Artykuł metodologiczny

Jednoetapowy protokół oceny sposobu klonogennej śmierci komórki wywołanej promieniowaniem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/56338

⸱

23 października 2017

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Gunma University Graduate School of Medicine, 2Advanced Scientific Research Leaders Development Unit, Gunma University Graduate School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. Tutaj opisujemy jednoetapowy test do oceny głównych trybów indukowanej przez IR klonogennej śmierci komórek w oparciu o morfologię jąder barwionych dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) uwidocznionych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad śmiercią komórek wywołaną promieniowaniem jonizującym (IR) są ważne dla zrozumienia wpływu IR na nowotwory złośliwe i normalne tkanki. W tym miejscu opisujemy szybki i opłacalny jednoetapowy test do jednoczesnej oceny głównych trybów klonogennej śmierci komórki indukowanej przez IR, tj. apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek. W tej metodzie komórki hodowane na szkiełku nakrywkowym są naświetlane promieniami rentgenowskimi i barwione dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej identyfikuje się apoptozę, katastrofę mitotyczną i starzenie się komórek na podstawie charakterystycznych morfologii jąder barwionych DAPI. Apoptoza jest determinowana przez obecność ciał apoptotycznych (tj. skondensowanych i rozdrobnionych jąder). Katastrofa mitotyczna jest określana przez obecność jąder, które wykazują dwa lub więcej odrębnych płatów i mikrojąder. Starzenie się komórek zależy od obecności ognisk heterochromatycznych związanych ze starzeniem się (tj. jądrowego DNA zawierającego 30-50 jasnych, gęstych ognisk). Takie podejście pozwala eksperymentatorowi na łatwe badanie przesiewowe pod kątem klonogennych trybów śmierci komórki przy użyciu różnych linii komórkowych, ustawień leczenia i / lub punktów czasowych, w celu wyjaśnienia mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunków będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Promieniowanie jonizujące (IR) indukuje wiele rodzajów klonogennej śmierci komórki. Badania nad klonogenną śmiercią komórek wywołaną przez IR są ważne dla zrozumienia toksyczności IR dla normalnych tkanek, a także dla opracowania metod zwiększających skuteczność leczenia radioterapii nowotworów. Apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek są głównymi sposobami klonogennej śmierci komórki indukowanej przez IR1. Apoptoza to regulowany tryb śmierci komórki, który jest inicjowany przez uszkodzenie DNA1. Katastrofa mitotyczna to śmierć komórki, która następuje z powodu nieprawidłowej mitozy wynikającej z nienaprawionych pęknięć dwuniciowych DNA1. Starzenie się komórek definiuje się jako stan nieodwracalnego zatrzymania wzrostu komórek2; Należy zauważyć, że starzenie się komórek nie jest śmiercią komórki per se, ale jest sposobem klonogennej śmierci komórki, ponieważ znosi klonogenne przeżycie komórki starczej.

Różne testy komórkowe zostały opracowane do indywidualnej oceny apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek. Apoptozę można ocenić za pomocą końcowego barwienia deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), barwienia aneksyny V, testów fragmentacji DNA i oznaczania fazy cyklu komórkowego sub-G1 za pomocą cytometrii przepływowej1. Katastrofę mitotyczną można ocenić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla markerów mitotycznych, w tym MPM2, barwienia TUNEL i mikroskopii elektronowej1. Starzenie się komórek można ocenić za pomocą barwienia związanego ze starzeniem β-galaktozydazy (SA-β-Gal), testów zatrzymania wzrostu i mikroskopii elektronowej1. Co ważne, dominujący tryb klonogennej śmierci komórki różni się w zależności od linii komórkowych i ustawień leczenia3,4. Dlatego, aby wyjaśnić ogólny profil klonogennej śmierci komórek dla danego środowiska eksperymentalnego, należy przeprowadzić wiele testów obejmujących wszystkie te tryby śmierci razem, co jest pracochłonne i kosztowne.

W tym artykule opisujemy szybki i opłacalny, jednoetapowy test do jednoczesnej oceny apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek wywołanego przez IR3,4. W tej metodzie komórki hodowane na szkiełku nakrywkowym są naświetlane promieniami rentgenowskimi i barwione dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek są identyfikowane na podstawie odpowiednich charakterystycznych morfologii jąder barwionych DAPI. Podejście to będzie przydatne w zastosowaniach, w tym w badaniach przesiewowych pod kątem klonogennych profili śmierci komórek w różnych liniach komórkowych, ustawieniach leczenia i punktach czasowych, w celu zbadania mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunkach będących przedmiotem zainteresowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów

  1. Szkiełka nakrywkowe w autoklawie.
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe w szklanej zlewce.
    2. Przykryj szklaną zlewkę folią.
    3. Autoklaw w temperaturze 121 °C przy ciśnieniu 15 psi przez 20 min.
    4. Suszyć w temperaturze 50 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej w okapie hodowlanym.
  2. Przygotuj roztwór utrwalający: 3% paraformaldehydu + 2% sacharozy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    1. Do szklanej butelki o pojemności 1 000 ml dodaj 700 ml PBS i 30 g paraformaldehydu.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest, należy nosić odpowiednie rękawice.
    2. Całkowicie rozpuść paraformaldehyd, ogrzewając go do temperatury 80 °C za pomocą kuchenki mikrofalowej.
      UWAGA: Opary paraformaldehydu są toksyczne, nosić maskę.
    3. Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj 20 g sacharozy.
    5. Dodaj PBS, aby całkowita objętość wynosiła 1 l.
    6. Podwielokrotność w probówkach o pojemności 50 ml. Roztwór utrwalający może być przechowywany przez 3 lata w temperaturze -20 °C lub przez 3 miesiące w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie hodowli komórkowej

UWAGA: Te procedury powinny być wykonywane w kapturze hodowlanym.

  1. Hodowla i pasaż komórek ludzkiego kostniakomięsaka U2OS w celu utrzymania wzrostu logarytmicznego5.
    UWAGA: Inne typy komórek mogą być używane po ustaleniu optymalnej dawki napromieniania.
  2. Przetrzyj skalpel ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Za pomocą skalpela umieścić szkiełko nakrywkowe na szalce do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm (zwanej dalej po prostu "szalką").
    UWAGA: Liczba szkiełek nakrywkowych w jednym naczyniu może być zwiększona zgodnie z planem eksperymentalnym (patrz Dyskusja).
  3. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą.
    UWAGA: W zależności od wybranego typu ogniwa można używać innych nośników.
  4. Wytrzyj kleszcze ręcznikami papierowymi zwilżonymi 70% etanolem. Za pomocą kleszczy delikatnie przytrzymaj środek szkiełka nakrywkowego. Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z naczynia, trzymając się szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Ten krok sprzyja unieruchomieniu szkiełka nakrywkowego na naczyniu.
  5. Odłącz przylegające hodowane komórki za pomocą trypsin5.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia.
    2. Dodaj 1 ml PBS i delikatnie wstrząśnij naczyniem.
    3. Odessać PBS z naczynia.
    4. Dodaj 1 ml trypsyny [0,25 w/v% Trypsyna-1mmol/L EDTA] do naczynia.
    5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
    6. Dodaj 9 ml pożywki hodowlanej do naczynia.
    7. Za pomocą mikropipety o pojemności 1000 μl przygotować zawiesinę jednokomórkową.
  6. Policz komórki5.
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 0,9 ml zawiesiny komórek i 0,1 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
    2. Nanieść 10 μl na hemocytometr.
    3. Zbadaj liczbę niebarwionych (tj. żywych) komórek pod mikroskopem z odwróconymi fazami.
  7. W probówce o pojemności 15 ml przygotować zawiesinę komórek o objętości 3 ml w pożywce hodowlanej o gęstości 0,5 x 105 komórek/mL.
    UWAGA: Gęstość komórek może być modyfikowana zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (patrz Dyskusja).
  8. Delikatnie dodaj 2 ml zawiesiny komórkowej do naczynia.
  9. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .

3. Napromieniowanie

UWAGA: Z promiennikiem rentgenowskim należy obchodzić się ostrożnie, zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Zbadaj komórki pod mikroskopem z odwróconymi fazami. Upewnij się, że komórki są przymocowane do szkiełka nakrywkowego i są żywe.
  2. Naświetlić czaszę promieniami rentgenowskimi 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
  3. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5%CO2,
    UWAGA: Czas inkubacji może być modyfikowany zgodnie z planem eksperymentalnym (patrz Dyskusja).

4. Fiksacja

  1. Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia.
  2. Za pomocą nożyczek odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 1 000 μl w odległości 5 mm od końca.
    UWAGA: Wycięta końcówka pomaga płynnie nałożyć roztwór utrwalający.
  3. Za pomocą odciętej końcówki dodaj 1 ml roztworu utrwalającego (przygotowanego w kroku 1.2) do naczynia z bocznej ścianki naczynia.
    UWAGA: Ten krok jest zależny od czasu i dlatego powinien być wykonywany bez wymiany końcówek mikropipet w przypadku pracy z wieloma próbkami. Nałożenie roztworu utrwalającego bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.
  4. Umieść naczynie w kwadratowym naczyniu do hodowli. Delikatnie potrząśnij kwadratowym naczyniem hodowlanym, aby równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na szkiełku nakrywkowym.
  5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać roztwór utrwalający z naczynia.
  7. Dodaj 2 ml PBS do naczynia z bocznej ścianki naczynia.
    UWAGA: Nałożenie PBS bezpośrednio na dno naczynia może uszkodzić komórki.
  8. Odessać PBS z naczynia.
  9. Powtórz kroki 4.7 i 4.8 dwa razy.
    UWAGA: Naczynie można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C z szkiełkami nakrywkowymi zanurzonymi w 2 ml PBS.

5. Barwienie DAPI

  1. Na szkiełko szkiełkowe nanieść 5 μl 1 μg/ml odczynnika barwiącego DAPI.
    UWAGA: Odczynnik do barwienia DAPI jest stabilny przez 6 miesięcy, jeśli jest przechowywany w sposób chroniony przed światłem w temperaturze -20 °C lub niższej.
  2. Za pomocą skalpela usuń szkiełko nakrywkowe z naczynia.
  3. Odrysuj nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego, dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego ręcznikiem papierowym.
  4. Zamontuj szkiełko nakrywkowe do góry nogami na kropli odczynnika barwiącego DAPI na szkle szkiełkowym, tak aby komórki były wystawione na działanie odczynnika barwiącego DAPI.
    UWAGA: Ten krok jest zależny od czasu. Wysuszenie odczynnika barwiącego DAPI może prowadzić do nieoptymalnego barwienia.
  5. Próbki można przechowywać przez 1 rok w temperaturze -20 °C.

6. Akwizycja obrazu

  1. Zbadaj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Jądra są wizualizowane za pomocą filtra DAPI.
    UWAGA: Można użyć obiektywu olejowego 20X lub 60X, w zależności od zainteresowania badacza. W przypadku korzystania z soczewki olejowej 60X dodaj jedną kroplę oleju na szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby próbki nie dotykały obiektywu; W przeciwnym razie soczewka może zostać uszkodzona.
  2. Pozyskiwanie obrazów jąder za pomocą kamery CCD i oprogramowania do akwizycji obrazów cyfrowych z następującymi ustawieniami i parametrami: filtr DAPI, obrazy jednowarstwowe, wzmocnienie 1X i automatyczna ekspozycja.
  3. Zakończ akwizycję obrazu: Wytrzyj obiektyw 20X ręcznikami papierowymi zwilżonymi środkiem do czyszczenia obiektywów. Wytrzyj soczewkę olejową 60X ręcznikami papierowymi zwilżonymi chloroformem.

7. Ocena trybu klonogennej śmierci komórki

  1. Na losowo wybranych obrazach policz liczbę jąder, które spełniają kryteria apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek, aż całkowita liczba zliczonych jąder osiągnie 300. Wykonaj ten krok w trzech egzemplarzach dla każdego ustawienia eksperymentalnego.
    1. Kryteria apoptozy: obecność ciał apoptotycznych (tj. skondensowanych i rozdrobnionych jąder)6,7.
    2. Kryteria katastrofy mitotycznej: obecność jąder wykazujących dwa lub więcej odrębnych płatów lub mikrojąder8,9,10.
    3. Kryteria starzenia się komórek: obecność ognisk heterochromatycznych związanych ze starzeniem się (SAHF) (tj. jądrowego DNA zawierającego 30-50 jasnych, gęstych ognisk)2,11.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład, komórki ludzkiego kostniakomięsaka U2OS zostały poddane działaniu promieni rentgenowskich 6 Gy, inkubowane przez 72 godziny i poddane testowi barwienia DAPI zgodnie z protokołem. Rysunek 1 pokazuje powiększone obrazy typowych morfologii jądrowych związanych z apoptozą, katastrofą mitotyczną i starzeniem się komórek, uzyskane przy użyciu soczewki olejowej 60×. Patrz kroki 7.1.1-7.1.3 dla charakterystycznych morfologii dla każdego trybu klonogennej śmierci komórki. Rysunek 2 pokazuje obrazy przeglądowe jąder uzyskane przy użyciu soczewki 20X. Naświetlanie promieniami rentgenowskimi 6 Gy często indukowało katastrofę mitotyczną, rzadziej apoptozę, a rzadko starzenie się komórek. W ten sposób badanie w polu o małym powiększeniu pozwala na pierwszy rzut oka uchwycić ogólny obraz profilu śmierci komórki klonogennej w danym środowisku eksperymentalnym. Rysunek 3 przedstawia graficzną reprezentację danych kwantyfikowanych.

figure-results-1
Rycina 1: Powiększone obrazy jąder barwionych DAPI pokazujących typowe morfologie apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek. Komórki U2OS napromieniowano promieniami rentgenowskimi 6 Gy. Po 72 godzinach komórki utrwalono i wybarwiono DAPI. Obrazy jądrowe zostały wykonane przy użyciu obiektywu olejowego 60X. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Obrazy poglądowe jąder komórek poddanych działaniu promieniowania rentgenowskiego wybarwionych DAPI. Komórki U2OS napromieniano promieniami rentgenowskimi 6 Gy lub pozorowano. Po 72 godzinach komórki utrwalono i wybarwiono DAPI. Obrazy jąder uzyskano za pomocą obiektywu 20X. Kręgi, apoptoza; strzały, mitotycznej katastrofy. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Dane ilościowe dotyczące apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek indukowanych w komórkach poddanych działaniu promieni rentgenowskich. Komórki U2OS napromieniano promieniami rentgenowskimi 6 Gy lub pozorowano. Po 72 godzinach komórki utrwalono i wybarwiono DAPI. Obrazy jąder uzyskano za pomocą obiektywu 20X. Z losowych pól oceniono łącznie 300 jąder pod kątem apoptozy (Ap), katastrofy mitotycznej (MC) i starzenia się komórek (Sns). Oceny przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Wyświetlane są wartości średnie, a słupki błędów wskazują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w ramach protokołu są następujące. Po pierwsze, komórki powinny być hodowane na szalce hodowlanej jako monowarstwa, ponieważ przeprowadzenie oceny morfologicznej jąder barwionych DAPI jest trudne dla komórek wielowarstwowych. W tym celu w kroku 2.9 zaleca się ostrożne przeniesienie szalki hodowlanej do inkubatora; Potrząsanie szalką hodowlaną generuje wir zawieszonych komórek, który prowadzi do koncentracji komórek w środku szalki hodowlanej. Ponadto należy unikać nadmiernej konfluencji prowadzącej do powstawania komórek wielowarstwowych. W tym celu, w kroku 2.7, liczba komórek wysianych na szalce hodowlanej może być modyfikowana w oparciu o czas podwojenia populacji i odstęp czasu między napromienianiem a utrwalaniem. Zalecana jest zbieżność około 80 w momencie utrwalenia. Po drugie, szybkość jest ważna w utrwalaniu i barwieniu DAPI (tj. kroki 4 i 5). Niespójność między próbkami w odniesieniu do czasu potrzebnego na te etapy może prowadzić do niejednorodności intensywności sygnału DAPI w jądrach, co zaciemniłoby ocenę morfologiczną.

W kroku 2.2 można zwiększyć liczbę szkiełek nakrywkowych w pojedynczym naczyniu hodowlanym; W naczyniu o średnicy 35 mm można umieścić maksymalnie cztery szkiełka nakrywkowe, a ich liczbę można dodatkowo zwiększyć za pomocą większych naczyń. Umieszczenie wielu szkiełek nakrywkowych w każdej naczyniu hodowlanej umożliwia efektywną ocenę przebiegu w czasie dla danego zabiegu (tj. szkiełka nakrywkowe mogą być pobierane z szalki hodowlanej jeden po drugim w wielu interesujących punktach czasowych).

W kroku 3.2 dawka napromieniowania może być modyfikowana w zależności od zainteresowania badaczy. Zastosowanie stałej dawki do wielu linii komórkowych umożliwia porównanie wrażliwości na każdy tryb klonogennej śmierci komórki wśród linii komórkowych. Z drugiej strony, zastosowanie izoklonogennych dawek przeżycia dla każdej linii komórkowej umożliwia porównanie klonogennych profili śmierci komórkowej między liniami komórkowymi. Izoklonogenną dawkę przeżycia można określić za pomocą testu przeżycia klonogennego12. Wartość D10 , dawka zapewniająca 10% przeżycia klonogennego, jest częstym punktem końcowym dla dawki przeżycia izoklonogennej.

W kroku 3.3 czas od napromieniania do utrwalenia może być modyfikowany w zależności od zainteresowania badaczy; Jest to ważne, ponieważ szczytowy czas apoptozy wywołanej przez podczerwień, katastrofy mitotycznej i starzenia się komórek różni się w zależności od linii komórkowej i leczenia. W tym artykule użyliśmy 72 godzin po napromieniowaniu jako punktu czasowego, który byłby najbardziej przydatny do wstępnego badania przesiewowego profili śmierci komórki klonogennej, w oparciu o wiele badań przeprowadzonych przez naszą grupę i innych opisanych w następujący sposób: 1,2,3,4,8,9: (i) Apoptoza wywołana promieniowaniem rentgenowskim w komórkach powstałych z guzów litych występuje najczęściej kilka dni po napromieniowaniu. (ii) Katastrofa mitotyczna wywołana promieniowaniem rentgenowskim w komórkach nowotworowych występuje najbardziej widocznie podczas drugiej lub trzeciej mitozy po uwolnieniu z tymczasowego zatrzymania cyklu komórkowego wywołanego napromieniowaniem. Uwolnienie następuje zwykle około 24 godziny po napromieniowaniu, po czym następują powtarzające się mitozy w odstępach około 24 godzin. (iii) Starzenie się komórek wywołane promieniowaniem rentgenowskim staje się widoczne po przerwie zależnej od danej linii komórkowej: 2 dni po napromieniowaniu dla niektórych wczesnych przypadków i 7 dni po napromieniowaniu dla większości linii komórkowych. Po uzyskaniu ogólnego obrazu profili śmierci komórki klonogennej na podstawie wstępnego badania przesiewowego, eksperymenty w czasie dostarczą bardziej szczegółowego wyjaśnienia czasu szczytu dla każdego trybu klonogennej śmierci komórki w określonej linii komórkowej i/lub stanie będącym przedmiotem zainteresowania4.

Należy zauważyć, że test barwienia DAPI i test przeżycia klonogennego, złota metoda oceny wrażliwości na promieniowanie, nie są wymienne. Apoptoza i katastrofa mitotyczna trwają tylko przez wiele godzin. W ten sposób test barwienia DAPI dla danego punktu czasowego wykrywa apoptozę i katastrofę mitotyczną, która występuje w momencie oceny. Z drugiej strony, wyniki testu przeżycia klonogennego w danym punkcie czasowym obejmują całkowitą ilość apoptozy i katastrofy mitotycznej, które wystąpiły w okresie inkubacji przez zwykle 10 - 14 dni po napromieniowaniu. W odróżnieniu od apoptozy i katastrofy mitotycznej, komórki starcze pozostają na szalce hodowlanej; Gromadzą się one stopniowo w czasie po napromieniowaniu. W związku z tym wyniki zarówno testu barwienia DAPI, jak i testu przeżycia klonogennego odzwierciedlają całkowitą ilość starzenia się, które wystąpiło w okresie inkubacji. Co ważne, proporcje apoptozy, katastrofy mitotycznej i starzenia się wywołanego napromieniowaniem różnią się znacznie w zależności od linii komórkowej i dawki napromieniowania. Teoretycznie wyniki jednego testu nie mogą być bezpośrednio przełożone na wyniki drugiego testu.

Test barwienia DAPI ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, pozostaje kwestią sporną, czy katastrofa mitotyczna jest odrębnym sposobem śmierci komórki. W dziedzinie biologii radiacyjnej katastrofa mitotyczna jest uważana za główny sposób śmierci komórki wywołanej podczerwienią, który różni się od innych mechanizmów klonogennej śmierci komórki1. Z drugiej strony inni twierdzą, że katastrofa mitotyczna nie jest odrębnym sposobem śmierci komórki, ale raczej procesem, który poprzedza śmierć komórki, w tym apoptozą i nekrozą13,14. Tak więc apoptoza i katastrofa mitotyczna mogą się w pewnym stopniu pokrywać. Po drugie, wcześniejsze badania sugerują, że starzenie się komórek może wystąpić przy braku SAHF w niektórych liniach komórkowych i warunkach leczenia2. Obecnie należy stosować inne testy zaprojektowane specjalnie dla każdego trybu klonogennej śmierci komórki, aby zwiększyć solidność wniosków z danego eksperymentu. Po trzecie, test barwienia DAPI nie może ocenić sposobów klonogennej śmierci komórki innych niż apoptoza, katastrofa mitotyczna i starzenie się komórek (np. martwica i autofagia). Po czwarte, użyteczność testu barwienia DAPI jako predyktora odpowiedzi guza na radioterapię nie została wyjaśniona w klinice. Z tego punktu widzenia test przeżycia klonogennego, który ocenia całkowitą ilość śmierci komórki klonogennej, jest lepszy niż test barwienia DAPI, ponieważ ustalono korelację między SF2, przeżywającą frakcją komórek napromieniowanych promieniami rentgenowskimi 2 Gy, a odpowiedzią guza na radioterapię15. Niemniej jednak warto zauważyć, że test przeżycia klonogennego nie jest szeroko stosowany w klinice, głównie ze względu na wymóg wysokiego stopnia wiedzy specjalistycznej i długiego okresu czasu (tj. 14 dni) na pozyskanie danych. Dla porównania, procedura barwienia DAPI jest prostsza i zajmuje znacznie mniej czasu, około 3-4 dni, aby uzyskać wyniki. Przydatność testu barwienia DAPI jako predyktora odpowiedzi guza na radioterapię zostanie przetestowana w klinice w najbliższej przyszłości.

Podsumowując, test barwienia DAPI jest opłacalnym jednoetapowym testem do jednoczesnej oceny trzech głównych trybów klonogennej śmierci komórki wywołanej przez podczerwień. Takie podejście pozwala na łatwe badanie przesiewowe trybów klonogennej śmierci komórki dla różnych linii komórkowych, ustawień leczenia i punktów czasowych, w celu wyjaśnienia mechanizmów śmierci komórki w komórkach docelowych i warunków będących przedmiotem zainteresowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pani Akiko Shibata za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii na programy dla wiodących szkół podyplomowych, kultywujących światowych liderów w terapii ciężkimi jonami i inżynierii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
szkiełko nakrywkoweMatsunamiC013001
paraformaldehydSigma-AldrichP6148-1KG
sacharozaSigma-Aldrich84097-250G
sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCosmo Bio16232000
skalpelKai MedicalNo.20, 520-A
35 mm naczynie do hodowli komórkowychFalcon
trypsynaWako201-16945
odwróconymi fazamiShimazu114-909
promiennik rentgenowskiFaxitron BiopticsFaxitron RX-650
Szkło szkiełkowe
Cell Signaling8961S
NikonECLIPSE Ni
fluorescencyjny Filtr DAPINikonU-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
soczewka mikroskopu fluorescencyjnego (20 razy;)NikonPlan Apo λ 20X/0.75
obiektyw mikroskopu fluorescencyjnego (60& razy;, olej)NikonPlan Apo λ 60X/1.40 olej
OlympusN5218600
cyfrowej akwizycji obrazuDS-Qi2
OlympusOT0552
chloroformWako035-02616
353001 mikroskop z Kwadratowe naczynie hodowlane Odczynnik do barwienia DAPI Matsunami Pro-11 Mikroskop fluorescencyjny mikroskop Aparat CCD Oprogramowanie do Nikon Nikon NIS-Elements Środek do czyszczenia obiektywów dokumentów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588(2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121(2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950(2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie DAPIdetekcja apoptozykatastrofa mitotycznastarzenie kom rkowepromieniowanie jonizuj cerodzaje mierci kom rkowejanaliza morfologii j dra kom rkowegotest kolonogenny

Powiązane artykuły