty. Przebijaj od wewnątrz na zewnątrz, aby zapobiec gromadzeniu się zanieczyszczeń PDMS w chipie. Przykryj części chipa przezroczystą taśmą, aby chronić je przed kurzem.
    9. Wytnij membrany poliwęglanowe z wkładek Transwell na kwadraty o boku około 3×3 mm2.
  2. Zamontuj szczelną membranę porowatą pomiędzy dwiema częściami PDMS, aby zmontować dwuwarstwowe urządzenie połączone z porowatą membraną.
    UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Griep et al. 19 oraz Chueh et al. 26
    1. Przygotować zaprawę PDMS/toluen, używając 0,7 g środka bazowego PDMS, 0,07 g utwardzacza i 540 μl toluenu, co daje stosunek wagowy 5:3. Dokładnie wymieszaj zaprawę.
    2. Wirować 200 μl zaprawy na szkiełku nakrywkowym z prędkością 1500 obr./min przez 60 s (z prędkością 1000 obr./min), aby uzyskać cienką, jednolitą warstwę zaprawy.
    3. Przenieś cienką warstwę zaprawy z szkiełka nakrywkowego na dolną i górną część wióra za pomocą wałka do farby. Umieść dolną część w naczyniu żaroodpornym.
    4. Za pomocą zestawu pęsety zanurz krawędzie membrany w zaprawie pokrytej spinem i ostrożnie umieść ją na środku dolnej części.
    5. Ostrożnie umieść górną część na dolnej części, zwracając uwagę na wyrównanie.
      UWAGA: Nie wywieraj nacisku na wiór i nie przesuwaj górnej części po dolnej części, aby zapobiec przedostawaniu się zaprawy do kanałów i zatykaniu membrany.
    6. Przykryj wloty frytek przezroczystą taśmą, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do frytki i piecz je w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
  3. Zintegruj elektrody z kanałami bocznymi.
    UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Griep et al. 19 oraz Douville et al. 18
    1. Pokrój drut platynowy na kawałki o długości około 2 cm. Oczyścić je zanurzając je w acetonie na 30 minut. Spłucz wodą i etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
    2. W okapie z przepływem krzyżowym połóż chip na plastikowym naczyniu. Włóż cztery platynowe druty do kanałów elektrod chipa za pomocą pęsety i zegnij je na plastikowym naczyniu, aby umożliwić przymocowanie do naczynia w kolejnym kroku. Włóż przewody 0,7-1 mm do kanału hodowlanego, za złączem kanału w kształcie litery T.
    3. Nałóż kroplę kleju utwardzanego promieniami UV na wejście do kanału elektrody i pozwól, aby klej wypełnił kanał wokół elektrody za pomocą sił kapilarnych.
    4. Włącz UV i utwardź klej, gdy dotrze do końca kanału elektrody.
      ostrożność: Nie patrz w źródło światła UV, ponieważ może to uszkodzić oczy.
    5. Przymocuj cztery zintegrowane elektrody do plastikowego naczynia za pomocą dwuskładnikowego kleju epoksydowego. Pozwala to na łatwiejszą obsługę elektrod podczas pomiarów bez ryzyka wyrwania elektrod z chipa.
    6. Przykryj frytki przezroczystą taśmą i piecz je w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Pozostaw do ostygnięcia i przechowuj w stanie wolnym od kurzu do czasu użycia. W ten sposób można je bezpiecznie przechowywać nawet przez miesiąc.

2. Hodowla komórek śródbłonka pochodzących z mózgu na chipie

  1. Pokryj chipy, aby promować przyczepianie komórek.
    1. Napełnij oba kanały solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby je zwilżyć przed wprowadzeniem odczynników. Sprawdź pod mikroskopem, czy w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli tak, usuń je, przepłukując dodatkowym PBS.
    2. Wypełnij oba kanały 30 μl 20 μg/ml ludzkiej fibronektyny w PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza i, jeśli to konieczne, przepłucz kanały PBS i napełnij roztworem fibronektyny.
    3. Przepłukać wióry śródbłonkowym podłożem wzrostowym i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze przez 2 godziny.
    4. Zmierz TEER ślepych chipów zgodnie z opisem w kroku 3, aby upewnić się, że wszystkie elektrody mają bezpośredni kontakt z płynem w kanałach. W pustych wiórach typowe wartości TEER wynoszą 0-1 Ωcm2.
  2. Komórki nasienne do górnego kanału.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby hodowlanej (75cm2 obszar hodowli) ze zlewającą się monowarstwą ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (hCMEC/D3).
    2. Umyj komórki PBS. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-5 minut, aż komórki odłączą się od kolby hodowlanej.
    3. Dezaktywuj trypsynę za pomocą pożywki hodowlanej uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Policz komórki i oblicz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
    4. W międzyczasie odwirować komórki hCMEC/D3 przy 390 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
    5. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki wzrostowej śródbłonka (EGM-2), aby uzyskać stężenie 5 x 106 komórek/ml. Daje to gęstość wysiewu 2 x 105 komórek/cm2 w chipie.
    6. Powoli odpipetować 30 μl dobrze wymieszanej zawiesiny komórek do górnego kanału i wyjąć pipetę z wlotu płynnym ruchem, nadal wywierając nacisk.
    7. Sprawdź gęstość wysiewu pod mikroskopem. Należy osiągnąć równomierny rozkład komórek w całym górnym kanale.
    8. Inkubować zrębki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Wypłukać wszystkie nieprzyłączone komórki za pomocą pożywki do hodowli śródbłonka.
  3. Utrzymuj posiew śródbłonka na chipie.
    1. Dwa razy dziennie wkładaj końcówki pipet wypełnione pożywką hodowlaną jako zbiorniki do wlotów i zastępuj pożywkę wewnątrz chipa przepływem napędzanym grawitacyjnie.
      UWAGA: Aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza do mikrokanalików i niszczenia warstwy komórek, przed włożeniem końcówki do wlotu upewnij się, że końcówka pipety styka się z płynem i płynem znajdującym się na wierzchu chipa. Można to ułatwić, dodając niewielką kroplę na wejściu/wylocie przed włożeniem pipety.
    2. Dodaj również zbiorniki na końcówki do pipet w wylotach, aby zapobiec wysychaniu kanałów.
    3. Inkubować wióry w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Pomiary TEER na chipie

  1. Ustawić aparaturę pomiarową TEER, składającą się ze wzmacniacza typu lock-in i obwodu sondy, jak określono w Van der Helm i wsp. 16 Alternatywnie, potencjostaty lub analizatory impedancji są również odpowiednie do tych pomiarów TEER opartych na impedancji.
  2. Wyjmij chip z inkubatora i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową przez co najmniej 10 minut. Usuń płyn z plastikowego naczynia wokół elektrod, aby zapobiec mostkowaniu elektrody na zewnątrz chipa.
  3. Weź widmo impedancji od 200 Hz do 1 MHz dla każdej kombinacji dwóch elektrod, co daje 6 widm impedancji na chip w zaledwie 5-10 minut. Sprawdź, czy widma impedancji mają oczekiwane wielkości i kształty, aby potwierdzić pomiar TEER, jak opisano w sekcji wyników.
  4. Po zakończeniu pomiaru umieścić chip z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Przetwarzaj uzyskane widma impedancji, aby uzyskać znormalizowaną wartość TEER.
    1. Uzyskaj zmierzoną rezystancję figure-protocol-1 między elektrodami figure-protocol-2 i figure-protocol-3, jak oznaczono w Rysunek 2B i D, z płaskowyżu rezystancyjnego przy 10 kHz w odpowiednich widmach impedancji.
    2. Oblicz TEER przy użyciu sześciu zmierzonych rezystancji odpowiadających jednemu chipowi w jednym punkcie czasowym, korzystając z równania Rysunek 2G16:
      figure-protocol-4
      W tym równaniu figure-protocol-5 to obszar hodowlany, przez który zmierzono rezystancję, figure-protocol-6 oznacza opór bariery komórkowej i błony, figure-protocol-7, figure-protocol-8, figure-protocol-9 i figure-protocol-10 to wartości oporu mierzone przez barierę komórkową i figure-protocol-11 i figure-protocol-12 to wartości rezystancji mierzone w kanałach prostych.16 Równanie pochodzi z równoważnego obwodu zilustrowanego na Rysunek 2C.
  6. Odejmij ślepą wartość TEER od TEER we wszystkich punktach czasowych, aby uzyskać rozwój TEER w czasie.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne wyniki spektroskopii impedancji elektrycznej przez chip bez komórek (linia ciągła) i przez barierę komórkową (linia przerywana) są pokazane w Rysunek 2A. Można zidentyfikować cztery główne obszary, z których każdy jest zdominowany przez określony komponent elektryczny. Poniżej około 1 kHz dominuje pojemność dwuwarstwowa na granicy faz elektroda-kultura średnia, charakteryzująca się ujemnym nachyleniem dla wielkości impedancji i przesunięciem fazowym zbliżającym się do -90°. Częstotliwość, przy której dominuje pojemność dwuwarstwowa, zależy od obszaru elektrody wystawionej na działanie pożywki hodowlanej. Plateau rezystancyjne powyżej 1 kHz (bez komórek) lub 100 kHz (z komórkami) z przesunięciem fazowym bliskim 0°, odpowiada rezystancji pożywki hodowlanej wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, w zależności od długości kanału i pola przekroju poprzecznego oraz wewnątrz membrany, w zależności od porowatości i grubości. Podczas pomiaru przez barierę komórkową widoczny jest dodatkowy plateau rezystancyjny między 1 a 10 kHz, a także lokalne maksimum na schemacie fazowym. Obszar ten ma kluczowe znaczenie dla wyznaczenia TEER jako wyraźnego wzrostu wyników impedancji, gdy komórki są obecne na mierzonej ścieżce i dlatego jest określany jako "obszar zainteresowania". Dodatkowe nachylenie między 10 a 100 kHz odpowiada pojemności bariery komórkowej, która powstaje z elektrycznie izolujących dwuwarstwowych błon lipidowych i zależy od całkowitej powierzchni warstwy komórkowej. 27 Granice tych obszarów, jak również wielkości impedancji zależą od badanego systemu i zmieniają się, między innymi, wymiarami kanału, przewodnością podłoża hodowlanego, położeniem elektrody i typem ogniwa. W celu uzyskania dalszych informacji na temat teorii i praktyki spektroskopii impedancji elektrycznej na tkankach tworzących barierę zaleca się zapoznanie się z artykułem przeglądowym Bensona i wsp. 28

Reprezentatywne dane z pomiarów TEER są pokazane zarówno dla czystego chipa, jak i chipa z warstwą komórek śródbłonka mózgu hCMEC/D3 w Rysunek 2E i 2F, odpowiednio. Krótko mówiąc, spektroskopię impedancyjną przeprowadzono przy użyciu sześciu pomiarów za pomocą czterech elektrod: dwóch pomiarów przez kanały wypełnione pożywką do hodowli komórkowej (linie ciągłe) i cztery pomiary przez kanały, a także błonę i - jeśli występuje - barierę komórkową (linie przerywane). Te sześć ścieżek pomiarowych można zidentyfikować w równoważnym obwodzie rezystancyjnym Rysunek 2B, który pochodzi ze schematycznego przekroju poprzecznego (Rysunek 2C) i widoku z góry (Rysunek 2D). Pomiary ślepej ilości chipów (Rysunek 2E) pokazują typowy kształt widm impedancji bez komórek, jak pokazano na Rysunek 2A. Pomiary przez barierę komórkową (linie przerywane w Rysunek 2F) przypominają typowe widma impedancji z komórkami w Rysunek 2A. Należy zauważyć, że zarówno wielkość impedancji, jak i przesunięcie fazowe rosną w kierunku 1 MHz. Jest to typowa reakcja układu pomiarowego przy wysokich częstotliwościach i nie ma pochodzenia eksperymentalnego.

Aby określić TEER za pomocą tych eksperymentalnych widm impedancji, najpierw określa się zmierzoną rezystancję chipa, która jest całkowitą rezystancją warstwy komórki, kanałów i membrany. W tym celu wybrano odpowiednią częstotliwość odczytu w obszarze zainteresowania, która wynosi lokalne maksimum na wykresie fazowym z komórkami i przesunięcie fazowe bliskie 0° bez komórek: 10 kHz. Z sześcioma zmierzonymi rezystancjami przy 10 kHz, mierzonymi między czterema elektrodami, TEER jest obliczany bezpośrednio za pomocą równania w Rysunek 2F.

Aby pokazać, że prezentowane urządzenie nadaje się do określania TEER w organach na chipach, BBB został zreplikowany wewnątrz chipa, a jego TEER był monitorowany przez 3 dni hodowli. W Rysunek 3A średni TEER ± błąd standardowy średniej (SEM) jest pokazany dla czterech BBBs-on-chips, co daje plateau 22 ± 1,3 Ω cm2, co jest porównywalne do TEER tej linii komórkowej, jak podaje literatura. 29 Ponadto, po zakończeniu eksperymentu i barwieniu fluorescencyjnym jąder, można zauważyć, że śródbłonek mózgu utworzył ciągłą monowarstwę wewnątrz urządzenia (Rysunek 3B). Barwienie immunofluorescencyjne białka ścisłego połączenia Zonula Occludens-1 (ZO-1) wykazało, że komórki śródbłonka mózgu zachowały fenotyp specyficzny dla BBB i utworzyły ścisłe kompleksy połączeniowe.

figure-results-1
Rysunek 1: Projektowanie i montaż urządzenia typu organ-on-chip ze zintegrowanymi elektrodami.
(A) Widok rozstrzelony chipa mikroprzepływowego, składającego się z górnej części PDMS z górnym kanałem (TC), membrany (M) i dolnej części PDMS z dolnym kanałem (BC). Cztery elektrody z drutu platynowego (E1-4) są wprowadzane i mocowane w kanałach bocznych. W górnym kanale i na górze błony wyhodowano komórki śródbłonka mózgu hCMEC/D3 w celu replikacji bariery krew-mózg. (B) Zmontowany chip, przymocowany do plastikowego naczynia. Przedruk i adaptacja za zgodą Elsevier. 16 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne dane dotyczące impedancji i określenie TEER.
(A) Schematyczne widmo impedancji pokazujące wielkość impedancji (Ω) i przesunięcie fazowe (°) w funkcji częstotliwości (Hz), typowe dla spektroskopii impedancji elektrycznej na chipach bez ogniw (linia ciągła) i z komórkami (linia przerywana). Istnieją cztery główne obszary, z których każdy jest zdominowany przez: pojemność dwuwarstwową elektrod, rezystancję pożywki hodowlanej, rezystancję bariery komórkowej i pojemność błony komórkowej. "Obszar zainteresowania" wskazuje, gdzie można określić ilościowo udział warstwy komórkowej (czerwona strzałka). (B) Równoważny obwód rezystancyjny układu scalonego, przedstawiający rezystory górnego kanału R1 i R3, rezystory dolnego kanału R2 i R4 oraz membranę i rezystor barierowy EC Rm. (C) Schematyczny przekrój poprzeczny przedstawiający komórki śródbłonka (EC) hodowane w górnym kanale. (D) Schematyczny widok z góry chipa BBB przedstawiający konfigurację elektrod i obszar hodowli 0,25 mm2, przez który mierzona jest impedancja. (E) Reprezentatywne widma impedancji czystego chipa wypełnionego pożywką do hodowli komórkowych. (F) Reprezentatywne widma impedancji chipa, w którym hodowano komórki śródbłonka mózgu hCMEC/D3 przez 3 dni. (G) Wzór do obliczania TEER na podstawie zmierzonych rezystancji między wszystkimi sześcioma kombinacjami czterech elektrod. Przedruk i adaptacja za zgodą Elsevier. 16 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywny rozwój TEER dla BBB-on-chip.
(A) Średni TEER ± błąd standardowy średniej (SEM) czterech BBB na chipach podczas trzydniowego okresu hodowli, osiągając plateau na poziomie 22 ± 1,3 Ωcm2 (średnia ± SEM). Dla porównania uwzględniono dane dotyczące ślepych chipów, pokazujące marginalną zmienność i odchylenie od 0 Ωcm2 w tym samym okresie w porównaniu ze zmiennością i wartością TEER chipów z komórkami. (B) Mikroskopia fluorescencyjna barwionych jąder ujawniła ciągłą monowarstwę śródbłonka, zarówno na PDMS, jak i na błonie w miejscu wskazanym we wstawce. (C) Immunofluorescencja ujawniła obecność białka ścisłego połączenia Zonula Occludens-1, co wskazuje, że specyficzne dla BBB ścisłe połączenia między komórkami powodują powstanie zmierzonego TEER. Przedruk i adaptacja za zgodą Elsevier. 16 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono inżynierię urządzenia typu organ-on-chip oraz bezpośrednie określenie przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) bariery komórkowej hodowanej w urządzeniu. Przedstawiona metoda integracji elektrod bez wyposażenia pomieszczeń czystych oraz bezpośredniego oznaczania TEER za pomocą czterech elektrod ma zastosowanie do każdego urządzenia typu organ-on-chip z dwoma komorami mikroprzepływowymi. Układ i geometria chipa mogą być dostosowane do wymagań przewidywanych eksperymentów, o ile cztery elektrody są oddzielone w dwóch komorach. Cztery elektrody można nawet wygodnie umieścić we wlotach istniejących chipów, pod warunkiem, że są one zamocowane na czas trwania sześciu pomiarów. Metoda klejenia bez wycieków może być zoptymalizowana dla różnych geometrii membran i kanałów poprzez zmianę stosunku PDMS do toluenu. Wyższa zawartość toluenu powoduje powstanie cieńszej warstwy zaprawy26 pokrytej wirowo i może być bardziej odpowiednia dla płytszych i węższych kanałów w częściach PDMS. Niższa zawartość toluenu skutkuje grubszą warstwą zaprawy26 i może być bardziej odpowiednia do zamykania grubszych membran między częściami PDMS.

Jak widać na schematycznych widmach impedancji na rysunku 2A i widmach eksperymentalnych na rysunkach 2E i 2F, na pomiary impedancji ma wpływ pojemność warstwy podwójnej na granicy faz elektroda-medium. Ze względu na mały rozmiar elektrod wewnątrz mikrokanałów, pojemność dwuwarstwowa może dominować nad rezystancyjnym plateau bariery komórkowej w widmach impedancji, komplikując kwantyfikację TEER. Aby temu zaradzić, elektrody można wprowadzić dalej do kanałów hodowlanych przed utrwaleniem. Zwiększy to powierzchnię elektrody wystawionej na działanie pożywki hodowlanej, a wraz z nią zwiększy się również pojemność podwójnej warstwy. Powoduje to przesunięcie nachylenia pojemnościowego na niższe częstotliwości, dzięki czemu płaskowyż rezystancyjny bariery komórkowej może być łatwiej rozpoznany i określony ilościowo. Chociaż rezystancja mierzonej ścieżki między dwiema elektrodami będzie się zmniejszać, nie wpłynie to na kwantyfikację TEER zgodnie z przedstawioną metodą.

Podczas pomiaru przez barierę komórkową możliwe jest, że nie można rozpoznać plateau dodatkowego oporu. Może to być wynikiem płynnego połączenia między dwoma kanałami, na przykład, jeśli membrana jest słabo zamknięta przez zaprawę, co prowadzi do zmierzonej ścieżki wokół bariery komórkowej. Ponadto na zewnątrz chipa może wystąpić mostek elektryczny, jeśli elektrody są połączone kroplą pożywki hodowlanej. Jest to zwykle połączone z niższą zmierzoną impedancją i można to rozwiązać, usuwając ten mostek pożywki hodowlanej. Wreszcie, jeśli nie ma plateau rezystancyjnego, a zmierzona impedancja jest o rzędy wielkości wyższa niż oczekiwano, może to oznaczać luźne połączenie w przewodzie elektrycznym lub w źródle zasilania.

W przyszłości fizjologiczne znaczenie obecnego BBB-on-chip może zostać zwiększone poprzez wystawienie komórek śródbłonka na naprężenia ścinające na poziomie fizjologicznym, co według doniesień sprzyja różnicowaniu BBB i zwiększa szczelność bariery i jest trudne do osiągnięcia w konwencjonalnych modelach in vitro . 29 Ponadto dolny kanał prezentowanego urządzenia zapewnia odpowiednią komorę dla komórek pochodzących z mózgu, które mają być hodowane wspólnie ze śródbłonkiem. Oczekuje się również, że zwiększy to funkcję bariery, a także umożliwi badanie złożonych interakcji między odpowiednimi typami komórek w warunkach patologicznych. 29

Podsumowując, opisane w tej publikacji urządzenie typu organ-on-chip może być wytwarzane przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i zapewnia bezpośrednie pomiary TEER przy użyciu czterech zintegrowanych elektrod, które nie utrudniają wizualnej kontroli badanej warstwy komórkowej. Możliwość zastosowania tego urządzenia w dziedzinie narządów na chipach została wykazana poprzez naśladowanie BBB w tym chipie i monitorowanie TEER w okresie hodowli. Wiele innych narządów (barierowych) można naśladować, włączając inne odpowiednie typy komórek do tego chipa. Ponadto metodę pomiaru TEER można łatwo zastosować w innych dwóch urządzeniach typu organ-on-chip opartych na kompartmentach, aby uzyskać powtarzalne i miarodajne wartości TEER, które można porównać między urządzeniami i systemami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Johanowi Bomerowi za wykonanie formy i Mathijsowi Bronkhorstowi za owocne dyskusje i pomoc w reprezentacji danych.

To badanie zostało sfinansowane przez: SRO Biomedical Microdevices of L.I. Segerink, MIRA Institute for Biomedical Engineering and Technical Medicine, University of Twente; SRO Organs-on-Chips A.D. van der Meera, Instytut Inżynierii Biomedycznej i Medycyny Technicznej MIRA, Uniwersytet Twente; oraz VESCEL, ERC Advanced Grant dla A. van den Berga (grant nr 669768).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
Polydimethylsiloxane (PDMS) środek bazowy i utwardzacz: Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning1673921
Scotch Magic tape3M
Dziurkacz do biopsji, średnica 1,0 mmIntegra Miltex33-31AA-P/25
Membrana poliwęglanowa, 0,4 i mikro; m wielkość porówCorning3401Wycięty z wkładek hodowlanych Transwell
ToluenSigma-Aldrich244511
Drut platynowy, 200 &mikro; średnica mKlej utwardzany promieniami UV Alfa Aesar10287
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA 81
Klej epoksydowy: Loctite M-31 CL HysolHenkel30673
hCMEC / D3 Ludzkalinia komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, uprzejmie dostarczona przez dr P.-O. Couraud, INSERM, Paryż, Francja
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP4417
Fibronektyna z ludzkiego osocza, 20 i mikro; g/mlGibco33016015
Endothelial growth medium-2 (EGM-2)LonzaCC-3162Endothelial basal medium-2 (EBM-2) uzupełnione EGM-2 SingleQuots
Trypsin-EDTA, 0,05%Gibco15400-054
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140-079
NazwaFirma Numer katalogowyKomentarze
Equipment
ovenBinder9010-0190
Powlekarka wirowa: Spin 150PolosSPIN150-NPP
Źródło światła UV, 365 nm przez 5 s przy 350 mW/cm2Wyprodukowano we własnym zakresie
Wirówka: Wirówka Allegra X-12RBeckman Coulter
BinderCB E2 150
BoxenseLocSenseWzmacniacz blokujący z obwodem sondy, przeznaczony do pomiarów TEER na chipie
: Inkubator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
  3. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  5. Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  6. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  7. Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).
  8. Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
  9. Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  12. Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).
  13. Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
  14. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  15. Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
  16. Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
  17. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  18. Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
  19. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  20. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
  21. Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
  22. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  24. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  25. Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  26. Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
  27. Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
  28. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
  29. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera krew m zgpomiar TEERwytwarzanie PDMSchipy mikroprzep ywowefunkcja bariery kom rkowejspektroskopia impedancyjnaelektrody platynowe

Powiązane artykuły