Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Inwazja i migracja komórek są zaangażowane w rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych, co jest główną przyczyną oporności na leczenie¹ i może prowadzić do nawrócenia lokoregionalnego lub przerzutowego po leczeniu raka². Przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) to początkowy proces inwazji i migracji komórek, w którym komórki rakowe przechodzą z fenotypu nabłonkowego na mezenchymalny. E-kadheryna jest zewnątrzkomórkowym markerem fenotypu nabłonkowego³, a zwiększona ekspresja N-kadheryny i wimentyny jest charakterystyczna dla fenotypu mezenchymalnego⁴. Migracja zależy również od wewnętrznej zdolności komórek nowotworowych do inwazji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) poprzez działanie metaloproteaz macierzy⁵.

Ten mechanizm inwazji i migracji został opisany dla raka w wielu miejscach, szczególnie w raku głowy i szyi⁶. Wielu badaczy skupiło się na procesach migracji i inwazji, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób rozprzestrzeniają się komórki nowotworowe, w nadziei, że ta wiedza doprowadzi do nowych strategii leczenia. Bardzo ważne jest, aby badania te były przeprowadzane przy użyciu wiarygodnych i powtarzalnych testów.

Analiza ruchliwości komórek in vitro może być wyzwaniem. Opracowany wiele lat temu test komory Boydena jest uważany za standard analizy inwazji i migracji⁷. Jest to jednak czasochłonne i często niedokładne. Drugim testem jest test gojenia się ran⁸, który polega na wykonaniu rysy na monowarstwowej kulturze komórkowej i uchwyceniu obrazów inwazji i migracji komórek w ustalonych odstępach czasu. Technika ta była szeroko krytykowana ze względu na duże różnice między wynikami dwóch kolejnych testów. Jednak zastosowanie nowoczesnych technologii, zwłaszcza w mikroskopii, poprawiło odtwarzalność testu ran drapanych. Mikroskopy wideo można łatwo wprowadzić do inkubatorów i mogą one generować obrazy migracji komórek w czasie rzeczywistym. Urządzenia te rejestrują dane mikroskopowe i zapewniają automatyczną analizę zbiegania się komórek rany w czasie. Celem niniejszego artykułu jest opisanie testu komorowego Boydena i zoptymalizowanego testu ran drapanych, a także omówienie zalet i wad każdego z tych podejść.

UWAGA: Testy komory Boydena i zadrapania bez włączenia ECM są określane jako testy migracji, a te same testy z ECM są określane jako testy inwazji.

1. Test w komorze Boydena

UWAGA: Ten protokół jest dostosowany do linii komórkowej SQ20B, która wywodzi się z nawracającego raka krtani z rakiem płaskonabłonkowym głowy i szyi (HNSCC) i została uzyskana od Johna Little'a (Boston, MA, USA).

Dzień 1

1. Wysiewanie komórek
   1. Zasiać 2 10⁶ komórek SQ20B w 12 ml pożywki hodowlanej (CM) w kolbie o długości 175 cm² na 72 godziny przed pierwszym dniem i pozwolić komórkom urosnąć do 80% zbiegu komórek.
      1. Aby przygotować CM dla komórek SQ20B, uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 0,04 mg / ml hydrokortyzonu, 100 U / ml penicyliny i 0,1 g / l streptomycyny.
   2. Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 2,5 ml trypsyny, kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 g/l). Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 12,5 ml CM ogrzanego do temperatury 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
   3. Wysiewać komórki w kolbie o średnicy 25^cm2 o gęstości komórek 6, 10,⁵ komórek dla każdego warunku, który ma być oceniany. Inkubować komórki przez 24 godziny w 3 ml CM.

Dzień 2

2. Głód komórek i przygotowanie komór powlekanych
   1. Zagłodzić komórki, zastępując pożywkę w każdej kolbie 3 ml pożywki z niskopłodowej surowicy bydlęcej (FBS) przy użyciu 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zamiast FBS. Zagłodź komórki przez 24 godziny w inkubatorze.
      1. Aby przygotować głodówkę CM (s-CM), uzupełnij DMEM 0,1% BSA, 0,04 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.
   2. Aby uzyskać test migracji, przejdź do kroku 1.3.
   3. Do testu inwazji, 12 godzin przed dniem 3, przygotuj powlekane komory Boydena, dodając 500 μl s-CM do każdej powlekanej komory. Używaj komercyjnie przygotowanych powlekanych komór Boydena i przechowuj je w temperaturze 4 °C przed użyciem. Umieścić każdą komorę Boydena na płytce towarzyszącej i ustawić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.

Dzień 3

3. Wysiew komórek w komorze Boydena
   1. Użyj płytki towarzyszącej, aby przygotować chemoatraktant. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki towarzyszącej 750 μl kompletnego podłoża z 10% FBS, 0,04 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.
      1. Dostosuj chemoatraktant do każdej linii komórkowej i każdego warunku leczenia. Aby przygotować chemoatraktant CM (ca-CM), uzupełnij DMEM o 10% FCS, 0,4 mg/ml hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny.
   2. Przenieś górną komorę do wstępnie napełnionej płytki towarzyszącej, uważając, aby nie powstały bąbelki.
   3. Do testu inwazji ostrożnie usuń 450 μl CM z każdej komory Boydena.
   4. Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym PBS, dodać 0,5 ml trypsyny EDTA (0,5 g/l), a następnie inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie CM ogrzanego do 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
   5. Wysiew 3 10⁴ komórek SQ20B w 500 μl 0,1% pożywki BSA, co daje końcowe rozcieńczenie 6 10⁴ komórek/ml.
      UWAGA: Stężenie komórek powinno być dostosowane do każdej linii komórkowej.
   6. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.

Dzień 4

4. Utrwalanie i barwienie komórek
   1. Napraw komórki przed czasem podwojenia specyficznym dla tej linii komórkowej. Napraw ogniwa SQ20B przed 24 godzinami.
   2. Wyjmij każdą wkładkę z płytki towarzyszącej i ostrożnie usuń komórki z górnej komory za pomocą bawełnianego wacika. Szczególnie ważne jest usunięcie wszystkich komórek znajdujących się w górnej komorze.
   3. Napraw i zabejcuj każdą wkładkę indywidualnie, aby uzyskać kolorystykę May-Grunwald Giemsa⁹ za pomocą dołączonego zestawu do barwienia. Alternatywnie, użyj 4% paraformaldehydu w innej płytce towarzyszącej, aby uzyskać 30-minutowe utrwalenie.
   4. Przechowuj wkładki na pustej 24-dołkowej płytce towarzyszącej pod okapem laboratoryjnym, aby wysuszyć każdą komorę.

Dzień 5

5. Analiza mikroskopowa
   1. Umieść płytkę towarzyszącą z wkładkami do mikroskopu z 20 kontrastami fazowymi i policz każdą migrowaną komórkę w dolnej części membrany. Zoptymalizuj właściwą pozycję ostrości, przesuwając obiektyw od dołu do góry i zatrzymaj pozycję w dolnej części membrany.
   2. Oblicz stosunek liczby migrowanych komórek do komórek zasiewanych. Powtórzyć każde liczenie dla każdego stanu leczenia w trzech egzemplarzach.

2. Test ran drapanych: Migracja komórek

UWAGA: Instrukcje muszą być dostosowane do każdego typu komórki.

Dzień 1

1. Wysiewanie komórek
   1. Zasiaj 2 x 10⁶ komórek SQ20B w 12 ml CM w kolbie o długości 175 cm² 72 godziny przed pierwszym dniem i pozwól komórkom urosnąć do 80% zbiegu komórek.
   2. Pod kapturem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć komórki sterylnym PBS, dodać 2,5 ml trypsyny EDTA (0,5 g/l) i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie 12,5 ml CM ogrzanego do 37 °C. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
   3. Wytwarzać wstępnie rozcieńczoną próbkę o gęstości komórek 4 x 10⁵/ml, uzyskując końcową gęstość 4 10⁴ komórek na 100 μl w każdym dołku. Stężenie to musi być dostosowane dla każdej linii komórkowej i powinno mieścić się w zakresie od 1 x 10⁴ do 6 10⁴ komórek.
   4. Komórki nasienne umieścić w każdym dołku płytki 96-dołkowej, umieszczając 100 μl roztworu przygotowanego w kroku 2.1.2.
   5. Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby równomiernie rozproszyć komórki na dnie studzienek.
   6. Umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić komórki do przylegania do płytki przez 12-16 godzin (maksymalnie) w temperaturze 37 °C.

Dzień 2

2. Test ran drapanych
   1. Wyjąć z inkubatora płytki przygotowane w kroku 2.1
   .
   2. Pod maską wykonaj ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta.
   3. Natychmiast usunąć pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką, uważając, aby nie dotknąć rany.
   4. Przemyć komórki dwukrotnie, powtarzając aspirację i używając 100 μl CM ogrzanego do temperatury 37 °C dla każdej studzienki.
   5. Wyjmij CM za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką po etapach mycia.
   6. Do każdego dołka dodać 100 μl pożywki specyficznej dla każdego stanu leczenia.
   7. Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków w studzienkach. Pomocna może być w tym przypadku technika odwróconego pipetowania. Alternatywnie usuń bąbelki za pomocą igły strzykawki.
   8. Umieść płytkę w przystosowanym do tego stojaku wideomikroskopu.
   9. Aby poprawić jakość obrazu, pozwól płytce ogrzać się przez co najmniej 15 minut przed pierwszym skanowaniem, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na dolnej stronie płytki.
   10. Zaprogramuj harmonogram skanów za pomocą oprogramowania mikroskopu wideo na jednym obrazie na studzienkę. W przypadku eksperymentu inwazji-migracji wymagany jest maksymalnie 2-godzinny interwał. Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest interwał wynoszący maksymalnie 30 minut.
   11. Pod koniec eksperymentu dokładnie umyj urządzenie do nawijania i postępuj zgodnie z każdym z czterech etapów mycia wskazanych przez producenta.

Dni 3, 4 i 5

3. Analiza migracji z wykorzystaniem wideomikroskopu
   1. Przez minimum 24 godziny do maksymalnie 5 dni monitoruj i sprawdzaj migrację komórek.
   2. Użyj odpowiedniej maski komórki dostosowanej do każdego typu komórki, aby przeanalizować migrację komórek. Aby uzyskać maskę komórki dostosowaną do każdej linii komórkowej, wygeneruj definicję przetwarzania komórki z oprogramowania przy użyciu określonego zbioru obrazów komórek.
   3. Śledź krzywe i eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, który można wykorzystać do analizy i porównania wyników.

3. Test ran drapanych: inwazja komórek

UWAGA: Instrukcje muszą być dostosowane do każdego typu komórki.

Dzień 1

1. Wysiewanie komórek
   1. Użyj tego samego protokołu do wysiewu komórek, jak opisano w kroku 2.1.

Dzień 2

2. Przygotowanie ECM
   1. Przed użyciem rozmrażać matrycę przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że nie widać żadnych kruszyw. Jeżeli agregaty są widoczne, należy utrzymywać matrycę w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas, aż znikną agregaty. Utrzymuj matrycę na lodzie. Używaj wstępnie schłodzonych końcówek do pipet.
      UWAGA: Matryca zestala się, jeśli nie będzie przechowywana w temperaturze 4 °C.
   2. Schłodzić probówki do mikrowirówek na lodzie przez 5 minut.
   3. Pobrać CM schłodzony do temperatury 4 °C z lodówki i rozcieńczyć matrycę we wstępnie schłodzonych probówkach do mikrowirówek, aby uzyskać końcowe stężenie 300 μg/ml.
   4. Probówki do mikrowirówek z rozcieńczoną matrycą umieścić z powrotem w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Stojak chłodzący przystosowany do probówek do mikrowirówek jest pomocny w utrzymywaniu probówek w temperaturze 4°C przez cały czas trwania eksperymentu.

Dzień 2

3. Test ran drapanych i leczenie ECM
   1. Wyjąć z inkubatora płytkę przygotowaną w kroku 3.1.
   2. Pod maską wykonaj ranę za pomocą komercyjnego urządzenia do nawijania zgodnie z protokołem producenta.
   3. Natychmiast usunąć podłoże z każdej studzienki za pomocą pipety z dostosowaną stożkową końcówką, uważając, aby nie dotknąć rany.
   4. Umyć komórki dwukrotnie, powtarzając procedurę aspiracji i używając 100 μl CM ogrzanego do 37 °C.
   5. Po drugim płukaniu umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 4 °C, aby wyrównać jego temperaturę przez 5 minut.
   6. Usunąć zimne podłoże z każdej studzienki za pomocą pipety aspiracyjnej ze stożkową końcówką, uważając, aby pipetować ostrożnie od krawędzi i nie dotykając rany.
   7. Dodać 50 μl wstępnie rozcieńczonej matrycy do każdego dołka za pomocą wstępnie schłodzonych stożkowych końcówek w temperaturze 4 °C.
   8. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Wstępnie podgrzany stojak w temperaturze 37 °C jest pomocny w przyspieszeniu nagrzewania płytki 96-dołkowej.
   9. Wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 100 μl dostosowanego CM do każdej studzienki, zgodnie ze wskazaniami dla każdego warunku leczenia.
   10. Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków w studzienkach. Pomocna może być w tym przypadku technika odwróconego pipetowania. Alternatywnie usuń bąbelki za pomocą igły strzykawki.
   11. Umieść płytkę w odpowiednim stojaku w mikroskopie wideo.
   12. Aby poprawić jakość obrazu, pozwól płytce ogrzać się przez co najmniej 15 minut przed pierwszym skanowaniem, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na dolnej stronie płytki.
   13. Zaprogramuj harmonogram skanowania, korzystając z oprogramowania mikroskopu wideo na jednym obrazie na studzienkę, w trybie skanowania ran zadrapań. Maksymalny 2-godzinny interwał wymagany dla eksperymentu inwazji i migracji. Jeśli celem eksperymentu jest wyprodukowanie filmu, preferowany jest interwał wynoszący maksymalnie 30 minut.
   14. Pod koniec eksperymentu dokładnie umyj urządzenie do nawijania i postępuj zgodnie z każdym z czterech etapów mycia wskazanych przez producenta.

Dni 3, 4 i 5

4. Analiza inwazji komórek za pomocą wideomikroskopu.
   1. Powtórz krok 2.3.

Przedstawiamy tutaj dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek. Rysunek 1 przedstawia eksperyment z komorą Boydena. Wkładki umieszcza się na płytce towarzyszącej z pożywką chemoatraktantową, a komórki wysiewa się w CM. Membrana może być niepowlekana (test migracji) lub powlekana (test inwazji). Komórki wysiewa się do górnej komory w s-CM. Dolna komora jest wypełniona CM jako chemoatraktantem. Ogniwa są mocowane przed czasem podwojenia.

Rysunek 2 pokazuje błonę Boydena po utrwaleniu komórki. Rysunek 2A pokazuje nieoptymalny wynik, z klastrami komórek na górnej stronie błony. Rysunek 2B pokazuje optymalny wynik z komórkami utrwalonymi i zabarwionymi na niebiesko na membranie.

Rysunek 3 pokazuje optymalny wynik testu na ranę drapaną. Liniową ranę można zobaczyć w Rysunek 3A. W ranie nie obserwuje się żadnych komórek, a gojenie się rany następuje w ciągu 30 godzin. Czas gojenia się rany zależy od linii komórkowej i wynosi od 24 do 50 godzin.

Rysunek 3B to graficzne przedstawienie gojenia się ran w czterech warunkach leczenia: kontrola, ABT-199 (anty-Bcl-2), cetuksymab (anty-EGFR) i ABT-199+cetuksymab. Kombinacja ABT-199 + cetuksymab znacznie zmniejszyła migrację komórek. Krzywe uzyskuje się za pomocą oprogramowania mikroskopu wideo, które zapewnia solidną analizę danych dotyczących migracji komórek w czasie. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD) dla każdego dołka.

Dziewięćdziesiąt procent konfluencji to optymalna gęstość komórek do badania gojenia się ran. Optymalne wysiewanie komórek zależy od linii komórkowej i waha się od 3 x 104 do 6 x 104 komórek. Rysunek 4A pokazuje optymalną gęstość komórek, a Rysunek 4C pokazuje niską gęstość komórek. Studzienki należy myć dwukrotnie, aby uniknąć skupisk komórek, jak pokazano na Rysunek 4B.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie eksperymentu w komorze Boydena. Wkładki umieszcza się na płytce towarzyszącej z pożywką chemoatraktantową, a komórki wysiewa się w CM. Membrana może być niepowlekana (A) lub powlekana (B).

Rysunek 2: Suboptymalne i optymalne wyniki mikroskopowe uzyskane w eksperymencie w komorze Boydena. (A) Suboptymalna błona z klastrami komórek w górnej części błony i niemożliwymi do zinterpretowania wynikami. Podziałka = 300 μm. (B) Optymalna membrana z policzalnymi komórkami w dolnej części membrany zabarwionymi na niebiesko. Podziałka = 300 μm.

Rycina 3: Optymalne wyniki uzyskane w eksperymencie gojenia się ran. (A) Reprezentatywny obraz z testu ran drapanych wykazał gojenie się ran obserwowane po 0, 15 i 30 godzinach. Kryteriami jakości eksperymentu są: rana liniowa, brak fragmentów komórek obserwowanych w ranie i optymalna konfluencja komórek. Podziałka = 300 μm. (B) Graficzne przedstawienie gojenia się ran pokazujące ilościowe określenie parametrów zbiegania komórek rany (w procentach) w zależności od czasu (h). Analizowane są tutaj cztery warunki leczenia, a dane są wyświetlane za pomocą SD.

Rycina 4: Nieoptymalne wyniki uzyskane w eksperymencie gojenia się ran. (A) Idealna gęstość komórek. (B) Problemy z myciem osadu komórkowego. (C) Niska gęstość komórek. Podziałka liniowa = 300 μm

Tabela 1: Zalety i wady eksperymentu z komorą Boydena i próby gojenia ran za pomocą mikroskopu wideo. Zalety i wady eksperymentu z komorą Boydena i testu ran drapanych.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.