Ten artykuł przedstawia zestaw technik w mikroskopii świetlnej i elektronowej do badania wewnętrznej i zewnętrznej anatomii oka owadów. Obejmują one kilka tradycyjnych technik zoptymalizowanych pod kątem pracy z oczami mrówek, szczegółowe rozwiązywanie problemów oraz sugestie dotyczące optymalizacji dla różnych okazów i regionów zainteresowania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Techniki badania anatomii układu wzrokowego mrówek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten artykuł przedstawia zestaw technik w mikroskopii świetlnej (LM) i mikroskopii elektronowej (EM), które mogą być używane do badania wewnętrznej i zewnętrznej anatomii oka owadów. Należą do nich tradycyjne techniki histologiczne zoptymalizowane pod kątem pracy na oczach mrówek i przystosowane do współpracy z innymi technikami, takimi jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM). Techniki te, choć bardzo przydatne, mogą być trudne dla początkującego mikroskopisty, dlatego w tym artykule położono duży nacisk na rozwiązywanie problemów i optymalizację dla różnych próbek. Udzielamy informacji na temat technik obrazowania dla całej próbki (fotomikroskopia i SEM) oraz omawiamy ich zalety i wady. Zwracamy uwagę na technikę stosowaną do określania średnic soczewek dla całego oka i omawiamy nowe techniki poprawy. Na koniec omawiamy techniki związane z przygotowaniem próbek do LM i TEM, cięciem, barwieniem i obrazowaniem tych próbek. Omawiamy przeszkody, które można napotkać podczas przygotowywania próbek i jak najlepiej je obejść.
Wprowadzenie
Widzenie jest ważną modalnością sensoryczną dla większości zwierząt. Wizja jest szczególnie istotna w kontekście nawigacji do wskazywania celów, wyznaczania i przestrzegania tras oraz uzyskiwania informacji o kompasie1,2. Owady wykrywają informacje wizualne za pomocą pary oczu złożonych, a w niektórych przypadkach od jednego do trzech prostych oczu umieszczonych na grzbiecie, zwanych ocelli3,4,5.
Oczy mrówek są szczególnie interesujące, ponieważ, choć mrówki są cudownie różnorodne, zachowują pewne kluczowe cechy różnych gatunków. Pomimo dramatycznych różnic w anatomii, wielkości i ekologii, zdecydowana większość gatunków jest eusocjalna i żyje w koloniach; W rezultacie różne gatunki stoją przed podobnymi wyzwaniami wizualnymi w zakresie nawigowania tam i z powrotem między centralnym miejscem a zasobami. U mrówek ten sam podstawowy bauplan oka można zaobserwować u zwierząt o długości ciała od 0,5 do 26 mm, od gatunków żyjących wyłącznie w ciągu dnia do wyłącznie nocnych, od wolno chodzących pod ziemią do skaczących drapieżników wizualnych6,7,8,9,10. Wszystkie te zdumiewające różnice w ekologii i zachowaniu powodują niezliczone permutacje tych samych podstawowych struktur oczu, aby dopasować się do różnych środowisk, stylów życia i rozmiarów ciała11,12. W związku z tym badanie wizualnej ekologii mrówek stanowi prawdziwą skarbnicę możliwości dla zdeterminowanego badacza.
Zrozumienie systemu wzrokowego owadów jest niezbędne do uzyskania wglądu w ich możliwości behawioralne. Wynika to z badań integracyjnych, które zgrabnie łączą anatomię z ekologią i zachowaniem z dużym sukcesem w kilku grupach owadów (np. referencje13,14,15,16,17). Chociaż dziedzina nawigacji mrówek i ich zachowań w ogóle odniosła spory sukces, bardzo mały nacisk położono na widzenie mrówek poza kilkoma wybranymi gatunkami. W tym miejscu omówimy techniki związane z badaniem budowy oczu mrówek. Chociaż skupimy się na mrówkach, techniki te można zastosować, z niewielkimi modyfikacjami, również do innych owadów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
UWAGA: Konieczne jest najpierw zrozumienie względnego położenia złożonego oka i oczu względem siebie nawzajem i na głowie. Można to osiągnąć, uzyskując obrazy grzbietowego widoku głowy. W tym celu zalecamy przetwarzanie próbek do mikrofotografii lub przy użyciu technik SEM. Poniżej znajdują się kroki związane z obydwoma procesami.
- Pobieranie próbek
- Zbieraj i przechowuj próbki bezpośrednio w 70% etanolu. Zbieraj różne kasty, gdy tylko jest to możliwe.
- Oznacz okazy czasem, datą i miejscem, a także wszelkimi innymi istotnymi obserwacjami (np. zebrane podczas żerowania, agregacja godowa, gniazdo wewnątrz gałązki itp.)
- Zbierz wystarczającą liczbę próbek, aby uzyskać wiele powtórzeń w każdym zabiegu.
- Mikrografia fotograficzna i układanie w stosy Z
- Wysuszyć próbki na powietrzu i zamontować je na trójkątnych kartach punktowych za pomocą kleju rozpuszczalnego w wodzie, a następnie na szpilce do owadów. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz reference18.
- Obraz wykonany za pomocą mikroskopu stereoskopowego o dużym powiększeniu z silnikiem krokowym Z i kolorową kamerą.
- Użyj dyfuzora, aby uzyskać równomierne oświetlenie próbek.
- Przechwytuj obrazy w różnych płaszczyznach ogniskowych i zapisuj obrazy w bezstratnym formacie pliku (takim jak tiff) i ustawiaj je na ostrości za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.
- Skaningowe mikrofotografie elektronowe
UWAGA: Dokładnie wyczyść wszystkie narzędzia i powierzchnie robocze etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki kurzem i innymi cząstkami.- Odwodnić próbki w etanolu przez noc i wysuszyć na powietrzu na szalce Petriego.
- Użyj ostrej żyletki, aby oddzielić głowę od reszty ciała.
- Zamontuj głowę pod wymaganym kątem view (np. grzbietowo do góry) na aluminiowych króćcach za pomocą przewodzącej taśmy węglowej lub wypustek. Pokrój taśmę węglową na cienkie paski i złóż ją, aby podeprzeć torebkę głowy.
- Za pomocą napylarki napylającej nanosić złoto na powierzchnię próbki przez 2 minuty przy 20 mA za pomocą stolika obrotowego. Czas i prąd mogą wymagać regulacji w zależności od instrumentu.
- Przenieś próbki do nowego aluminiowego króćca za pomocą świeżej taśmy węglowej lub zakładek.
UWAGA: Niepowlekany węgiel zapewni czarne tło, ale przenoszenie próbek może uszkodzić złotą powłokę. - Sprawdź, czy orientacja próbki jest nadal prawidłowa za pomocą mikroskopu preparacyjnego i wyreguluj w razie potrzeby za pomocą cienkich kleszczy lub podobnego narzędzia. Uważaj, aby nie zarysować złotej powłoki; obchodź się tak mało, jak to możliwe.
- Załaduj próbki do uchwytu króćca SEM, zwracając uwagę na położenie króćców i próbek względem siebie.
UWAGA: Niektóre SEM są wyposażone w kamerę sceniczną, ale wiele z nich nie jest i zlokalizowanie małych okazów przy dużym powiększeniu może być trudne. - Zobrazuj próbki. Użyj niskiego napięcia przyspieszającego, aby uniknąć ładowania, i małej przysłony, aby uzyskać dobrą głębię ostrości.
UWAGA: Ustawienia najlepiej zoptymalizować w porozumieniu z technikiem specjalizującym się w konkretnym używanym instrumencie.
2. Kwantyfikacja liczb i średnic fasetek
- Repliki rogówki
- W tym celu należy użyć mrówek zakonserwowanych w etanolu lub zamontowanych na szpilce (krok 1.1.1).
- Zamontuj zwierzę na szpilce do owadów lub na plastelinie. Jeśli głowa jest stosunkowo duża, pozostałe części ciała można usunąć.
- Użyj szpilki do owadów lub cienkiej wykałaczki, aby zebrać małą kroplę szybkoschnącego bezbarwnego lakieru do paznokci i szybko rozprowadź go na oku. Upewnij się, że szpilka nie rysuje oka. Lakier do paznokci powinien pokrywać całe oko i część otaczającej go torebki głowy.
UWAGA: Ważne jest, aby lakier do paznokci miał w miarę jednolitą grubość w poprzek oka. - Pozostaw lakier do paznokci do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.
- Po całkowitym ustawieniu użyj cienkiej szpilki przeciw owadom, aby delikatnie podnieść replikę z kapsuły na głowę otaczającej oko.
- Użyj cienkiej pary czystych kleszczy, aby podnieść replikę, chwyć część repliki, która zakrywa głowę, a nie oko.
- Upewnij się, że masz świadomość orientacji oka: przedniego, tylnego, grzbietowego i brzusznego obszaru.
- Umieść replikę na szklanym szkiełku. Użyj żyletki, aby przyciąć replikę, ostrożnie usuwając nadmiar materiału wokół oka. Użyj igły lub kleszczy, aby zapobiec przesuwaniu się repliki.
- Jeśli oko jest bardzo wypukłe, użyj żyletki, aby wykonać 3-4 drobne częściowe promieniste nacięcia wokół krawędzi, aby pomóc "spłaszczyć" replikę. Jeśli oko jest w miarę "płaskie", nie ma potrzeby wykonywania takich nacięć.
- Delikatnie przyłóż szkiełko nakrywkowe do repliki oka, upewniając się, że orientacja repliki jest znana. Nie wywieraj nacisku, ponieważ może to wyeliminować odcisk rogówki na lakierze do paznokci.
- Uszczelnij szkiełko nakrywkowe, używając bardzo małej ilości lakieru do paznokci w czterech rogach. Jeśli lakier do paznokci przepłynie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkami, uszkodzi replikę.
- Zobrazuj szkiełko pod mikroskopem złożonym.
UWAGA: Jeśli tylko niektóre fasety są ostre, oznacza to, że replika oka nie jest wystarczająco spłaszczona. Odrzuć i zacznij od nowego kroku 2.1.3. - Zaimportuj obraz do swobodnie dostępnych programów, takich jak ImageJ/Fiji, gdzie można zmierzyć liczbę ommatidia i rozmiar każdej ommatidia.
UWAGA: Tę metodę można również wykorzystać do przygotowania replik ocelli. Ponieważ jest to pojedyncza soczewka, zalecamy trzymanie wszystkich oczek razem w jednej replice.
3. Analiza struktury oka
UWAGA: Studiowanie anatomii oka wymaga w większości przypadków dwóch uzupełniających się technik LM i TEM. Początkowe etapy przetwarzania wymagają podobnych technik zarówno dla LM, jak i TEM. Różnica pojawia się już na etapie przekroju. Przetwarzanie próbek wymaga użycia niebezpiecznych substancji chemicznych, z którymi należy obchodzić się ostrożnie i usuwać w sposób odpowiedzialny. Stosować środki ochrony osobistej, pracować pod wyciągiem, zawsze czytać karty charakterystyki (SDS) i przeprowadzać ocenę ryzyka przed rozpoczęciem.
- Rozwarstwienie
- Próbki należy znieczulać przez chłodzenie lub narażenie na działanie gazowego CO2 .
- Znieczulenie CO2 jest bardzo szybkie (zwykle poniżej 1 minuty) i należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, ponieważ może to spowodować śmierć próbki. W przypadku używania granulek suchego lodu (stały CO2 ) należy unikać bezpośredniego kontaktu z próbkami, ponieważ może to spowodować oparzenia zimnem.
- Znieczulenie na zimno jest wolniejsze; wystarczy 4 °C, a niższe temperatury nie są zalecane. Ustalić odpowiedni czas schładzania dla danego gatunku. Duże lub odporne na zimno mrówki, takie jak mrówki byki, mogą potrzebować >10 minut, aby w pełni się unieruchomić, podczas gdy mniejsze gatunki mogą potrzebować tylko 1-2 minut. Nadmierne chłodzenie zabije próbkę (unikaj bezpośredniego kontaktu z lodem). Próbki najlepiej przechowywać w małych, plastikowych pojemnikach z piankowym korkiem i umieszczać w zamrażalniku, w którym można je obserwować, a nie w elektrycznej lodówce lub zamrażarce.
- Umieść próbkę na szalce Petriego i dostosuj do oglądania pod mikroskopem preparacyjnym. Szybka praca jest ważna, aby zachować znieczulenie i uniknąć zwyrodnienia tkanki po wykonaniu nacięć (może to nastąpić w ciągu kilku sekund).
- Usuń czułki za pomocą kleszczy. W przypadku pracy z żądlącym owadem zaleca się najpierw amputację gaster, aby uniknąć użądlenia.
- Usuń części ustne za pomocą ostrej żyletki; do przytrzymania próbki można użyć kleszczy. Przeciąć przednią część oka (duże próbki) lub jak najbliżej oczu (małe próbki) bez szarpania mózgu, ponieważ może to spowodować wyrwanie siatkówki.
- Przygotować się do otwarcia kapsuły na głowę. Ustawić próbkę pod takim kątem, aby pierwsze nacięcie było skierowane do góry; Można to zrobić zarówno pod mikroskopem preparacyjnym, trzymając próbkę w kleszczach, jak i pod kontrolą wzrokową, trzymając próbkę między kciukiem a palcem wskazującym.
- Wykonaj poprzeczne nacięcie przez głowę, aby usunąć brzuszną część głowy; część brzusznego oka może zostać usunięta u dużych gatunków, aby poprawić utrwalenie i infiltrację. W tym momencie głowa powinna być nadal przymocowana do ciała.
- Odetnij torebkę głowy od ciała, wykonując nacięcie koronalne tuż za okiem złożonym.
- Umieść wypreparowaną kapsułkę głowy z oczami złożonymi w lodowatym utrwalaczu: 2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (pH 7,2-7,5).
Uwaga: Utrwalacz jest i toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę i pracować pod wyciągiem.
UWAGA: Ważne jest, aby działać szybko, aby zatrzymać zwyrodnienie tkanki nerwowej. Sekcja powinna zostać zakończona w ciągu 2 minut lub krócej (skuteczna sekcja może wymagać pewnej wprawy).
UWAGA: Jeśli oko musi być przystosowane do jasnych lub ciemnych warunków, najpierw wystaw zwierzęta na działanie wymaganych warunków oświetleniowych przez kilka godzin. Przeprowadzaj sekcje w odpowiednich warunkach oświetleniowych. Sekcje można przeprowadzać przy czerwonych światłach, aby symulować ciemność.
- Próbki należy znieczulać przez chłodzenie lub narażenie na działanie gazowego CO2 .
- Przetwarzanie próbek
- Przechowywać próbki w utrwalaczu w temperaturze pokojowej z ruchem na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny. Duże próbki mogą wymagać dłuższego czasu utrwalania.
- Usunąć utrwalacz i odpowiednio go zutylizować. Próbki umyć w buforze fosforanowym o temperaturze pokojowej (3 razy po 5 minut) na wytrząsarce.
UWAGA: Bufor fosforanowy składa się z 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,244 g KH2PO4 w 1 L destylowanego H2O (pH 7,2). - Usunąć bufor fosforanowy i dodać 2% OsO4. Umieść słoik z próbką na wytrząsarce w dygestorium na 1-2 godziny. Jest to etap po utrwaleniu, który ma na celu utrwalenie tłuszczów, a także zapewnienie kontrastu dla TEM.
UWAGA: Czas wiązania osmu zależy od wielkości próbki; Jako ogólną zasadę należy obliczyć 1 godzinę utrwalenia na 1 mm3. - Usuń roztwór osmu i zutylizuj go w odpowiedni sposób. Umyj próbki w buforze o temperaturze pokojowej (3 razy po 5 minut) na wytrząsarce.
- Odwodnić próbki, umieszczając je w rosnących stężeniach etanolu lub acetonu, na przykład 50, 70, 80 i 95% na 10 minut każda, a na koniec 100% (2 razy po 15 minut). Umieścić próbki na wytrząsarce między zmianami roztworu.
UWAGA: W razie potrzeby próbki można przechowywać przez noc w 70% etanolu. - Odcedź etanol i dodaj 100% acetonu. Pozostaw na 20 minut na shakerze (pomiń ten krok, jeśli suszysz go w acetonie). Zastąp świeżym acetonem i pozostaw na dodatkowe 20 minut.
- Naciekać tkanki żywicą przy użyciu następujących proporcji acetonu do żywicy: 2:1 (3 h), 1:1 (przez noc), 1:2 (4 h) i czysta żywica (przez noc). Na każdym etapie pozostawiaj próbki na wytrząsarce wewnątrz dygestoria i zakrywaj pojemnik na wszystkie kroki z wyjątkiem dwóch.
UWAGA: Żywica jest zbyt lepka, aby można ją było osuszyć, dlatego próbki należy na każdym etapie przenosić do nowego jednorazowego pojemnika. - Przygotuj bloki do zamontowania próbek. Bloki można wykonać na zamówienie, przecinając szkło akrylowe na małe prostokątne bloki (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Bloki można również wykonać, wlewając żywicę epoksydową (dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów) do formy silikonowej, a następnie utwardzając ją w piecu przez 12-14 godzin w temperaturze 60 °C.
Uwaga: Nieutwardzona (płynna) żywica jest rakotwórcza i należy ją włożyć z powrotem do pieca do całkowitego stwardnienia. - Umieść blok pionowo w formie. Ostrożnie wyjmij próbki z płynnej żywicy, pozwól nadmiarowi żywicy spłynąć i umieść próbkę na wierzchu bloku. Do związania próbki z blokiem można użyć niewielkiej ilości dodatkowej żywicy.
- Oznacz blok. Wydrukuj papierowe etykiety i osadź je w bloku lub przymocuj do powierzchni bloku.
- Formę z osadzonymi klockami przechowywać w piekarniku przez 12-14 godzin w temperaturze 60 °C.
- Przechowuj blok próbki w czystej kopercie. Mogą one być przechowywane w ten sposób przez kilka miesięcy lub lat.
- Zużyte pojemniki, brudne rękawice i inny zanieczyszczony sprzęt należy pozostawić w dygestorio, aby aceton całkowicie odparował (minimum 12 godzin).
- Utwardź żywicę w piekarniku przed wyrzuceniem jednorazowego sprzętu lub zeskrobaniem żywicy z innych przedmiotów, takich jak kleszcze.
- Cięcia
- Obserwuj blok pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że orientacja próbki jest odpowiednia dla płaszczyzny cięcia.
- Jeśli orientacja nie jest odpowiednia, użyj piły jubilerskiej, aby wyciąć próbkę i ponownie zorientować ją przy użyciu fragmentów żywicy i świeżej żywicy, aby ponownie osadzić próbkę. Głowę można również podzielić na dwie połowy, aby oddzielnie podzielić oba oczy. Ponownie utwardź żywicę przed kontynuowaniem.
- Zamontuj blok na wyjmowanym uchwycie mikrotomowym. Wyjmij uchwyt i umieść na uchwycie.
- Przyciąć blok żywicy za pomocą żyletki pod mikroskopem preparacyjnym.
Ostrzeżenie: Nie rób tego, gdy uchwyt jest zamontowany na ramieniu mikrotomu, ponieważ może to wstrząsnąć ramieniem i uszkodzić łożyska. - Ponownie zamontuj uchwyt na ramieniu mikrotomu i ustaw próbkę pod kątem.
- Zamontuj nóż na uchwycie pod odpowiednim kątem (0° dla noży szklanych, patrz instrukcja producenta dla noży diamentowych).
UWAGA: Noże szklane można tanio wykonać za pomocą nożownika do szkła, ale należy je okresowo wymieniać, ponieważ tracą krawędź; Można kupić wysokiej jakości noże diamentowe, ale są drogie, wymagają specjalnej pielęgnacji i nie są odpowiednie dla początkujących. - Napełnij łódkę z nożem wodą destylowaną za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr (wielkość porów 0,45 μm).
- Napełnij łódź, aż poziom wody osiągnie krawędź noża; łąkotka może być wypukła w innych obszarach łodzi.
- Opróżnij łódź, aż łąkotka będzie bardzo lekko wklęsła, ale nadal sięga krawędzi noża. Poziom wody można regulować w dowolnym punkcie, ale zawsze z dala od krawędzi noża.
- Ostrożnie przyłóż nóż do próbki i wyrównaj blok z nożem. Najlepiej robić to powoli, okresowo sprawdzając bliskość noża przez okular i z boku.
UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi instrumentu, aby uzyskać szczegółowe instrukcje, ponieważ instrumenty się różnią. - Ustaw grubość przekroju na mikrotomie. Wybór odpowiedniej grubości będzie zależał od wielkości próbki, obszaru zainteresowania i rodzaju używanego noża.
- Jeśli używasz noża do szkła, wybierz wyższe ustawienie (np. 4 μm), jeśli trzeba odciąć dużo materiału przed dotarciem do obszaru zainteresowania. Jeśli używany jest nóż diamentowy lub jeśli próbka jest bardzo mała, 1-2 μm może być bardziej odpowiednie.
- Rozpocznij "cięcie" (obracanie kołem mikrotomowym), gdy nóż jest blisko, ale jeszcze nie wcina się w próbkę, aby wykonać ostatnią część podejścia. Sekcje powinny zacząć pojawiać się w ciągu kilku rotacji; Jeśli nie, zatrzymaj się i bardzo ostrożnie przysuń nóż nieco bliżej.
- Dostosuj grubość zbierania sekcji (1 μm dla odcinków półcienkich), zbliżając się do obszaru zainteresowania.
- Zbierz dowolne skrawki za pomocą narzędzia do rzęs.
UWAGA: Narzędzia do rzęs można wykonać za pomocą rzęsy osadzonej na cienkim patyczku z lakierem do paznokci. - Jeśli konieczne jest usunięcie dużej ilości materiału, pozwól sekcjom się nagromadzić i usuń je masowo, wyjmując nóż i spłukując go wodą. Jeśli używasz noża szklanego, może to być odpowiedni moment na wymianę noża na nową lub na nowy nóż.
- Umieść serię małych kropelek wody destylowanej na szkiełku za pomocą pipety Pasteura lub najlepiej strzykawki wyposażonej w filtr .
- Ostrożnie spuść zebraną część rzęsy na kroplę wody.
- Zbieraj takie sekcje, dopóki nie będzie to właściwe, aby sprawdzić głębokość przekroju.
UWAGA: Chociaż może to być żmudne, zawsze najlepiej jest często sprawdzać. - Umieść szkiełko na płycie grzejnej ustawionej na 60 °C. Poczekaj, aż cała woda odparuje, a sekcja przylgnie do szkiełka.
- Barwnik skrawków błękitem toluidynowym przez 10-60 s (czas barwienia będzie się różnić w zależności od grubości sekcji). Dozuj barwnik za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr (jak wyżej).
- Umieść kroplę barwnika na jednym końcu szkiełka i rozprowadź ją za pomocą boku igły, nie dotykając ani nie skrobając sekcji. Umieść szkiełko na płycie grzejnej na około 10-20 sekund.
- Opłucz szkiełko, spryskując je wodą destylowaną w butelce do mycia i umieść na płycie grzejnej, aby wysuszyć.
- Sprawdź je pod mikroskopem złożonym i zobrazuj.
- Powtarzaj, aż zostanie osiągnięty obszar zainteresowania.
- W przypadku ultracienkich przekrojów: ustawić grubość cięcia w zakresie 40-60 nm, aby zebrać sekcje TEM.
- Wytnij około 3-5 odcinków i sprawdź grubość za pomocą wzornika kolorów interferencji. Sekcje powinny odbijać się na jasnoszaro, gdy są oglądane pod kątem.
UWAGA: Opary chloroformu można pipetować na odcinki, aby rozluźnić wszelkie zagniecenia. Jest to najbardziej istotne dla doświadczonych użytkowników, a początkujący nie muszą się martwić. Zbyt duża ilość chloroformu uwolniona zbyt blisko sekcji może uszkodzić sekcje. - Podnieś pokrytą Formvarem, miedzianą, szczelinową siatkę przytrzymywaną kleszczami stroną z Formvar do góry. Uważaj, aby nie przebić powłoki Formvar.
- Zanurz siatkę w krawędziach łodzi i z dala od sekcji, a następnie podnieś siatkę równolegle do powierzchni pod sekcjami. W razie potrzeby użyj rzęsy, aby poprowadzić sekcje po siatce.
- Ostrożnie przetrzyj końcówkę kleszczy bibułą filtracyjną, aby wchłonąć wodę uwięzioną między ramionami. Jeśli nie zostanie to zrobione, napięcie wody może podciągnąć siatkę między ramionami lub sprawić, że przyklei się na jedną stronę. Może to spowodować zanieczyszczenie lub uszkodzenia mechaniczne .
- Ostrożnie usuń nadmiar wody z samej siatki, ustawiając kratkę krawędziami na bibule filtracyjnej.
- Umieść siatkę w uchwycie siatki.
- Powtarzaj, aż zostanie zebrana wystarczająca liczba sekcji.
- Przekroje półcienkie można obrazować bezpośrednio za pomocą dowolnego mikroskopu złożonego wyposażonego w kamerę. Olejek immersyjny można nakładać bezpośrednio na sekcje. Preparaty należy przechowywać w pudełku na slajdy, aby zapobiec przebarwieniom.
- Ultracienki przekrój barwienia dla kontrastu TEM
UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać pod przykryciem, ponieważ barwniki są lekkie i wrażliwe na CO2 . Ponadto barwniki EM wykorzystują metale ciężkie do wytwarzania kontrastu i dlatego są substancjami niebezpiecznymi. Należy zachować odpowiednią ostrożność podczas obchodzenia się z tymi plamami.- Przykryj kilka dużych szalek Petriego folią aluminiową, aby zablokować światło. Pracuj zgodnie z nimi, aby wykonać następujące kroki. Częściowo je odsłoń, aby zapewnić przestrzeń roboczą, ale jak najszybciej załóż pokrowce z powrotem.
- Wytnij kawałek filmu woskowego i ostrożnie umieść na nim pięć kropelek 6% nasyconego octanu uranylu za pomocą pipety Pasteura.
- Aby przygotować roztwór, zmieszaj 2 g octanu uranylu ze 100 ml 50% metanolu w wodzie destylowanej i przefiltruj roztwór przed użyciem. Roztwór nie może być przechowywany i powinien być za każdym razem świeży19.
- Ostrożnie podnieś siatki TEM za pomocą kleszczy i balansuj na kropelkach barwnika sekcją do dołu. Pozostaw na 25 min.
- Opłucz kratki pojedynczo, szybko zanurzając je w wodzie destylowanej; przejdź przez cztery różne fiolki z wodą destylowaną.
- Umieść pięć kropel cytrynianu ołowiu na świeżym kawałku folii. Ułóż kilka granulek NaOH wokół kropelek barwnika (pochłania to atmosferyczny CO2, aby zapobiec wytrącaniu się węglanu ołowiu).
- Aby przygotować roztwór cytrynianu ołowiu, przygotuj wodę dwudestylowaną, gotując wodę destylowaną przez 0,5 godziny. Pozwól wodzie ostygnąć i w zamykanym pojemniku dodaj 0,3 g cytrynianu ołowiu do 100 ml wody destylowanej. Dodać 1 ml 10 M NaOH, szczelnie zamknąć pojemnik i wstrząsać aż do rozpuszczenia19.
- Umieścić kratki na kroplach barwnika zgodnie z opisem w ppkt 4.3 i przykryć. Bejcować przez 5 min.
- Opłucz w wodzie destylowanej tak jak poprzednio, zanurzając kratki w wodzie destylowanej i wyjmując ją 20 razy. Przechodź przez trzy naczynia z wodą destylowaną.
- Wchłoń nadmiar wody bibułą filtracyjną i pozostaw kratki do wyschnięcia w pudełku z kratką.
- Obraz w TEM przy niskim napięciu przyspieszającym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisane tutaj metody umożliwiają szczegółowe badanie oczu prostych i złożonych mrówek. Obrazowanie widoku grzbietowego głowy z wykorzystaniem technik fotomikrografii Z-stack pozwala na uzyskanie ogólnego przeglądu układu systemu wizualnego (Rysunek 1). Stanowi to dobre przygotowanie do sekcji oraz pozwala określić wymagany kąt cięcia. Technika ta jest również przydatna do wykonywania pomiarów, takich jak szerokość głowy, długość oka oraz średnice soczewek oce...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej zestaw metod pozwala na skuteczne badanie układu optycznego mrówek i innych owadów. Techniki te informują nas o rozdzielczości próbkowania, czułości optycznej i potencjalnej czułości polaryzacji badanego oka. Wiedza ta stanowi ważną podstawę do fizjologicznych i behawioralnych badań nad ich zdolnościami wzrokowymi. Ponadto, podczas gdy opisane tutaj metody koncentrowały się na systemach wzrokowych mrówek, techniki te mogą być stosowane na innych owadach, choć z niewielkimi modyfikacjami w protokole (n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Jochenowi Zeilowi, Paulowi Cooperowi i Birgit Greiner za podzielenie się swoją wiedzą na temat anatomii owadów i za zademonstrowanie kilku technik, które tutaj opisaliśmy. Jesteśmy wdzięczni utalentowanemu i wspierającemu personelowi w Centrum Zaawansowanej Mikroskopii w ANU i Zakładzie Mikroskopii w MQU. Praca ta została wsparta stypendium dla absolwentów FRE oraz granty Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Mikroskop stereoskopowy | Leica M205 FA | ||
| Napylarka napylająca | Pro Sci Tech | ||
| Etanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri szalka Petriego | ProSciTech | ||
| Mikroskop preparacyjny | Leica MZ6 | ||
| Pinezka | do owadówProSciTech | ||
| Bezbarwny lakier do paznokci | Niemarkowy: z dowolnego sklepu | ||
| Szkiełko | ProSciTech | ||
| Żyletka | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Szkiełko nakrywkowe | ProSciTech | ||
| Mikroskop złożony | Leica DM5000 B | ||
| Aldehyd glutarowy | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyd | Sigma Aldrich | ||
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| Wodorofosforan potasu (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sód Chlorek (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Tetratlenek osmu | Sigma Aldrich | ||
| Aceton | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Żywica epoksydowa | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Płyta grzejna | Riechert Zobacz materiał HK120 |
Bibliografia
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331(2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702(2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
