Artykuł metodologiczny

Prawidłowe ułożenie i unieruchomienie tylnej kończyny szczura w celu zogniskowanego obrazowania mikroarchitektury kości w wysokiej rozdzielczości za pomocą mikrotomografii komputerowej in vivo

DOI:

10.3791/56346

⸱

22 listopada 2017

 ,  , 
1Department of Kinesiology, Faculty of Applied Health Sciences, Brock University, 2Department of Health Sciences, Faculty of Applied Health Sciences, Brock University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł instruuje użytkowników skanerów do mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT), jak znieczulać, prawidłowo ustawiać i krępować tylną kończynę szczura w celu zminimalizowania ruchu podczas obrazowania kości piszczelowej w wysokiej rozdzielczości. Rezultatem są wysokiej jakości obrazy, które można przetworzyć w celu dokładnego określenia ilościowego mikroarchitektury kości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT) to potężne narzędzie, które polega na nieniszczącym obrazowaniu wewnętrznych struktur w wysokich rozdzielczościach na żywych modelach zwierzęcych. Pozwala to na wielokrotne obrazowanie tego samego gryzonia w czasie. Ta cecha nie tylko zmniejsza całkowitą liczbę gryzoni wymaganych w projekcie eksperymentalnym, a tym samym zmniejsza zmienność między osobnikami, która może wystąpić, ale także pozwala naukowcom ocenić podłużne lub trwające całe życie reakcje na interwencję. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, które można przetwarzać i analizować w celu dokładniejszego ilościowego określenia wyników mikroarchitektury kości, użytkownicy skanerów μCT in vivo muszą odpowiednio znieczulić szczura oraz ustawić i unieruchomić tylną kończynę. Aby to zrobić, konieczne jest, aby szczur został znieczulony do poziomu całkowitego relaksu i aby odruchy pedałowania zostały utracone. Wytyczne te mogą być modyfikowane dla każdego szczura z osobna, ponieważ tempo metabolizmu izofluranu może się różnić w zależności od szczepu i wielkości ciała. Właściwa technika pozyskiwania obrazów μCT in vivo umożliwia dokładny i spójny pomiar mikroarchitektury kości w ramach badań i między nimi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT) to potężne narzędzie, które polega na nieniszczącym obrazowaniu struktur wewnętrznych w wysokich rozdzielczościach przy użyciu modeli gryzoni. Nieniszczący charakter μCT in vivo pozwala na wielokrotne obrazowanie tego samego gryzonia w czasie. Ta cecha nie tylko zmniejsza całkowitą liczbę gryzoni wymaganych w projekcie eksperymentalnym, a tym samym zmniejsza zmienność między osobnikami, która może wystąpić, ale także pozwala naukowcom zrozumieć długoterminowe reakcje na interwencję. Eksperymenty na myszach i szczurach, przeprowadzone na myszach i szczurach, za pomocą wielokrotnej symulacji komputerowej in vivo, wyjaśniły zmiany rozwojowe w mikroarchitekturze kości i gęstości mineralnej kości (BMD) w różnych okresach życia 1,2,3,4,5,6,7,8 a także reakcja zdrowia kości na interwencje, takie jak dieta 9,10, ovariektomia 7,11 i środki farmakologiczne 8,12,13. BMD i mikroarchitektura kości w określonych miejscach szkieletu, a mianowicie w bliższej części kości piszczelowej, kości udowej i kręgach lędźwiowych, wskazują na ogólny stan kości i ryzyko doznania złamania, a zatem są podstawowymi miarami przy ilościowym określaniu odpowiedzi na interwencję.

Akwizycja obrazu μCT in vivo polega na dwuwymiarowych projekcjach rentgenowskich pod wieloma kątami, gdy źródło promieniowania rentgenowskiego i detektor obracają się wokół badanego zwierzęcia 14,15. Jakość uzyskanego obrazu zależy od wielu czynników, w tym między innymi: wybranych parametrów akwizycji (tj. rozdzielczości przestrzennej, napięcia promieniowania rentgenowskiego, natężenia prądu, kroku obrotu, zastosowanego filtra, czasu ekspozycji), ograniczeń skanera μCT (tj. artefaktów opartych na skanerze, takich jak artefakty pierścieniowe lub kurz, które powodują smugi lub efekty częściowej objętości) oraz właściwego ułożenia i unieruchomienia zwierzęcia. Dwa pierwsze z tych czynników mogą być w pewnym stopniu manipulowane przez użytkownika, w zależności od konkretnej maszyny skanującej, celów badania i poprawek, które są potrzebne do optymalizacji funkcji skanera lub przetwarzania pozyskanych obrazów. Ten ostatni z czynników, czyli właściwe ułożenie gryzonia przed skanowaniem, może być osiągnięty niezależnie od ograniczeń opartych na skanerze lub parametrów akwizycji, które są dobrane do osiągnięcia określonego celu badania. Chociaż w literaturze opublikowano wiele publikacji dotyczących obrazowania in vivo 14,15,16,17, klasyczny styl rękopisu jest taki, że nie można dołączyć szczegółowych informacji "jak to zrobić". Dlatego celem tego artykułu i przewodnika wideo jest wypełnienie tej pustki. Naszym celem jest poinstruowanie użytkowników tomografów komputerowych μCT in vivo, jak znieczulić szczura oraz ustawić i unieruchomić tylną kończynę, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, które można analizować w celu dokładniejszego ilościowego określenia wyników mikroarchitektury kości.

Zapobieganie przeszkodom promieniowania rentgenowskiego przez obiekty inne niż tylna kończyna jest niezbędne do ilościowego określenia najdokładniejszych wartości BMD i mikroarchitektury kości. Gdy promienie rentgenowskie przechodzą przez obiekty i tkanki o różnej grubości i gęstości, niektóre promienie rentgenowskie są pochłaniane (tj. tłumione) przez materiały, przez które przechodzą. Ponieważ na zmierzoną gęstość masy próbki ma wpływ jej grubość oraz obecność i grubość otaczających tkanek, konieczne jest, aby fantomy kalibracyjne używane do określania BMD były skanowane w ten sam sposób. Dlatego, jeśli wiązka promieniowania rentgenowskiego ma przejść przez obiekty (tj. ogon) przed lub po przejściu przez obszar zainteresowania, obiekty te pochłoną część energii promieniowania rentgenowskiego i będą zakłócać uzyskany obraz transmisyjny. Ponadto skany te byłyby bardzo trudne do symulacji podczas skanowania fantomów, które muszą bardzo przypominać skany próbek. W rezultacie, te różnice w tłumieniu prowadzą do niedokładności w ocenie pomiarów BMD kości. Dlatego, dla łatwości i dokładności, najlepiej jest ograniczyć liczbę przeszkód między źródłem promieniowania rentgenowskiego, obszarem zainteresowania a detektorem promieniowania rentgenowskiego.

Długodystansowa ocena struktury kości na podstawie interwencji w modelach przedklinicznych obejmuje wielokrotne znieczulanie zwierzęcia w celu ograniczenia jego ruchu podczas protokołów skanowania. Istnieje kilka metod znieczulenia ogólnego w celu obezwładnienia zwierząt poddawanych badaniu μCT, w tym znieczulenie iniekcyjne i wziewne 1,2,4,5,6,12. W przeciwieństwie do wziewnych środków znieczulających, takich jak izofluran, wielokrotne znieczulenie ogólne przy użyciu środków znieczulających do wstrzykiwań powoduje zmniejszenie masy ciała, tolerancję chirurgiczną i znaczące zmiany innych parametrów fizjologicznych u gryzoni, w szczególności szczurów i świnek morskich, co sugeruje istotne przeciwwskazania do wielokrotnego stosowania 18,19,20. Podczas gdy izofluran jest wysoce lotny i pozwala na szybką indukcję i powrót do zdrowia, środki znieczulające do wstrzykiwań wytwarzają różne poziomy znieczulenia, a czas pod narkozą zależy od szczepu, płci, składu ciała, stanu postu i cyklu dobowego zwierzęcia. Środki znieczulające do wstrzykiwań stanowią również dodatkowe bariery w ich stosowaniu, ponieważ są ściśle regulowane przez krajowe organy zarządzające. Znieczulenie wziewne polega jednak na bezpośrednim podaniu do układu oddechowego; Ta metoda pozwala na szybszą indukcję i czas rekonwalescencji oraz lepszą kontrolę nad długością i głębokością znieczulenia19,20. Ograniczenia metody znieczulenia wziewnego obejmują wymóg specjalistycznego sprzętu do waporyzacji oraz pewne zmiany częstości akcji serca i ciśnienia krwi podczas indukcji, konserwacji i rekonwalescencji 18,19.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Brock i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami 21.

1. Znieczulenie za pomocą izofluranu

  1. Wstępnie napełnić komorę inkubacyjną szkła akrylowego wysokiej jakościO2 przy ciągłym natężeniu przepływu około 1-2 l/min z urządzenia do znieczulania (rysunek uzupełniający 1).
  2. Najpierw przenieś szczura do ogona komory inkubacyjnej i zamknij pokrywę komory inkubacyjnej, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie.
  3. Rozpocząć napełnianie komory inkubacyjnej izofluranem o czystości weterynaryjnej w stężeniu 3-4% v/v, rozpuszczonym wO2 przy ciągłym natężeniu przepływu 1-2 l/min (rysunek uzupełniający 1).
    UWAGA: Odpadowe gazy znieczulające mogą niekorzystnie wpływać na osoby obsługujące. System przedmuchiwania (tj. filtr węglowy lub wydech bezpośrednio do dygestoria) musi być zawsze na swoim miejscu.
  4. Kiedy szczur nie jest już w stanie stać, przenieść szczura do maski na twarz lub stożka na nos, otrzymując 1-3% izofluranu rozpuszczonego wO2 z szybkością przepływu 1-2 l/min. Szczury oddychają głównie przez nos, a więc, o ile nos jest zakryty maską na twarz lub stożkiem nosowym, Zostanie zapewniona wystarczająca ilość znieczulenia.
  5. Nałóż smar okulistyczny na delikatne błony oczu, aby chronić je przed ulatniającym się gazem izofluranowym.
    UWAGA: Upewnij się, że smarowanie okulistyczne nie zawiera antybiotyków, ponieważ może to wpłynąć na wyniki interwencji.
  6. Zmierz odruchy powiekowe (reakcja mrugania oczami na delikatną stymulację otwarcia powieki) i odruchy pedałowe (wycofanie kończyn tylnych w odpowiedzi na szczypanie); wraz ze wzrostem głębokości znieczulenia, odruch powiekowy będzie nieobecny przed odruchami pedałowania (rysunek uzupełniający 2).
  7. Gdy zostanie osiągnięty odpowiedni poziom znieczulenia, a szczur utraci zarówno odruch powiekowy, jak i odruchowy pedałowania, należy utrzymać szczura na 0,5-2% izofluranu rozpuszczonym wO2 przy szybkości przepływu 1-2 l/min.
  8. Stale monitoruj częstość oddechów szczura przez cały czas trwania zabiegu, utrzymując stały wzrok na szczurze, bezpośrednio za pomocą wewnętrznego systemu monitorowania lub poprzez obraz wideo na żywo (rysunek uzupełniający 3).

2. Ustawianie i ograniczanie tylnej kończyny szczura

  1. Połóż szczura w pozycji leżącej na plecach na łóżku skanera z włókna węglowego (rysunek uzupełniający 4).
  2. Unieruchom prawą stopę w plastycznej, piankowej rurce, z palcami wystającymi poza koniec rurki. Nałóż wosk dentystyczny, aby mocno przytrzymać stopę w piance i mocno zaklej rurkę taśmą. Upewnij się, że średnica rurki przytrzymującej stopę jest wystarczająca, aby mocno pasowała do plastikowej rurki.
  3. Wsuń plastikową rurkę do łóżka skanera rentgenowskiego (rysunek uzupełniający 5).
  4. Wyprostuj tylną kończynę szczura, aż będzie napięta. Nie należy nadmiernie prostować nogi, aby nie wyrządzić szkody szczurowi (Rysunek Uzupełniający 5), ponieważ może to wywołać mimowolne ruchy kończyn z powodu utrudnionego oddychania.
  5. Wyciągnij lewą nogę (niezeskanowaną kończynę tylną) wraz z ogonem poza pole widzenia skanowania i w kierunku tułowia, z dala od wyprostowanej nogi, która ma być skanowana.
  6. Zabezpiecz lewą nogę (niezeskanowaną kończynę tylną) i ogon za pomocą taśmy maskującej. Nie używaj niczego mniej lub bardziej lepkiego (np. taśmy klejącej lub taśmy malarskiej), ponieważ materiały te albo zaszkodzą szczurowi po ich usunięciu (taśma klejąca), albo nie zapewnią wystarczająco mocnego trzymania (taśma malarska) (rysunek uzupełniający 6).
  7. Zabezpiecz ciało szczura na miejscu na biodrach, ramionach i głowie za pomocą taśmy maskującej. Przymocuj maskę na twarz lub stożek nosowy do szczura (rysunek uzupełniający 6).
    UWAGA: Osusz samoprzylepną stronę taśmy maskującej, aby usunąć jej zdolność do przyklejania się do futra szczura. Nie należy ocierać końców taśmy maskującej, aby można ją było mocno przymocować do stołu skanującego.
  8. Owiń szczura w folię weterynaryjną, aby ograniczyć utratę ciepła (rysunek uzupełniający 6).
    UWAGA: W znieczuleniu ogólnym szczury szybko tracą ciepło ze względu na duży stosunek powierzchni do masy ciała 19,20.
  9. Stale monitoruj częstość oddechów szczura przez cały czas trwania zabiegu, stale obserwując szczura (bezpośrednio lub za pośrednictwem przekazu wideo na żywo).
    UWAGA: Tutaj konfiguracja trwa 5 minut, akwizycja skanowania jest zależna od ustawień akwizycji, a czas odzyskiwania wynosi 60 minut.
  10. Przejdź do pobierania obrazów μCT.
    UWAGA: Dokładne specyfikacje dotyczące akwizycji skanów są specyficzne dla każdego typu skanera, systemu oprogramowania i konkretnego pytania badawczego, jednak w literaturze istnieje kilka publikacji metodologicznych 1,2,9.

3. Rekonwalescencja po znieczuleniu

  1. Po zakończeniu skanowania in vivo μCT należy zatrzymać przepływ izofluranu do szczura, ale utrzymać przepływ O 2 l / min wynoszący1-2 l/min.
  2. Kiedy szczur odzyska kontrolę motoryczną (1-2 min), wyjmij go z respiratora i pozwól mu dojść do siebie indywidualnie w klatce umieszczonej częściowo na poduszce grzewczej ogólnego przeznaczenia na małym ogniu. Szczury są znane z tego, że obniżają temperaturę ciała o 1 °C, gdy są pod wpływem znieczulenia ogólnego19. Nie pozostawiaj szczura bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
    UWAGA: Anegdotyczne dowody z naszej grupy badawczej donoszą, że natychmiast po wyzdrowieniu ze znieczulenia izofluranem szczury zaczynają jeść, dlatego ważne jest, aby mieć dostęp do jedzenia i wody podczas rekonwalescencji. Chociaż zaobserwowaliśmy takie zachowanie, powtarzające się znieczulenie ogólne nie powoduje znaczącego wzrostu spożycia pokarmu lub masy ciała 1,9.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda znieczulenia szczura oraz ustawienia i unieruchomienia kończyny tylnej do obrazowania in vivo μCT ułatwia uzyskanie wysokiej jakości obrazów odpowiednich do analizy mikroarchitektury kości piszczelowej. Prawidłowe ułożenie tylnej kończyny szczura polega na tym, że noga jest w pełni wyprostowana, a cała stopa i kostka są unieruchomione pianką (Rysunek 1A), co daje uzyskany obraz o jakości wystarczającej do analizy mikroarchitektury beleczkowej i korowej ( Rysunek 1B). Niewystarczające umiejscowienie i unieruchomienie tylnej kończyny (Rysunek 1C) może skutkować obrazami z artefaktami ruchu (Rysunek 1D), podczas gdy ogon, który nie jest całkowicie usunięty z pola widzenia skanowania (Rysunek 1E) będzie zakłócał tłumienie promieniowania rentgenowskiego przez skanowane próbki (Rysunek 1F) i zmienić pomiary BMD i gęstości mineralnej tkanek (TMD). Każdy z tych błędów umieszczania spowoduje niską jakość skanowania, które nie powinno być dalej analizowane. Uzyskanie obrazów o niskiej jakości zmieni kwantyfikację cienkiej sieci beleczkowej i struktury korowej kończyny tylnej i da niewłaściwe lub niejednoznaczne dane14.

figure-results-1
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy umiejscowienia tylnej kończyny szczura i odpowiadające im nabyte obrazy bliższej kości piszczelowej w przekroju poprzecznym.
(A) Prawidłowe ułożenie tylnej kończyny szczura z kostką całkowicie unieruchomioną w pianie, wyprostowaną nogą i ogonem odciągniętym od kości piszczelowej zapewnia wystarczającą jakość obrazu w (B) przekroju kości piszczelowej i jej mikroarchitekturze beleczkowej i korowej. (C) Niewłaściwe ułożenie tylnej kończyny szczura z nogą nie w pełni wyprostowaną i kostką nie do końca unieruchomioną pianką może skutkować (D) artefaktami ruchowymi, widocznymi jako smugi w przekroju. (E) Obiekty zakłócające pole widzenia, takie jak ogon nie odciągnięty od kości piszczelowej (F) zakłócają tłumienie promieniowania rentgenowskiego z kości piszczelowej i mogą powodować zmiany w pomiarach BMD i TMD, chociaż nie są one widoczne wizualnie. Lewy dolny róg w panelu F pokazuje fragment ogona w polu widzenia, który zakłócał wiązkę promieniowania rentgenowskiego, która następnie przeszła przez kość piszczelową. Czerwone przerywane linie w lewych panelach wskazują przekrój poprzeczny prezentowany na prawych panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Izofluran anestezjologiczny. Jednostka anestezjologiczna z izofluranem skonfigurowana do dostarczania 3-4% izofluranu rozpuszczonego wO2 przy ciągłym natężeniu przepływu 1-2 l/min w celu indukcji znieczulenia ogólnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2. Zapewnienie głębokości znieczulenia. Zmierz odruchy pedałowania, ściskając palce u nóg szczura otrzymującego ciągły wziewny środek znieczulający przez maskę na twarz lub stożek nosowy. Reakcja bólowa jest bardziej widoczna, gdy noga jest lekko wyprostowana. Bardzo silne szczypanie lub użycie kleszczy lub zacisków może wywołać uszkodzenie tkanek i dlatego nie powinno być stosowane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3. Zrzut ekranu z widokiem z kamery monitorującej fizjologię na żywo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 4. Szczur leżący w pozycji leżącej na łóżku skanera z włókna węglowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 5. Prawa stopa szczura unieruchomiona w rurce z plastycznej pianki. Prawa stopa szczura jest unieruchomiona w rurce z plastycznej pianki, a palce u nóg wystają z rurki (nie na zdjęciu). Rurka piankowa jest umieszczona w plastikowym uchwycie (bardziej szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli określonych materiałów/wyposażenia). Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 6. Szczur zabezpieczony w pozycji z prawą nogą wyprostowaną prosto. Ogon i lewa stopa są oklejone taśmą z prawej nogi (w kierunku tułowia), biodra są zabezpieczone, a tułów szczura jest owinięty folią weterynaryjną (niebieska), aby ograniczyć utratę ciepła. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia widzom pierwsze szczegółowe wytyczne dotyczące prawidłowego znieczulenia, umieszczenia i unieruchomienia szczura podczas skanowania in vivo μCT kończyny tylnej. Wytyczne te umożliwiają użytkownikom systemów skanowania μCT in vivo uzyskanie wysokiej rozdzielczości i wysokiej jakości obrazów kości piszczelowej, które mogą być przetwarzane w celu ilościowego określenia trójwymiarowej mikroarchitektury kości. Krytyczne kroki w protokole niezbędne do zapewnienia prawidłowego ułożenia i unieruchomienia obejmują odpowiednie znieczulenie szczura, a także odsunięcie tylnej kończyny od wszystkich innych krytycznych struktur, aż będzie napięta, ale nie w nienaturalnej pozycji. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, konieczne jest, aby szczur został znieczulony do poziomu całkowitego relaksu i aby odruchy powiekowe i pedałowania zostały utracone. Ponadto noga skanująca powinna być wyprostowana, a cała stopa i kostka powinny być unieruchomione pianką. Opisane powyżej metody mające na celu osiągnięcie optymalnego umiejscowienia nogi skanującej zapewnią, że: 1) tylne kończyny szczurów w badaniu są konsekwentnie zorientowane w tym samym kierunku, umożliwiając w ten sposób przejście wiązki promieniowania rentgenowskiego przez ten sam obszar każdej nogi, gdy obraca się ona wokół próbki; 2) nie wystąpi zarówno dobrowolny, jak i mimowolny ruch kończyny tylnej, minimalizując w ten sposób możliwość ingerencji artefaktów ruchowych w jakość pozyskanych obrazów; 3) zapobiega się przeszkodom powodowanym przez obiekty (tj. ogon), minimalizując w ten sposób możliwość wystąpienia częściowych efektów objętości powodujących niedokładne pomiary BMD i TMD. Wytyczne te mogą być modyfikowane dla każdego szczura z osobna, ponieważ tempo metabolizmu i umiejscowienia izofluranu może się różnić w zależności od szczepu i wielkości ciała 22. Najpopularniejsze maszyny do skanowania in vivo są przeznaczone do małych modeli zwierzęcych (tj. myszy, szczurów, królików, świnek morskich) i będą miały wymienne etapy zwierzęce, aby umożliwić skanowanie zwierząt o różnych rozmiarach. Dzięki temu mogą pomieścić szeroki zakres mas ciała.

Chociaż skanowanie in vivo μCT pozwala na zmianę pozycji i ponowne zeskanowanie szczura, jeśli obrazy uzyskane z początkowego skanowania są słabej jakości, wielokrotne skanowanie wystawi szczura na dodatkowe dawki promieniowania i znieczulenie izofluranem przez dłuższy czas. Miesięczna powtarzająca się ekspozycja na promieniowanie wynosząca 600 mGy skoncentrowana na kości piszczelowej szczura w ciągu czterech miesięcy nie powoduje niekorzystnego wpływu na mikroarchitekturę kości w porównaniu z przeciwległą tylną kończyną 1, ale nie zapewnia to bezpieczeństwa dwóch skanów powtórzonych w bezpośrednim odstępie czasu. Do dalszych ograniczeń opisanej techniki należy konieczność napiętego kończyny tylnej za pomocą sił przyłożonych do niej w celu utrzymania jej w bezruchu, co może wywołać pewne zmiany w strukturze kości. Podczas gdy nasilenie unieruchomienia kończyny tylnej podczas skanowania będzie zależało od każdego celu badawczego, poprzednie badania z naszego laboratorium polegające na comiesięcznym powtarzaniu obrazowania μCT in vivo jednej kończyny tylnej wykazały różnicę w parametrze mikroarchitektonicznym kory mózgowej, ekscentryczności, w porównaniu z przeciwległą kończyną tylną, która nie uległa wielokrotnemu wyprostowi, Stabilizacja i skanowanie 1. Mimośród jest miarą eliptycznego kształtu kości korowej i zmian w odpowiedzi na zmienione obciążenie. W związku z tym, stosując tę metodę ustawiania i krępowania kończyny tylnej do wielokrotnego obrazowania μCT in vivo, należy wziąć pod uwagę przy ocenie i interpretacji zmian nośnych parametrów mikroarchitektonicznych.

Chociaż powyższe wytyczne zostały przedstawione w odniesieniu do obrazowania i analizy tkanki kostnej, należy dokonać niewielkich korekt protokołu podczas obrazowania tkanek miękkich kończyny tylnej. W szczególności należy wziąć pod uwagę sposób, w jaki kończyna tylna jest wyprostowana od tułowia i skrępowana, ponieważ obecna procedura zniekształca orientację tkanek miękkich (mięśni, tkanki tłuszczowej) w nieprawidłowym położeniu na czas trwania skanowania. W związku z tym, ekstrapolując ten model na potrzeby obrazowania tkanek miękkich kończyny tylnej, należy dokonać pewnych korekt w technice krępowania w celu zmniejszenia lub wyeliminowania zmian w położeniu tkanek względem siebie.

Co więcej, wytyczne zostały napisane specjalnie w oparciu o doświadczenia naszej grupy badawczej, jednak mogą być modyfikowane w celu dostosowania do innych dostępnych na rynku skanerów μCT in vivo . Inne sugerowane metody ustawiania i krępowania kończyny tylnej mogą być dostępne przez producenta systemu skanowania μCT in vivo . Większość dostępnych na rynku aparatów μCT in vivo wymienia polipropylen, polistyren ekspandowany i plastikowe rurki z woskiem dentystycznym do przytrzymywania wystającej stopy jako dopuszczalne materiały i metody krępowania nogi skanującej. Jednak metoda przedstawiona w tym protokole zapewnia bardziej kontrolowane i spójne pozycjonowanie i unieruchomienie skanowanej nogi oraz konsekwentnie zapewnia obrazy wysokiej jakości. Wytyczne przedstawione w niniejszej metodzie wymagają specjalistycznego sprzętu niezbędnego do znieczulenia szczura, takiego jak parownik, rurki, maski, komory indukcyjne i tlen. Chociaż sprzęt wiąże się z nieco wyższymi kosztami w porównaniu ze środkami znieczulającymi do wstrzykiwań, pozwala naukowcom na szybkie i precyzyjne wywołanie znieczulenia na określonych głębokościach świadomości, co zapewnia przewagę nad alternatywnymi metodami.

Korzystając z wytycznych przedstawionych w niniejszym filmie o metodzie, naukowcy wykorzystujący technologie μCT o wysokiej rozdzielczości in vivo do zbadania interesującej ich interwencji będą w stanie prawidłowo i konsekwentnie zorientować i unieruchomić tylną kończynę szczura w celu uzyskania wysokiej jakości obrazowania rentgenowskiego. Zapewni to ciągłość w dziedzinie pozyskiwania obrazów μCT in vivo i posłuży jako krok w kierunku optymalizacji spójności i dokładności w ramach badań oraz umożliwi porównania między badaniami w literaturze. Podobnie, te protokoły i metody mogą zostać rozszerzone do stosowania u innych gatunków gryzoni, w tym myszy, chociaż wymagane będą pewne zmiany 2,10. Na przykład unieruchomienie stopy w rurce piankowej może obejmować kostkę, aby zminimalizować możliwość ruchu nogi podczas skanowania. Dodatkowo cała stopa zmieści się w uchwycie na piankę. W ten sposób palce u nóg nie wystają poza koniec uchwytu, tak jak ma to miejsce podczas zabezpieczania stopy szczura. Ponadto ciało myszy nie wymaga takiego samego ograniczenia taśmą jak szczura. Mniejszy stożek nosowy może być użyty do utrzymania znieczulenia u myszy podczas skanowania. Jeśli mniejszy stożek nosowy nie jest dostępny, można przymocować rękawicę nitrylową do dostępnego stożka nosowego i wykonać małe nacięcie w rękawicy, aby zapewnić przestrzeń, która może pasować do nosa myszy, aby zapewnić znieczulenie, zachowując jednocześnie uszczelnienie wokół nosa.

Podczas gdy proksymalny obszar kości piszczelowej jest głównym miejscem badania zmian w mikrostrukturze kości u szczura, należy zbadać i ustalić wytyczne dotyczące prawidłowego i spójnego ułożenia innych miejsc szkieletowych, takich jak kość udowa i kręgi lędźwiowe, w celu zapewnienia spójności w literaturze. Jednak podejmując przyszłe badania obejmujące obrazowanie kręgów lędźwiowych, należy wziąć pod uwagę, ponieważ obrazowanie kręgosłupa zapewnia narażenie na promieniowanie otaczających narządów i tkanek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie badań z NSERC Discovery Grant (#05573) oraz Canada Foundation for Innovation (#222084) za finansowanie mikro-CT in vivo. W.E. Ward jest kanadyjskim kierownikiem Katedry Badań nad Rozwojem Kości i Mięśni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneFresenius Kabi Animal Health108737
WaporyzatorDispomed990-1091-3SINEWA
Dispomed985-1005-000
Skaner mikrotomografii komputerowejBruker microCTSkyScan 1176
Wosk dentystycznyKerr Dental Laboratory623
Pianka (Backer Pręt)RonaCF120861" x10'
Rurka z tworzywa sztucznegoBruker microCTSP-3010
Łóżko z włókna węglowegoBruker microCTSP-3002
Vet Wrap/BandageDura-Tech17473
Żel okulistycznyOptixCare006CLC-4256Bezantybiotykowa
poduszka grzewczaSunbeam000731-500-000
Filtry zmiatające/węglowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats. Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).
  2. Sacco, S. M., et al. Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice. Bonekey Rep. 6, 855(2017).
  3. Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats. J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).
  4. Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning. Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).
  5. Laperre, K., et al. Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects. Bone. 49 (4), 613-622 (2011).
  6. Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans. J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).
  7. Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats. J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).
  8. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  9. Longo, A. B., et al. Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats. Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).
  10. Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring. Nutrients. 9 (3), 250(2017).
  11. Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT. Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).
  12. De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring. Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).
  13. Perilli, E., et al. Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats. Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).
  14. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  15. Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details. Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).
  16. Campbell, G. M., Sophocleous, A. Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies. Bonekey Rep. 3, 564(2014).
  17. Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).
  18. Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection. Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).
  19. Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats. BMC Vet Res. 10, 198(2014).
  20. Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs. PLoS One. 11 (9), e0161258(2016).
  21. Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. , Available from: http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf (1993).
  22. Stevens, W. C., et al. Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals. Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrotomografia komputerowa micro CT in vivopozycjonowanie ko czyny tylnej szczuraobrazowanie proksymalnej cz ci ko ci piszczelowejprotok sedacji i znieczuleniaunieruchomienie w rurce z piankiaplikacja wosku dentystycznegomocowanie ta m maskuj cpod u ne badania obrazowemonitorowanie ekspozycji na promieniowanie

Powiązane artykuły