Ten artykuł opisuje protokół na dużą skalę izolacji aksenicznej i zbierania swobodnie pływających miracidii ludzkiej krwi przywry Schistosoma mansoni oraz ich późniejszego przetwarzania w celu wprowadzenia do hodowli in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przywry ludzkiej krwi, Schistosoma spp., mają złożony cykl życiowy, który obejmuje fazy rozwoju bezpłciowego i płciowego odpowiednio u ślimaka pośredniego i ssaka końcowego. Możliwość izolowania i podtrzymywania różnych etapów cyklu życiowego w warunkach hodowli in vitro znacznie ułatwiła badania nad komórkowymi, biochemicznymi i molekularnymi mechanizmami regulującymi wzrost, rozwój i interakcje pasożytów z gospodarzami. Przenoszenie schistosomatozy wymaga rozmnażania bezpłciowego i rozwoju wielu stadiów larwalnych w żywicielu ślimaka; od zakaźnego miracidium, przez pierwotne i wtórne sporocysty, aż do końcowego stadium cerkarialnego, które jest zakaźne dla ludzi. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół masowego wylęgu i izolacji Schistosoma mansoni miracidia z jaj uzyskanych z wątroby zakażonych myszy, a następnie ich wprowadzenia do hodowli in vitro. Oczekuje się, że szczegółowy protokół zachęci nowych badaczy do zaangażowania się i poszerzenia tej ważnej dziedziny badań nad schistosomami.
Wprowadzenie
Ludzkie przywry krwiowe Schistosoma spp., są czynnikami wywołującymi schistosomatozę, zaniedbaną chorobę tropikalną, która dotyka około 230 milionów ludzi na całym świecie1. Najbardziej rozpowszechniony gatunek, Schistosoma mansoni, występuje geograficznie w Ameryce Południowej, na Archipelagu Karaibskim, na Bliskim Wschodzie i w Afryce Subsaharyjskiej2. Cykl życiowy S. mansoni i innych schistosomów jest złożony, obejmuje ostatecznego żywiciela ssaków i ślimaki słodkowodne z rodzaju Biomphalaria, które służą jako obligatoryjni żywiciele pośredni
.S. doro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Wisconsin-Madison na mocy Protokołu nr V005717. Poniższy protokół obejmuje pracę w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) dla ludzkich patogenów, chociaż żaden ze stadiów schistosomów przedstawionych w tym protokole nie jest zakaźny dla ludzi lub innych ssaków. Postępuj zgodnie z zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi postępowania z ludzkimi patogenami z grupy ryzyka 2 (RG2).
UWAGA: Używamy samic myszy Swiss-Webster (6-tygodniowych) ze względu na ich większą po....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zdecydowana większość miracidiów zostanie zazwyczaj zebrana podczas pierwszych dwóch „zbiorów”. Inkubacja wyizolowanych miracidiów w CBSS+ inicjuje proces transformacji miracidium w sporocystę (Rysunek 4A-C). W ciągu pierwszej godziny po przeniesieniu do studzienek hodowlanych zawierających CBSS+, większość miracidiów przestaje pływać (Rysunek 4A). Po 6 h hodowli miracidia znajdują się w procesie aktywnego zrzuca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Miracidia S. mansoni, wyizolowana i poddana manipulacji w sposób opisany w niniejszym dokumencie, może zakażać tylko żywiciela pośredniego ślimaka, a zatem nie stanowi zagrożenia biologicznego dla człowieka w tej fazie rozwoju larw. Jednakże, aby uniknąć przypadkowego narażenia/zakażenia ślimaków, należy zachować ostrożność w celu przeprowadzenia izolacji mikwasowej w innym miejscu niż obszary, na których mogą występować lub utrzymywać się podatne gatunki ślimaków Biomphalaria. Zdecydowanie zaleca się o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Częściowo finansowane z grantu NIH RO1AI015503. Myszy zakażone schistosomatozą zostały dostarczone przez NIAID Schistosomasis Resource Center w Instytucie Badań Biomedycznych (Rockville, MD) za pośrednictwem NIH-NIAID Contract HHSN272201000005I do dystrybucji za pośrednictwem BEI Resources.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zbilansowany roztwór soli Chernina (CBSS+) | Na 1L roztworu | ||
| 2,8 g chlorku sodu | Fisher Scientific | S271-3 | Rozpuścić sole, z wyjątkiem chlorku wapnia, i |
| 0,15 g chlorku potasu | Cukry Sigma-Aldrich | P5405 | w 800 ml ddH2O |
| 0,07 g fosforanu sodu, dwuzasadowego bezwodnego | Fisher Scientific | S374-500 | Chlorek wapnia rozpuścić oddzielnie w 200 |
| 0,45 g siarczanu magnezu siedmiowodnego | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0,53 g dwuwodnego chlorku wapnia | Mallinckrodt | 4160 | Powoli dodawać roztwór wapnia do roztworu sól/cukier za pomocą |
| 0,05 g wodorowęglanu sodu | Fisher Scientific | S233-3 | ze stałym mieszaniem |
| 1 g glukozy | MP Biomedicals | 152527 | Dostosuj do pH 7,2 i sterylizuj filtrem za pomocą |
| 1 g trehalozy | Sigma-Aldrich | T0167 | 0,22 &mikro; m jednorazowy filtr butelkowy |
| 10 ml 100X penicylina/streptomycyna | Klon SV30010 | Dodaj przefiltrowaną penicylinę i streptomycynę soln wcześniejsze użycie | |
| Niekompletny Bge średni (Ibge) | Na 900 ml roztworu | ||
| 220 ml Schneidera' s Pożywka Drosophila modyfikowana | Lonza | 04-351Q | Wymieszaj pożywkę Schneidera z 680 ml ddH2O |
| 4,5 g hydrolizatu enzymatycznego laktoalbuminy | Sigma-Aldrich | L9010 | Dodaj hydrolizat laktoalbuminy i galaktozę |
| 1,3 g galaktoza | Sigma-Aldrich | G0625 | Dostosuj do pH 7,2 i sterylizuj filtrem za pomocą 0,22 &mikro; m wstępnie sterylizowany jednorazowy filtr butelkowy |
| Complete Bge medium (cBge) | Na 100 ml roztworu | ||
| 90 mL Niekompletna pożywka | Do inaktywacji termicznej FBS: Inkubować rozmrożony FBS w | ||
| 9 ml termoaktywnej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | kąpiel wodna w temperaturze 60° C przez 1 godzinę delikatnie |
| 1 ml 100X penicyliny/streptomycyny | Hyklon | SV30010 | wirowanie butelki co 10 min Porcja inaktywowanego termicznie FBS do probówek o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20°C. Wymieszaj pożywkę + FBS i filtr, sterylizuj za pomocą 0,22 &mikro; m wstępnie sterylizowane Jednorazowy filtr butelkowy Przed użyciem dodać penicylinę i streptomycynę |
| Woda w stawie (roztwór podstawowy) | 1L roztworu podstawowego | ||
| 12,5 g węglanu wapnia | Fisher Scientific | C64-500 | Wymieszaj wszystkie sole w 1L ddH2O |
| 1,25 g węglanu magnezu | Fisher Scientific | M27-500 | Zwróć uwagę, że sole nie będą miały całkowicie |
| 1,25 g chlorek sodu | Fisher Scientific | S271-3 | rozpuszczony. Wstrząśnij energicznie, aby zawiesić |
| 0,25 g chlorek potasu | sole Sigma-Aldrich | P5405 | przed wykonaniem roztworu roboczego |
| Woda w stawie (roztwór roboczy) | 1,5 l roztworu | ||
| 0,8 ml wody w stawie z roztworem podstawowym (wstrząsnąć przed użyciem) w | Wymieszaj bulion z ddH2O | ||
| 1500 ml ddH2O | Sterylizuj wodę w stawie przez autoklawowanie (powoli cykl) | ||
| 1,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny | Hyclone | SV30010 | Dodaj penicylinę i streptomycynę przed użyciem |
| roztwór soli fizjologicznej (1,2% NaCl) | 1,5 l roztworu | ||
| 18 g chlorku sodu w 1500 ml ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoklaw roztwór soli fizjologicznej do sterylizacji |
| 1,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny | Hyklon | SV30010 | Dodaj penicylinę i streptomycynę przed użyciem |
| Dodatkowe wyposażenie i materiał: Komora | |||
| 7-L | Zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC nr V001551 | ||
| Zbiornik CO2 i regulator | wolna od patogenów | ||
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | TPP | 92424 | |
| 1-litrowe kolby | |||
| Źródło światła (150 W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Wirówka, chłodzona, wahadłowa | Eppendorf | Model 5810R | |
| Wirówka butelki (250 ml) | Probówki | ||
| 15 mL, sterylne | Corning | 430053 | |
| Sterylne jednorazowe pipety transferowe | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0,22 &mikro; M Wstępnie sterylizowany jednorazowy filtr butelkowy | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Blender ze stali nierdzewnej | Waring Model komercyjny | 51BL31 | |
| Kubek blendera, pojemność 100 ml | Waring Komercyjny | ||
| odwrócony mikroskop złożony | Nikon Instruments | Zaćmienie TE300 |
Bibliografia
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
