Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do preparowania przysadki mózgowej i przygotowania przekrojów przysadki koronalnej od rozwijających się myszy.

Streszczenie

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony niezbędne dla homeostazy. Składa się z dwóch gruczołów o odrębnym pochodzeniu i funkcjach embrionalnych - przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Rozwijająca się przysadka mózgowa myszy jest malutka i delikatna o wydłużonym owalnym kształcie. Preferowany jest przekrój koronalny, aby wyświetlić zarówno przysadkę adenoprzysadkową, jak i przysadkę nerwową w jednym wycinku przysadki myszy.

Celem tego protokołu jest uzyskanie prawidłowych odcinków koronalnych przysadki mózgowej z dobrze zachowanymi architekturami tkanek od rozwijających się myszy. W tym protokole szczegółowo opisujemy, jak prawidłowo wypreparować i przetworzyć przysadkę mózgową od rozwijających się myszy. Po pierwsze, myszy są utrwalane przez przezsercową perfuzję formaldehydu przed preparacją. Następnie stosuje się trzy różne techniki preparacyjne w celu uzyskania nienaruszonej przysadki mózgowej w zależności od wieku myszy. W przypadku płodów myszy w wieku embrionalnym (E) 17,5 - 18,5 i noworodków do 4 dni preparuje się całe obszary siodła, w tym kość klinową, gruczoł i nerwy trójdzielne. W przypadku szczeniąt w wieku poporodowym (P) 5 - 14 przysadki mózgowej połączone z nerwami trójdzielnymi są preparowane jako całość. W przypadku myszy w wieku powyżej 3 tygodni przysadka mózgowa jest starannie wycinana z otaczających tkanek. Pokazujemy również, jak osadzić przysadkę mózgową we właściwej orientacji, wykorzystując otaczające tkanki jako punkty orientacyjne, aby uzyskać satysfakcjonujące odcinki koronalne. Metody te są przydatne w analizie histologicznych i rozwojowych cech przysadki mózgowej u rozwijających się myszy.

Wprowadzenie

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony odpowiedzialne za homeostazę^1,2. Anatomicznie przysadka mózgowa jest strukturą "dwa w jednym" składającą się z przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Części te mają różne pochodzenie embrionalne i funkcjonują bardzo różnie. Przysadka nerwowa wywodzi się z ektodermy nerwowej i wydziela oksytocynę i hormon antydiuretyczny. Przysadka gruczołowa wywodzi się z torebki Rathkego i jest odpowiedzialna za uwalnianie hormonów, w tym hormonu wzrostu, prolaktyny, hormonu stymulującego tarczycę, hormonu folikulotropowego, hormonu luteinizującego, hormonu adrenokortykotropowego i hormonu stymulującego melanocyty^3,4,5.

Przysadka mózgowa spoczywa na grzbietowej powierzchni kości klinowej (sella turcica) czaszki myszy i jest przymocowana do podłogi mózgu za pomocą delikatnej łodygi. Jest otoczony bocznie nerwami trójdzielnymi, a z przodu skrzyżowaniem wzrokowym^6,7. Gruczoł ma wydłużony owalny kształt z długą osią prostopadłą do głowy głowy. Na jego grzbietowej powierzchni przysadkę nerwową i przysadkę przysadkową można łatwo odgraniczyć, przy czym pierwsza zajmuje grzbietową część przyśrodkową, a druga rozciąga się bocznie i brzusznie. Podczas rozwoju postnatalnego rozmiar przysadki gwałtownie wzrasta w pierwszym miesiącu po urodzeniu^8,9. Niemniej jednak, przysadka mysza jest nadal bardzo mała ze średnią wagą 1,9 mg i długą średnicą osi ~3 mm u dorosłych¹⁰, średnicą długiej osi 2 - 2,5 mm w 21 dniu po urodzeniu (P21) i tylko 1 - 1,5 mm w P0.

Preferowany jest przekrój koronalny do wyświetlania zarówno przysadki adhenohypophysis, jak i neurohypophysis w jednym wycinku przysadki myszy. Jednak wymagane są pewne umiejętności techniczne, aby uzyskać satysfakcjonujące odcinki koronalne przysadki mózgowej od rozwijających się myszy ze względu na jej wyjątkowo mały rozmiar i wyraźną anatomię. W tym artykule wideo pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję przysadki mózgowej myszy i przygotować przekroje koronalne przysadki na różnych etapach rozwoju.

Protokół

myszy C57BL/6 są hodowane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie metody eksperymentalne na zwierzętach są zgodne z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Drugiego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Rozwarstwienie rozwijającej się przysadki mózgowej po urodzeniu

1. Wykonaj znieczulenie: Umieść nowonarodzone myszy (P0 - P5) na kruszonym lodzie, aby wywołać hipotermię. W przypadku myszy w wieku powyżej 5 dni należy wstrzyknąć 5% uretanu (30 μl/g masy ciała) dootrzewnowo w celu wywołania znieczulenia. Oceń reakcje na szczypanie ogona/palców u nóg. Kontynuuj tylko wtedy, gdy mysz przestanie reagować na szkodliwe bodźce.
2. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach (leżąc na plecach twarzą do góry), delikatnie przyklejając przednie i tylne łapy do powierzchni roboczej, którą można przypiąć (np. styropianu) do okapu oparów chemicznych.
3. Wykonaj perfuzję przezsercową.
   1. Przetnij klatkę piersiową myszy nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić serce (i inne narządy klatki piersiowej).
   2. Zabezpiecz bijące serce kleszczami i włóż igłę 26G (0,45 mm) do lewej komory. Igła jest przymocowana do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS; uzupełnionym 5 mg/ml azotynu sodu i 10 U/ml heparyny, pH 7,4, podgrzanym do 37 °C przed użyciem). Natychmiast przetnij prawy przedsionek cienkimi nożyczkami i zacznij perfuzjować ciało ciepłym PBS, aż płyn wychodzący z prawego przedsionka będzie czysty.
      UWAGA: Dla nowonarodzonych myszy potrzeba około 5 - 10 ml PBS i 10 - 20 ml PBS dla dorosłych myszy.
   3. Utrzymać igłę na miejscu i zmienić ją na inną strzykawkę wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA; pH 7,4). Wykonaj 10 ml i 20 ml utrwalacza odpowiednio dla noworodków i myszy P21.
      Uwaga: PFA jest toksyczny. Może powodować podrażnienia skóry i dróg oddechowych oraz uszkodzenie oczu. Nosić rękawice i pracować pod kapturem chemicznym.
4. Odetnij głowę myszy z PFA i rozetnij kość czaszki nożyczkami.
   1. Delikatnie unieś tyłomózgowie z podstawy czaszki za pomocą małych kleszczy. Przy pierwszych oznakach siodła turcica przestań podnosić, ale przytrzymaj tyłomózgowie, odetnij łodygę przysadki mózgowej i włókna nerwowe łączące się z podstawą mózgu cienkimi nożyczkami. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że przysadka mózgowa nie jest podnoszona z mózgu.
   2. Następnie kontynuuj podnoszenie mózgu i usuń cały mózg, aby w pełni odsłonić przysadkę mózgową. Wytnij nożyczkami cały obszar siodła, w tym przysadkę mózgową, boczne nerwy trójdzielne i dolną kość klinową (około 3 x 5 mm²).
5. Umieść wypreparowaną tkankę w naczyniu o średnicy 35 mm lub w jednym dołku na 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml zimnego 4% PFA (pH 7,4). Utrwalić tkankę w temperaturze 4 °C przez 40 minut dla przysadek P0 - P7, 1 godzinę dla przysadek P14, 1,5 godziny dla przysadek P21 - P28 i 3 godziny dla przysadek dorosłych.
6. Dalsza dysocjacja przysadki mózgowej
   1. Przemyj utrwaloną tkankę 10 ml PBS, 5 zmian po 15 minut każda. Przysadka mózgowa noworodka wraz z otaczającymi ją tkankami i dolną kością klinową może być przetwarzana bezpośrednio do odwodnienia. Jednak przysadka mózgowa myszy starszych niż 5 dni powinna być dalej dysocjowana pod mikroskopem stereoskopowym.
   2. Utrwaloną tkankę umieścić w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 1 ml PBS. W przypadku przysadek P5 - P14 usuń błony łączne między nerwami a kością za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek i ostrożnie odizoluj przysadkę mózgową wraz z bocznymi nerwami trójdzielnymi jako całością, pozostawiając siodło tureckie. Izolowany gruczoł i nerwy są połączone błonami łącznymi o wyglądzie podobnym do litery "H" (Ryc. 1B).
   3. W przypadku P21 i przysadki mózgowej u dorosłych należy usunąć nerwy i błony łączne wokół przysadki mózgowej i uwolnić gruczoł z otaczających tkanek. Owiń tkankę przysadki mózgowej chusteczką do czyszczenia soczewek i włóż ją do kasety do zatapiania.
      UWAGA: Owinięcie maleńkiej przysadki bibułką do czyszczenia soczewek pomaga zapobiec potencjalnej utracie próbek i zachować integralność tkanek w następującej procedurze zatapiania parafiny. Owijanie przysadki mózgowej może nie być konieczne, jeśli jest ona przetwarzana w małej butelce w procedurze kriozatapiania.

2. Osadzanie i cięcie parafiny

1. Odwodnić próbki w kasetach do zatapiania z 50%, 65%, 75% i 95% roztworami etanolu przez 15 minut każda. Następnie odwodnić za pomocą 3 podmian czystego etanolu, po 3 minuty dla gruczołów P0 - P4, po 4 minuty dla gruczołów P5 - P14 i po 5 minut dla gruczołów P21 i starszych. Wyczyść ksylenem, 3 przemiany, po 3 minuty dla gruczołów P0 - P4, po 4 minuty dla gruczołów P5 - P14 i po 5 minut dla gruczołów P21 i starszych. Naciekać stopionym woskiem parafinowym, 3 przemiany, po 7 minut dla gruczołów P0 - P4 i dwukrotnie 8 minut, a następnie 6 minut raz dla gruczołów P5 i starszych.
   UWAGA: Optymalne parametry przetwarzania tkanek można dostosować empirycznie. Aby uzyskać wysokiej jakości sekcje, należy unikać niewystarczającego lub nadmiernego odwodnienia. To samo dotyczy oczyszczania tkanki za pomocą ksylenu.
2. Orientacja podczas osadzania
   1. Na konsoli do zatapiania tkanek wyjmij próbkę z kasety i umieść ją w formie bazowej wypełnionej do połowy stopionym woskiem parafinowym. Właściwa orientacja osadzającej się przysadki mózgowej jest niezbędna do zaspokojenia odcinków koronalnych.
   2. W przypadku P21 i przysadki mózgowej osoby dorosłej należy ustawić przysadkę mózgową tak, aby jej krótka oś była prostopadła do dolnej powierzchni formy podstawowej (płaszczyzny przekroju). Użyj kości klinowych i nerwów trójdzielnych jako anatomicznych punktów orientacyjnych odpowiednio dla przysadek P0 - P4 i P5 - P14. Zorientuj próbki za pomocą nerwów trójdzielnych lub blaszki poprzecznej kości klinowych prostopadłych do dolnej powierzchni formy podstawowej.
   3. Delikatnie przytrzymaj tkankę w żądanej pozycji za pomocą rozgrzanych cienkich kleszczyków, aż wosk stanie się półstały na płytce chłodzącej. Uzupełnij formę stopionym woskiem parafinowym. Pozwól blokowi parafiny ostygnąć, aż wosk całkowicie zastygnie.
      UWAGA: Przysadka mózgowa w 18,5 dniu zarodkowym (E18,5) może być leczona w taki sam sposób, jak przysadka u noworodka. Ale przysadki (woreczki Rathkego) młodsze niż E16,5 powinny być osadzone całą głową i zorientowane z osią strzałkową (od ust do potylicy) prostopadłą do dolnej powierzchni formy podstawowej.
3. Schłodzić blok parafiny w temperaturze -20 °C przez 10 - 20 minut, a następnie pokroić go w cienkie plasterki (preferowana grubość 4 μm) za pomocą mikrotomu. Aby uzyskać zadowalające przekroje koronalne, należy dostroić położenie bloków parafinowych podczas cięcia. Zamontuj plastry chusteczki na szkiełkach pokrytych polilizyną, aby zapobiec odklejaniu się plastrów podczas wykonywania następujących procedur.
   UWAGA: Alternatywnie, próbki można odwodnić w 15%, 30% (w/v) roztworach sacharozy (w PBS) w temperaturze 4 °C, aż opadną na dno, zatopić w związku do zatapiania w krioprocesie przy użyciu tej samej metody orientacji i szybko zamrozić na suchym lodzie. Następnie pokrój zamrożone bloki tkanek na plastry o wielkości 8 - 10 μm za pomocą kriostatu. Morfologia kriosekcji jest jednak często gorsza od sekcji parafinowych.

3. Barwienie H&E i znakowanie immunofluorescencyjne

1. Podgrzej szkiełka na bloku grzewczym w temperaturze 55 °C i odwoskuj ksylenem, 2 przemiany po 4 minuty każda. Odwodnić próbki 95% etanolem dwa razy i 75% etanolem dwa razy po 3 minuty każde. Myj szkiełka wodą destylowaną przez 5 minut na shakerze.
2. W przypadku barwienia H&E należy zabarwić skrawki w roztworze ałunu hematoksyliny przez 6 minut, płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty, różnicować 0,2% wodą amoniakalną przez 45 s i ponownie płukać pod bieżącą wodą przez 2 minuty. Następnie odwodnić skrawki 95% etanolem przez 1 min i zabarwić eozyną przez 2 min. Sekwencyjnie odwodnić, wyczyścić i zamontować.
3. Znakowanie immunofluorescencyjne
   1. Traktuj skrawki metanolem zawierającym 3%_H2O2i 0,01%_NaN3 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu dezaktywacji endogennych peroksydaz. Odzyskać antygeny przez gotowanie skrawków w buforze do pobierania (1 mM EDTA i 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) w szybkowarze przez 2 minuty. Inkubować skrawki z buforem blokującym (5% surowicy koziej w PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   2. Inkubować skrawki z przeciwciałem przeciwko hormonowi wzrostu (GH) królika (1:2 000) lub przeciwciałem przeciwko glejowemu kwasowemu białku fibrylarnemu (GFAP) (1:2 000) rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-królicze IgG-HRP, 1:300 w buforze blokującym) przez 35 minut w temperaturze 37 °C.
   4. Wzmacniaj sygnały za pomocą biotynylu tyramidu (1:50 w buforowanej soli fizjologicznej Tris zawierającej 0,3%_H2O2) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i wizualizuj za pomocą Streptavidin-Alexa594 lub 488 (1:300 w buforze blokującym, 30 min, 37 °C).
   5. Przeciwbarwić jądra DAPI (50 mg/L w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Może nie być konieczne wzmacnianie sygnału za pomocą systemu Tyramide Signal Amplification (TSA). Alternatywnie, do wizualizacji sygnału można użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorescencją.
4. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestawy filtrów DAPI, Texas Red i FITC, obiektywów ×4/0,13 do ×40/0,75 i kamery o rozdzielczości 5,0 megapikseli. Użyj długości fal lasera 360, 488 i 594 nm do obrazowania odpowiednio sekcji barwionych DAPI, Alexa 488 i Alexa 594. Zoptymalizuj moc lasera (ogólnie używano 0,8) i czas ekspozycji do pożądanych poziomów dla każdego kanału. Uchwyć obraz pod kontrolą oprogramowania do akwizycji obrazu, a następnie nałóż obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia metodę wypreparowywania przysadek z rozwijających się myszy. W przypadku myszy noworodkowej z podstawy czaszki wypreparowano całe regiony siodła tureckiego zawierające przysadkę, nerwy trójdzielne oraz znajdującą się pod nimi kość klinową. Mała i delikatna przysadka pozostała nienaruszona podczas tego procesu (Rysunek 1A). W przypadku myszy starszych niż 5 dni wyizolowano następnie przysadki przytwierdzone do bocznych gałęzi ner...

Dyskusja

W przypadku rozwijających się mysich przysadek mózgowych uzyskanie odpowiednich przekrojów koronalnych było technicznie trudne ze względu na ich drobne i delikatne cechy oraz unikalne cechy anatomiczne ^6,8. Niektóre grupy badawcze wybrały więc wycinki środkowe do analizy morfologii przysadki embrionalnej i noworodkowej^11,12. Chociaż środkowa część przysadki mózgowej jest również w stanie pokazać przednie,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narzędzia/Sprzęt
Nożyczki chirurgiczne proste	JinZhong	J21010	można kupić od innych dostawców
Cienkie nożyczki	JinZhong	WA1010	można kupić od innych dostawców
kleszcze	JinZhong	JD1020	można kupić od innych dostawców
Drobne kleszcze	Dumont	RS-5015	do izolacji
igły przysadki mózgowej 26G (0,45 mm)	HongDa		do perfuzji przezsercowej
Strzykawka (1 ml)	BD	300841	można kupić od innych dostawców
Strzykawkę (10 ml)	BD		można kupić u innych dostawców
Talerz 35 mm	Corning	430165	można kupić u innych dostawców
Papier do czyszczenia soczewek	ShuangQuan		można kupić u innych dostawców
Mikroskop anatomiczny	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	można kupić u innych dostawców
Kaseta do zatapiania	Thermo Fisher	22-272423	można kupić od innych dostawców
System konsoli do zatapiania tkanek	KEDEE	KD-BM11	można kupić od innych dostawców
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	można kupić u innych dostawców
Prowadnice Superfrost-Plus	Thermo Fisher	22-037-246	można kupić od innych dostawców
Szkło nakrywkowe	Thermo Fisher	12-543	można kupić od innych dostawców
Mikroskop fluorescencyjny	OLYMPUS	BH2-RFCA	można kupić od innych dostawców
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	dla PBS
KCl	Sigma	P9541	dla PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	dla PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	dla PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparyna Sodowa do wstrzykiwań	SPH	H31022051	do perfuzyjnej soli fizjologicznej
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148
Etanol	SCR	10009218
Ksylen	SCR	10023418
Parafina	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	dla H& E barwienie
Eosin Y	Sigma	E4009	dla H& E barwienie
królika hormon przeciw wzrostowi (GH)	Narodowy hormon		do immunologicznego przeciwciała barwiącego
	Program
Królicze przeciwciało anty-mysie GFAP	Sigma	G9269	do barwienia immunologicznego
Kozioł anty-królik IgG, HRP	Jackson	111-035-003	do barwienia immunologicznego
System TSA	NEN Produkty z zakresu nauk przyrodniczych	NEL700	do barwienia immunologicznego
Streptawidyny, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	do barwienia immunologicznego
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	do barwienia immunologicznego

przysadki