Method Article

Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów w niskich stężeniach za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)

DOI:

10.3791/56343

⸱

November 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM) to technika wolumetryczna, która pozwala na obrazowanie próbek 50-100 razy grubszych niż mikroskopia jasnego pola w porównywalnej rozdzielczości, z ogniskowaniem wykonywanym po przetworzeniu. W tym przypadku DHM służy do identyfikacji, liczenia i śledzenia mikroorganizmów o bardzo niskiej gęstości i porównywania z pomiarami gęstości optycznej, liczeniem płytek i liczeniem bezpośrednim.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne wykrywanie i liczenie rzadkich próbek bakterii ma wiele zastosowań w przemyśle spożywczym, napojowym i farmaceutycznym, w diagnostyce medycznej oraz do wykrywania życia przez misje robotyczne na inne planety i księżyce układu słonecznego. Obecnie rzadkie próbki bakterii są zliczane za pomocą posiewu hodowlanego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Płytki hodowlane wymagają długiego czasu inkubacji (od dni do tygodni), a mikroskopia epifluorescencyjna wymaga intensywnego barwienia i zagęszczenia próbki. Tutaj pokazujemy, jak używać pozaosiowej cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM) do liczenia bakterii w bardzo rozcieńczonych kulturach (100-104 komórki/ml). W pierwszej kolejności omówiono budowę niestandardowego DHM wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi budowy taniego instrumentu. Omówiono zasady holografii, a model statystyczny służy do oszacowania, jak długie powinny być filmy wideo, aby wykryć komórki, w oparciu o charakterystykę parametrów optycznych instrumentu i stężenie roztworu bakteryjnego (tabela 2). Wideodetekcja komórek przy 10,5,10, 4, 10,3 i 100 komórkach/ml jest demonstrowana w czasie rzeczywistym za pomocą niezrekonstruowanych hologramów. Rekonstrukcja obrazów amplitudy i fazy jest demonstrowana za pomocą pakietu oprogramowania typu open source.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie dokładnej liczby bakterii w bardzo rozcieńczonych próbkach jest kluczowe w wielu zastosowaniach: kilka przykładów to analiza jakości wody i żywności1,2,3; wykrywanie patogenów we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym lub plwocinie4,5; produkcja produktów farmaceutycznych, w tym sterylna woda6; oraz analiza społeczności środowiskowej w środowiskach oligotroficznych, takich jak otwarty ocean i osady7,8,9<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost i liczenie bakterii

UWAGA: Dotyczy to prawie każdego szczepu bakterii uprawianego w odpowiednim podłożu36. W naszym przykładzie używamy trzech szczepów: Serratia marcescens jako powszechnego, łatwego do zidentyfikowania szczepu laboratoryjnego; oraz mniejszy, wysoce ruchliwy szczep środowiskowy, Shewanella oneidensis MR-1. Aby porównać wykrywanie komórek ruchliwych i nieruchliwych, do porównania używa się również nieruchliwego mutanta Shewanella, Δ FlgM, 37. Wszystkie szczepy są uprawiane w bulionie lizogenicznym (LB).

  1. Przygotować sterylne podło....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki powinny wskazywać na zdolność do wykrywania żywych i martwych bakterii na bardzo niskich poziomach przez DHM. Liczba zliczonych bakterii powinna być zgodna z wynikami uzyskanymi przy użyciu komory liczącej Petroff-Hauser i zliczania płytek. Standardowe metody statystyczne dostarczają informacji na temat dokładności różnych metod wykrywania przy różnych stężeniach bakterii.

Rysunek 1 pokazuje .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekonstrukcja numeryczna hologramów: Do rekonstrukcji numerycznej hologramów stosuje się metodę widma kątowego (ASM). Polega to na splotowaniu hologramu z funkcją Greena dla DHM. Zespolone czoło fali obrazu w określonej płaszczyźnie ogniskowej można obliczyć, stosując twierdzenie o splotzie Fouriera w następujący sposób:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Fundacji Gordona i Betty Moore za sfinansowanie tej pracy grantom 4037 i 4038 dla California Institute of Technology.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Drożdże BactoBD Biosciences212750
Bacto TryptoneBD Biosciences211705
Chlorek soduSigma-Aldrich7710Wiele opcji zakupu
Bacto AgarBD Biosciences214010
10 cm szalki PetriegoVWR10053-704
15 ml probówki hodowlaneFalcon ( Corning Life Sciences)352002Komora
Petroffa-Hauseranakrętką Mikroskopia elektronowa Sciences3920
Strzykawki 10 mlBD Biosciences309604końcówka Luer-Lok nie jest konieczna
Męski Luer do 1/16" Złączka kolczastaMcMaster-Carr51525K291
Autoklawowalne 1/16" Rurka PVC ID do przepływuNalgene8000-0004Sprzedawane według długości, kup odpowiednio
Pompa strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000
Komora na próbkiNiestandardowanie dotyczyPatrz sekcja materiałów
Mikroskop holograficznyNiestandardowynie dotyczyPatrz Wallace i wsp.
Oprogramowanie typu open sourceCustomhttps://github.com/bmorris3/shampoo
z luźną

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Digital Holographic MicroscopyBacterial DetectionLow Concentration EnumerationHologram ReconstructionPetroff Hausser ChamberCFU PlatingSerial DilutionSyringe Pump FlowMedium Subtracted FilteringCell Density Calculation

Related Articles