Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów w niskich stężeniach za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56343

⸱

1 listopada 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM) to technika wolumetryczna, która pozwala na obrazowanie próbek 50-100 razy grubszych niż mikroskopia jasnego pola w porównywalnej rozdzielczości, z ogniskowaniem wykonywanym po przetworzeniu. W tym przypadku DHM służy do identyfikacji, liczenia i śledzenia mikroorganizmów o bardzo niskiej gęstości i porównywania z pomiarami gęstości optycznej, liczeniem płytek i liczeniem bezpośrednim.

Streszczenie

Dokładne wykrywanie i liczenie rzadkich próbek bakterii ma wiele zastosowań w przemyśle spożywczym, napojowym i farmaceutycznym, w diagnostyce medycznej oraz do wykrywania życia przez misje robotyczne na inne planety i księżyce układu słonecznego. Obecnie rzadkie próbki bakterii są zliczane za pomocą posiewu hodowlanego lub mikroskopii epifluorescencyjnej. Płytki hodowlane wymagają długiego czasu inkubacji (od dni do tygodni), a mikroskopia epifluorescencyjna wymaga intensywnego barwienia i zagęszczenia próbki. Tutaj pokazujemy, jak używać pozaosiowej cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM) do liczenia bakterii w bardzo rozcieńczonych kulturach (100-104 komórki/ml). W pierwszej kolejności omówiono budowę niestandardowego DHM wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi budowy taniego instrumentu. Omówiono zasady holografii, a model statystyczny służy do oszacowania, jak długie powinny być filmy wideo, aby wykryć komórki, w oparciu o charakterystykę parametrów optycznych instrumentu i stężenie roztworu bakteryjnego (tabela 2). Wideodetekcja komórek przy 10,5,10, 4, 10,3 i 100 komórkach/ml jest demonstrowana w czasie rzeczywistym za pomocą niezrekonstruowanych hologramów. Rekonstrukcja obrazów amplitudy i fazy jest demonstrowana za pomocą pakietu oprogramowania typu open source.

Wprowadzenie

Określenie dokładnej liczby bakterii w bardzo rozcieńczonych próbkach jest kluczowe w wielu zastosowaniach: kilka przykładów to analiza jakości wody i żywności1,2,3; wykrywanie patogenów we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym lub plwocinie4,5; produkcja produktów farmaceutycznych, w tym sterylna woda6; oraz analiza społeczności środowiskowej w środowiskach oligotroficznych, takich jak otwarty ocean i osady7,8,9. Rośnie również zainteresowanie wykrywaniem możliwego istniejącego życia mikrobiologicznego na lodowych księżycach Jowisza i Saturna, w szczególności na Europa10,11 i Enceladus12,13,14, o których wiadomo, że mają podpowierzchniowe ciekłe oceany. Ponieważ od czasu Vikinga w 1978 roku żadna misja nie próbowała odnaleźć istniejącego życia na innej planecie, rozwój technologii i instrumentów do identyfikacji i liczenia bakterii podczas misji kosmicznych był ograniczony15.

Tradycyjne metody liczenia płytek znajdują tylko komórki nadające się do hodowli, które mogą reprezentować mniejszość gatunków w szczepach środowiskowych, czasami <1%16. Płytki wymagają dni lub tygodni inkubacji, aby osiągnąć maksymalny sukces, w zależności od szczepu. Mikroskopia epifluorescencyjna w dużej mierze zastąpiła liczenie płytek jako złoty standard szybkiego i dokładnego zliczania drobnoustrojów. Typowymi stosowanymi barwnikami są barwniki fluorescencyjne znakowane kwasami nukleinowymi, takie jak dichlorowodorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), SYBR Green lub oranż akrydynowy, które wiążą się z kwasami nukleinowymi17,18,19, chociaż wiele badań używa fluorescencyjnych wskaźników znaku Grama20,21,22,23,24. Stosowanie tych metod bez etapów wstępnego zatężania prowadzi do granic wykrywalności (LoD) wynoszących ~105 komórek na ml. Ulepszenia w LoD są możliwe dzięki filtracji. Ciekła próbka jest filtrowana próżniowo na membranę, zwykle z poliwęglanu i najlepiej w kolorze czarnym, aby zredukować tło. Barwniki o niskiej zawartości tła, takie jak wspomniane powyżej barwniki DNA, mogą być nakładane bezpośrednio na filtr25. Do dokładnego liczenia na oko wymagane jest ~105 komórek na filtr, co oznacza, że w przypadku próbek bardziej rozcieńczonych niż ~105 komórek na ml należy pobrać i przefiltrować znaczne objętości próbek. Urządzenia skanujące laserowo zostały opracowane w celu systematycznego badania wszystkich regionów filtra, a tym samym zmniejszenia liczby komórek wymaganych do zliczania, przesuwając granice wykrywania do ~102 komórek na ml26. Nie są one jednak dostępne w większości laboratoriów i wymagają zaawansowanego sprzętu, a także oprogramowania, które pozwala na potwierdzenie przez ekspertów, że obserwowane cząstki są bakteriami, a nie śmieciami.

Dla porównania, dorośli z sepsą zwykle zaczynają wykazywać objawy przy <100 komórkach/ml krwi, a niemowlęta przy <10 komórkach/ml. Pobranie krwi od osoby dorosłej zajmuje 10 ml, a od niemowlęcia 1 ml. Metody oparte na PCR są hamowane przez obecność DNA ludzkiej i niepatogennej flory oraz przez składniki hamujące PCR w krwi27,28. Pomimo wielu pojawiających się technik, kultury pozostają złotym standardem w diagnozowaniu zakażeń krwi, zwłaszcza na obszarach wiejskich lub w krajach rozwijających się. W celu wykrycia życia na innych planetach, obliczenia termodynamiczne mogą oszacować budżet energetyczny życia, a tym samym oczekiwaną możliwą biomasę. Oczekuje się, że 1 - 100 komórek/ml będzie termodynamicznie rozsądne na Europa29. Z liczb tych można łatwo wywnioskować, że wykrywanie bardzo małej liczby komórek w dużych ilościach roztworu wodnego jest ważnym, nierozwiązanym problemem.

W tym artykule demonstrujemy wykrywanie Serratia marcescens i Shewanella oneidensis (dzikiego typu i nieruchliwego mutanta) w stężeniach 105,10 4,10 3 i 100 komórek/ml za pomocą cyfrowego mikroskopu holograficznego (DHM) poza osią. Kluczową przewagą DHM nad tradycyjną mikroskopią świetlną jest jednoczesne obrazowanie grubej objętości próbki w wysokiej rozdzielczości - w tej implementacji komora próbki miała grubość 0,8 mm. Te komory na próbki zostały zbudowane metodą miękkiej litografii polidimetylosiloksanu (PDMS) z precyzyjnie obrobionej formy aluminiowej o tolerancji ± 50 μm. Stanowi to około 100-krotną poprawę głębi ostrości w porównaniu z mikroskopią świetlną o dużej mocy. DHM dostarcza również ilościowych informacji o fazie, co pozwala na pomiary długości ścieżki optycznej (iloczynu współczynnika załamania światła i grubości). DHM i podobne techniki zostały wykorzystane do monitorowania cyklu komórkowego bakterii i drożdży oraz obliczania suchej masy bakteryjnej30,31,32; Różnice w rozpraszaniu mogą być nawet wykorzystane do różnicowania szczepów bakteryjnych33.

Instrument, którego używamy, został specjalnie zbudowany do użytku z mikroorganizmami, jak wcześniej opublikowano34,35, a jego projekt i konstrukcja są demonstrowane i omawiane. Roztwory wodne są w sposób ciągły dostarczane do komory na próbkę o objętości 0,25 μl za pomocą pompy strzykawkowej; Natężenie przepływu jest określane na podstawie liczby klatek na sekundę kamery, aby zapewnić obrazowanie całej objętości próbki. Obliczenia statystyczne przewidują liczbę objętości próbek, które muszą zostać zobrazowane, aby wykryć znaczną liczbę komórek przy danym stężeniu.

Dla aplikacji do wykrywania komórek, rekonstrukcja hologramów na obrazy amplitudy i fazy nie była wymagana; analiza została przeprowadzona na surowym hologramie. Oszczędza to znaczne zasoby obliczeniowe i miejsce na dysku: film z hologramem o rozmiarze 500 Mb będzie miał 1-2 TB po zrekonstruowaniu. Omawiamy jednak rekonstrukcję na podstawie głębokości próbki, aby potwierdzić, że hologramy reprezentują pożądany gatunek. Ważną cechą DHM jest jego zdolność do monitorowania zarówno intensywności, jak i fazy obrazów. Organizmy, które są prawie przezroczyste pod względem intensywności (takie jak większość komórek biologicznych), pojawiają się wyraźnie w fazie. Ponieważ jest to technika bezetykietowa, nie stosuje się żadnych barwników. Jest to zaleta dla możliwych zastosowań w lotach kosmicznych, ponieważ barwniki mogą nie przetrwać warunków misji i – co ważniejsze – nie można założyć, że działają z organizmami pozaziemskimi, które mogą nie używać DNA lub RNA do kodowania. Jest to również zaleta do pracy w ekstremalnych warunkach, takich jak Arktyka i Antarktyda, gdzie barwniki mogą być trudne do przewiezienia do odległego miejsca i mogą ulec degradacji podczas przechowywania. Rekonstrukcja obrazów na fazę i amplitudę odbywa się za pomocą pakietu oprogramowania open-source, który udostępniliśmy na GitHub (SHAMPOO) lub za pomocą ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i liczenie bakterii

UWAGA: Dotyczy to prawie każdego szczepu bakterii uprawianego w odpowiednim podłożu36. W naszym przykładzie używamy trzech szczepów: Serratia marcescens jako powszechnego, łatwego do zidentyfikowania szczepu laboratoryjnego; oraz mniejszy, wysoce ruchliwy szczep środowiskowy, Shewanella oneidensis MR-1. Aby porównać wykrywanie komórek ruchliwych i nieruchliwych, do porównania używa się również nieruchliwego mutanta Shewanella, Δ FlgM, 37. Wszystkie szczepy są uprawiane w bulionie lizogenicznym (LB).

  1. Przygotować sterylne podłoże LB (na litr wody destylowanej: 10 g bacto tryptonu, 5 g drożdży bakto, 10 g NaCl; filtr lub autoklaw). Przygotuj standardowe płytki z agarem LB o średnicy 100 mm (ta sama receptura co podłoże plus 15 g agaru na litr; autoklaw (121 °C, 20 min) do sterylizacji i wlej, gdy ostygną wystarczająco dużo, aby można było z nimi obchodzić). Przechowuj podłoże i talerze w lodówce.
  2. Dzień przed eksperymentem należy wysiać 5 - 6 ml pożywki hodowlanej "Master" ze świeżej kolonii bakteryjnej, stosując odpowiednią technikę sterylną i bezpieczeństwa biologicznego. Inkubować na wytrząsarce (120 obr./min) w temperaturze 30 °C przez ~12 godzin. Czas inkubacji będzie zależał od szczepu i tempa wzrostu. W naszych eksperymentach szczepy Shewanella są inkubowane przez 12 godzin; jednak Serratia jest zbierana po 8 godzinach, aby zapewnić, że kultura będzie wykazywać wzrost w połowie logarytmicznej.
  3. W dniu eksperymentu należy wykonać odczyt spektrofotometryczny (OD600) bakteryjnej kultury Master, który powinien mieścić się w zakresie od 0,6 do 0,7. Powinien znajdować się w logarytmicznej fazie wzrostu (jak określono wcześniej). Jeśli nie, zahoduj 100 μl do 5 ml pożywki i pozwól komórkom rosnąć do środkowej fazy logarytmicznej.
  4. Pobrać próbkę kultury Master i policzyć komórki bezpośrednio za pomocą komory liczącej Petroffa-Haussera. Spowoduje to wyliczenie zarówno żywych, jak i martwych komórek.
    1. Ekstrahować 10 μl próbki nierozcieńczonej kultury za pomocą mikropipety i przenieść do komory.
    2. Obraz pod mikroskopem obiektywowym o wysokiej wilgotności suchości (40X lub 63X, NA 0,7 - 0,8) z wykorzystaniem kontrastu fazowego.
    3. Policz bakterie w co najmniej 20 kwadratach i średnia.
      UWAGA: Policz tylko te bakterie, które znajdują się w całości w kwadracie i tylko te, które przekraczają górną i lewą granicę (lub dolną i prawą, jeśli wolisz). Jeśli kwadraty są oddzielone kilkoma liniami, wybierz jedną z nich jako obwiednię.
    4. Obliczyć stężenie jako średnią z 20 kwadratów x współczynnik rozcieńczenia. Należy pamiętać, że bezpośrednie liczenie nie działa dobrze w przypadku stężeń <107/ml.
  5. Wykonać seryjne rozcieńczenia kultury w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie (CFU). Spowoduje to wyliczenie tylko żywych komórek.
    1. Wykonaj seryjne rozcieńczenie każdej z wybranych próbek bakteryjnych sterylnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej. Przenieść 20 μl roztworu bakteryjnego i rozcieńczyć go 180 μl soli fizjologicznej. Powtarzaj, aż najniższe stężenie wyniesie ~103 komórki/ml.
    2. Weź 100 μl z co najmniej dwóch rozcieńczeń - sugerowane to 10,3 i 104 / ml - i umieść na odpowiedniej płytce z podłożem stałym. Rozsmarować za pomocą sterylnego rozsiewacza. Wykonać co najmniej 3 powtórzenia każdego rozcieńczenia.
    3. Inkubuj w odpowiedniej dla bakterii temperaturze przez noc lub do momentu wzrostu kolonii.
    4. Policz kolonie i oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) zgodnie z (# kolonii x współczynnik rozcieńczenia)/objętość posiewu = CFU/ml. Średnia CFU w powtórzeniach.

2. Przygotowanie bardzo rozcieńczonych próbek do DHM

  1. Wykonać seryjne rozcieńczenia kultury głównej do zliczania jednostek tworzących kolonie po DHM i po DHM na płytkach LB (patrz 1.4.1 - 1.4.4). Wykonaj tę podwójnie ślepą próbę, tak aby osoba wykonująca zapisy nie była świadoma stężenia w każdej mierzonej próbce.
    1. Rozcieńczyć bakterie w 10 - 15 ml minimalnej pożywki, która pobudzi ruchliwość (w stosownych przypadkach), ale zahamuje podział komórek, tak aby stężenie komórek nie zmieniło się znacząco podczas eksperymentu. Może to być 0,9% soli fizjologicznej lub bardziej specyficzne podłoże o ruchliwości. Na przykład, jeśli używasz Escherichia coli, pożywka ruchliwości musi zawierać EDTA38. W tych przykładach używamy 0,9% soli fizjologicznej.

3. Nagrywanie filmów DHM

  1. Za pomocą sterylnej strzykawki pobrać około 10 ml interesującego nas roztworu.
  2. Podłączyć strzykawkę do komory na próbki DHM za pomocą sterylnych złączek i przewodów.
    UWAGA: Wykonana na zamówienie komora mikroprzepływowa została skonstruowana w celu umożliwienia stałego przepływu próbki przez ścieżkę optyczną instrumentu. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz sekcję Wyniki. Przed eksperymentem wszystkie elementy komory na próbkę powinny zostać wysterylizowane w autoklawie.
  3. Próbka ze strzykawki przepływa przez komorę na próbkę w sposób ciągły za pomocą pompy strzykawkowej.
    UWAGA: Odpowiednie natężenia przepływu różnią się w zależności od wymiarów kanału przepływowego, pożądanej przepustowości, a także ograniczeń akwizycji danych.
  4. Gdy próbka przepływa przez komorę próbki, pobieraj hologramy kolejno z odpowiednią szybkością klatek. Zostanie utworzony plik znacznika czasu, który rejestruje czas każdego przechwycenia obrazu, aby można go było później wykorzystać podczas analizy danych (sekcja 4 protokołu). Wszystkie hologramy należy uzyskać w temperaturze otoczenia (23°C). Nagrywaj hologramy, wykonując wstępnie napisany plik wykonywalny języka C++ dostarczony przez producenta kamery.
    UWAGA: Odpowiednia liczba klatek na sekundę różni się w zależności od wybranego natężenia przepływu. W tym eksperymencie zaleca się użycie takiej liczby klatek na sekundę, aby bakteria była obrazowana >2 razy podczas przemieszczania się przez pole widzenia instrumentu.
  5. Odczekać wystarczająco dużo czasu, aby całe 10 ml próbki przepłynęło przez DHM.
  6. Aby upewnić się, że bakterie nie rosną ani nie umierają podczas eksperymentów, należy zaszczepić wzbogacone płytki pożywki 100 μl zużytej pożywki po przechwyceniu obrazu DHM. Rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 24 godziny; policz obecne kolonie.

4. Obliczanie gęstości komórek i granic wykrywalności

  1. Dzięki uzyskanym filmom z hologramem przeanalizuj dane pod kątem obecności bakterii.
    1. Oblicz medianę wartości piksela dla serii czasowej hologramów, a następnie odejmij tę medianę od każdego odpowiedniego piksela, aby wyeliminować nieruchome artefakty w hologramie. Można to zrobić w ImageJ, wykonując następujące czynności:
      1. Konwersja na 32-bitowy (Image-Type-32-bit)
      2. Obliczanie mediany (Image-Stack-Zproject-Median)
      3. Odejmij medianę od reszty stosu (Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. Ręcznie policz liczbę widocznych pierścieni Airy i komórek z fokusem. W ImageJ odbywa się to poprzez wskazanie obiektów za pomocą narzędzia Wskazuj.
    3. Do każdej serii hologramów będzie dołączony plik ze znacznikiem czasu (zarejestrowany w momencie pozyskania hologramu). Użyj pliku znacznika czasu, aby obliczyć całkowitą ilość próbki pompowanej w momencie przechwycenia obrazu.
  2. Oblicz gęstość komórek, dzieląc całkowitą liczbę wykrytych komórek przez całkowitą objętość zobrazowanej próbki. Średnio 5 - 10 klatek, aby uzyskać dokładne statystyki.

5. Rekonstrukcja obrazu do amplitudy i fazy

  1. Wybierz reprezentatywne filmy z 10 - 200 komórkami na klatkę. Załaduj surowe (nie odejmowane medianą) hologramy do oprogramowania do rekonstrukcji (przykłady: ImageJ Propagacja numeryczna39; SZAMPON [GitHub]).
    1. Korzystając z ImageJ, przejdź do OD-Propagacja numeryczna-Dyfrakcja numeryczna.
    2. Po wyświetleniu monitu narysuj maskę Fouriera, aby wybrać obraz rzeczywisty lub wirtualny i wyeliminować wszelkie cechy szumu sinusoidalnego.
    3. Zrekonstruuj amplitudę i fazę w odpowiednich krokach z, wprowadzając odległość rekonstrukcji.
  2. Mediana odejmij dane amplitudy w celu zmniejszenia szumu, jak w 4.1.1.
  3. Wykreśl dane w postaci sześcianu 3D lub rzutu. Przejdź do sekcji Wtyczki — przeglądarka woluminów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki powinny wykazać zdolność DHM do wykrywania żywych i martwych bakterii przy bardzo niskich stężeniach. Liczba policzonych bakterii powinna być zgodna z wynikami uzyskanymi przy użyciu komory zliczeniowej Petroffa-Hausera oraz metod przeliczania kolonii na płytkach. Standardowe metody statystyczne dostarczają informacji o dokładności poszczególnych metod detekcji przy różnych stężeniach bakterii.

Rysune...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Numeryczna rekonstrukcja hologramów: Do numerycznej rekonstrukcji hologramów wykorzystuje się metodę widma kątowego (ASM). Polega ona na splotcie hologramu z funkcją Greena dla DHM. Złożony front fali obrazu w konkretnej płaszczyźnie ogniskowej można obliczyć, stosując twierdzenie o splotcie Fouriera w następujący sposób:

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Fundacji Gordona i Betty Moore za sfinansowanie tej pracy grantom 4037 i 4038 dla California Institute of Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drożdże BactoBD Biosciences212750
Bacto TryptoneBD Biosciences211705
Chlorek soduSigma-Aldrich7710Wiele opcji zakupu
Bacto AgarBD Biosciences214010
10 cm szalki PetriegoVWR10053-704
15 ml probówki hodowlaneFalcon ( Corning Life Sciences)352002Komora
Petroffa-Hauseranakrętką Mikroskopia elektronowa Sciences3920
Strzykawki 10 mlBD Biosciences309604końcówka Luer-Lok nie jest konieczna
Męski Luer do 1/16" Złączka kolczastaMcMaster-Carr51525K291
Autoklawowalne 1/16" Rurka PVC ID do przepływuNalgene8000-0004Sprzedawane według długości, kup odpowiednio
Pompa strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000
Komora na próbkiNiestandardowanie dotyczyPatrz sekcja materiałów
Mikroskop holograficznyNiestandardowynie dotyczyPatrz Wallace i wsp.
Oprogramowanie typu open sourceCustomhttps://github.com/bmorris3/shampoo
z luźną

Bibliografia

  1. Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
  2. Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
  3. Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R. Identification and enumeration of Salmonella on sample slides of poultry carcass wash water using image analysis with fluorescent microscopy. Transactions of the Asae. 42, 267-273 (1999).
  4. Durtschi, J. D., et al. Increased sensitivity of bacterial detection in cerebrospinal fluid by fluorescent staining on low-fluorescence membrane filters. J Med Microbiol. 54, 843-850 (2005).
  5. Panicker, R. O., Soman, B., Saini, G., Rajan, J. A Review of Automatic Methods Based on Image Processing Techniques for Tuberculosis Detection from Microscopic Sputum Smear Images. J Med Syst. 40, (2016).
  6. Riepl, M., et al. Applicability of solid-phase cytometry and epifluorescence microscopy for rapid assessment of the microbiological quality of dialysis water. Nephrol Dial Transplant. 26, 3640-3645 (2011).
  7. Hwang, C. Y., Cho, B. C. Virus-infected bacteria in oligotrophic open waters of the East Sea, Korea. Aquat Microb Ecol. 30, 1-9 (2002).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environmental-Samples - Past and Present. Microbiol Rev. 58, 603-615 (1994).
  9. Queric, N. V., Soltwedel, T., Arntz, W. E. Application of a rapid direct viable count method to deep-sea sediment bacteria. J Microbiol Meth. 57, 351-367 (2004).
  10. Prieto-Ballesteros, O., Vorobyova, E., Parro, V., Rodriguez Manfredi, J. A., Gomez, F. Strategies for detection of putative life on Europa. Adv Space Res. 48, 678-688 (2011).
  11. Gleeson, D. F., et al. Biosignature Detection at an Arctic Analog to Europa. Astrobiology. 12, 135-150 (2012).
  12. Carr, C. E., Zuber, M. T., Ruvkun, G., Ieee, 2013 Ieee Aerospace Conference IEEE Aerospace Conference Proceedings. , (2013).
  13. Konstantinidis, K., et al. A lander mission to probe subglacial water on Saturn's moon Enceladus for life. Acta Astronautica. 106, 63-89 (2015).
  14. McKay, C. P., Anbar, A. D., Porco, C., Tsou, P. Follow the Plume: The Habitability of Enceladus. Astrobiology. 14, 352-355 (2014).
  15. Hoover, R. B. Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology Xvii. Hoover, R. B., Levin, G. V., Rozanov, A. Y., Wickramasinghe, N. C. , Vol. 9606 Proceedings of SPIE (2015).
  16. Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev: MMBR. 68, 669-685 (2004).
  17. Lebaron, P., Parthuisot, N., Catala, P. Comparison of blue nucleic acid dyes for flow cytometric enumeration of bacteria in aquatic systems. Appl Environ Microbiol. 64, 1725-1730 (1998).
  18. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Appl Environ Microbiol. 63, 186-193 (1997).
  19. Noble, R. T., Fuhrman, J. A. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
  20. Forster, S., Snape, J. R., Lappin-Scott, H. M., Porter, J. Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria. Appl Environ Microbiol. 68, 4772-4779 (2002).
  21. Lauer, B. A., Reller, L. B., Mirrett, S. Comparison Of Acridine-Orange And Gram Stains For Detection Of Microorganisms In Cerebrospinal-Fluid And Other Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 14, 201-205 (1981).
  22. Mason, D. J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F. C., Gant, V. A. A fluorescent gram stain for flow cytometry and epifluorescence microscopy. Appl Environ Microbiol. 64, 2681-2685 (1998).
  23. Saida, H., Ytow, N., Seki, H. Photometric application of the Gram stain method to characterize natural bacterial populations in aquatic environments. Appl Environ Microbiol. 64, 742-747 (1998).
  24. Sizemore, R. K., Caldwell, J. J., Kendrick, A. S. Alternate Gram Staining Technique Using A Fluorescent Lectin. Appl Environ Microbiol. 56, 2245-2247 (1990).
  25. Bitton, G., Dutton, R. J., Foran, J. A. New Rapid Technique For Counting Microorganisms Directly On Membrane Filters. Stain Technology. 58, 343-346 (1983).
  26. Broadaway, S. C., Barton, S. A., Pyle, B. H. Rapid staining and enumeration of small numbers of total bacteria in water by solid-phase laser cytometry. Appl Environ Microbiol. 69, 4272-4273 (2003).
  27. Yagupsky, P., Nolte, F. S. Quantitative aspects of septicemia. Clin Microbiol Rev. 3, 269-279 (1990).
  28. Kang, D. K., et al. Rapid detection of single bacteria in unprocessed blood using Integrated Comprehensive Droplet Digital Detection. Nat Commun. 5, 5427(2014).
  29. Hand, K. P. Report of the Europa Lander Science Definition Team. , (2017).
  30. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol-Cell Physiol. 295, C538-C544 (2008).
  31. Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 13124-13129 (2011).
  32. Rappaz, B., et al. Noninvasive characterization of the fission yeast cell cycle by monitoring dry mass with digital holographic microscopy. J.Biomed Opt. 14, 034049(2009).
  33. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Opt. Express. 23, 15792-15805 (2015).
  34. Wallace, J. K., et al. Robust, compact implementation of an off-axis digital holographic microscope. Opt. Express. 23, 17367-17378 (2015).
  35. Lindensmith, C. A., et al. A Submersible, Off-Axis Holographic Microscope for Detection of Microbial Motility and Morphology in Aqueous and Icy Environments. Plos One. 11, e0147700(2016).
  36. Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains. IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).
  37. Frisk, A., Jyot, J., Arora, S. K., Ramphal, R. Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).
  38. Adler, J., Templeton, B. The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).
  39. Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. Numerical wave propagation in Image J. Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).
  40. Schnars, U., Jüptner, W. P. Digital recording and numerical reconstruction of holograms. Meas. Sci. Technol. 13, R85(2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie bakteriienumeracja niskich stężeńrekonstrukcja hologramukomora Petroffa-Hausseraposiew CFUrozcieńczanie seryjneprzepływ z pompą strzykawkowąfiltrowanie z odjęciem tłaobliczanie gęstości komórek
Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów w niskich stężeniach za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DHM)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.