Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

Summary

Przedstawiamy protokół do preparowania przysadki mózgowej i przygotowania przekrojów przysadki koronalnej od rozwijających się myszy.

Abstract

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony niezbędne dla homeostazy. Składa się z dwóch gruczołów o odrębnym pochodzeniu i funkcjach embrionalnych - przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Rozwijająca się przysadka mózgowa myszy jest malutka i delikatna o wydłużonym owalnym kształcie. Preferowany jest przekrój koronalny, aby wyświetlić zarówno przysadkę adenoprzysadkową, jak i przysadkę nerwową w jednym wycinku przysadki myszy.

Celem tego protokołu jest uzyskanie prawidłowych odcinków koronalnych przysadki mózgowej z dobrze zachowanymi architekturami tkanek od rozwijających się myszy. W tym protokole szczegółowo opisujemy, jak prawidłowo wypreparować i przetworzyć przysadkę mózgową od rozwijających się myszy. Po pierwsze, myszy są utrwalane przez przezsercową perfuzję formaldehydu przed preparacją. Następnie stosuje się trzy różne techniki preparacyjne w celu uzyskania nienaruszonej przysadki mózgowej w zależności od wieku myszy. W przypadku płodów myszy w wieku embrionalnym (E) 17,5 - 18,5 i noworodków do 4 dni preparuje się całe obszary siodła, w tym kość klinową, gruczoł i nerwy trójdzielne. W przypadku szczeniąt w wieku poporodowym (P) 5 - 14 przysadki mózgowej połączone z nerwami trójdzielnymi są preparowane jako całość. W przypadku myszy w wieku powyżej 3 tygodni przysadka mózgowa jest starannie wycinana z otaczających tkanek. Pokazujemy również, jak osadzić przysadkę mózgową we właściwej orientacji, wykorzystując otaczające tkanki jako punkty orientacyjne, aby uzyskać satysfakcjonujące odcinki koronalne. Metody te są przydatne w analizie histologicznych i rozwojowych cech przysadki mózgowej u rozwijających się myszy.

Introduction

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony odpowiedzialne za homeostazę^1,2. Anatomicznie przysadka mózgowa jest strukturą "dwa w jednym" składającą się z przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Części te mają różne pochodzenie embrionalne i funkcjonują bardzo różnie. Przysadka nerwowa wywodzi się z ektodermy nerwowej i wydziela oksytocynę i hormon antydiuretyczny. Przysadka gruczołowa wywodzi się z torebki Rathkego i jest odpowiedzialna za uwalnianie hormonów, w tym hormonu wzrostu, prolaktyny, hormonu stymulującego tarczycę, hormonu folikulotropowego, hormonu luteinizuj....

Protocol

myszy C57BL/6 są hodowane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie metody eksperymentalne na zwierzętach są zgodne z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Drugiego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Rozwarstwienie rozwijającej się przysadki mózgowej po urodzeniu

1. Wykonaj znieczulenie: Umieść nowonarodzone myszy (P0 - P5) na kruszonym lodzie, aby wywołać hipotermię. W przypadku myszy w wieku powyżej 5 dni należy wstrzyknąć 5% uretanu (30 μl/g masy ciała) dootrzewnowo w celu wywołania znieczulenia. Oceń reakcje na szczypanie ogona/palców u nóg. Kontynuuj tylko wtedy, gdy mys....

Results

Ten protokół przedstawia metodę preparowania przysadki mózgowej od rozwijających się myszy. W przypadku nowonarodzonej myszy z podstawy czaszki wycięto całe obszary siodła zawierające przysadkę mózgową, nerwy trójdzielne i znajdującą się pod spodem kość klinową. Maleńka i delikatna przysadka mózgowa pozostała nienaruszona podczas tego procesu (Ryc. 1A). W przypadku myszy starszych niż 5 dni następnie wyizolowano przysadkę mózgową przyczepioną do bocznych nerwów trójdzi.......

Discussion

W przypadku rozwijających się mysich przysadek mózgowych uzyskanie odpowiednich przekrojów koronalnych było technicznie trudne ze względu na ich drobne i delikatne cechy oraz unikalne cechy anatomiczne ^6,8. Niektóre grupy badawcze wybrały więc wycinki środkowe do analizy morfologii przysadki embrionalnej i noworodkowej^11,12. Chociaż środkowa część przysadki mózgowej jest również w stanie pokazać przednie,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Narzędzia/Sprzęt
Nożyczki chirurgiczne proste	JinZhong	J21010	można kupić od innych dostawców
Cienkie nożyczki	JinZhong	WA1010	można kupić od innych dostawców
kleszcze	JinZhong	JD1020	można kupić od innych dostawców
Drobne kleszcze	Dumont	RS-5015	do izolacji
igły przysadki mózgowej 26G (0,45 mm)	HongDa		do perfuzji przezsercowej
Strzykawka (1 ml)	BD	300841	można kupić od innych dostawców
Strzykawkę (10 ml)	BD		można kupić u innych dostawców
Talerz 35 mm	Corning	430165	można kupić u innych dostawców
Papier do czyszczenia soczewek	ShuangQuan		można kupić u innych dostawców
Mikroskop anatomiczny	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	można kupić u innych dostawców
Kaseta do zatapiania	Thermo Fisher	22-272423	można kupić od innych dostawców
System konsoli do zatapiania tkanek	KEDEE	KD-BM11	można kupić od innych dostawców
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	można kupić u innych dostawców
Prowadnice Superfrost-Plus	Thermo Fisher	22-037-246	można kupić od innych dostawców
Szkło nakrywkowe	Thermo Fisher	12-543	można kupić od innych dostawców
Mikroskop fluorescencyjny	OLYMPUS	BH2-RFCA	można kupić od innych dostawców
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	dla PBS
KCl	Sigma	P9541	dla PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	dla PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	dla PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparyna Sodowa do wstrzykiwań	SPH	H31022051	do perfuzyjnej soli fizjologicznej
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148
Etanol	SCR	10009218
Ksylen	SCR	10023418
Parafina	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	dla H& E barwienie
Eosin Y	Sigma	E4009	dla H& E barwienie
królika hormon przeciw wzrostowi (GH)	Narodowy hormon		do immunologicznego przeciwciała barwiącego
	Program
Królicze przeciwciało anty-mysie GFAP	Sigma	G9269	do barwienia immunologicznego
Kozioł anty-królik IgG, HRP	Jackson	111-035-003	do barwienia immunologicznego
System TSA	NEN Produkty z zakresu nauk przyrodniczych	NEL700	do barwienia immunologicznego
Streptawidyny, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	do barwienia immunologicznego
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	do barwienia immunologicznego