Artykuł metodologiczny

Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej

DOI:

10.3791/56364

⸱

29 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University, 2Johns Hopkins Physical Sciences - Oncology Center, Johns Hopkins University, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 4Departments of Oncology and Pathology and Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie nad tym, jak podział komórek ssaków jest regulowany w środowisku 3D, pozostaje w dużej mierze niezbadane, pomimo jego fizjologicznego znaczenia i terapeutycznego znaczenia. Możliwymi przyczynami braku eksploracji są ograniczenia eksperymentalne i wyzwania techniczne, które sprawiają, że badanie podziału komórek w hodowli 3D jest nieefektywne. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na obrazowaniu, która skutecznie bada podział komórek ssaków i interakcje komórka-macierz w matrycach kolagenowych 3D. Komórki znakowane fluorescencyjnym H2B są synchronizowane przy użyciu kombinacji blokowania tymidyny i leczenia nokodazolem, a następnie techniki mechanicznego wytrząsania. Zsynchronizowane komórki są następnie osadzane w matrycy kolagenowej 3D. Podział komórek jest monitorowany za pomocą mikroskopii żywych komórek. Deformacja włókien kolagenowych podczas i po podziale komórki, która jest wskaźnikiem interakcji komórka-macierz, może być monitorowana i określana ilościowo za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej. Metoda ta zapewnia skuteczne i ogólne podejście do badania podziałów komórek ssaków i interakcji komórka-macierz w fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Podejście to nie tylko dostarcza nowych informacji na temat molekularnych podstaw rozwoju prawidłowych tkanek i chorób, ale także pozwala na projektowanie nowatorskich podejść diagnostycznych i terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitoza komórkowa jest krytycznym wydarzeniem w życiu komórkowym, którego regulacja odgrywa kluczową rolę w rozwoju tkanek i narządów. Nieprawidłowa mitoza jest związana z naturalnymi zmianami genetycznymi, procesami starzenia się człowieka i postępem raka1,2,3,4,5. Zwiększone tempo proliferacji komórek nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami jest jedną z cech charakterystycznych raka, pomimo faktu, że zachowania komórek są dość niejednorodne wśród różnych typów nowotworów, a nawet wśród pacjentów. Pomimo obiecujących wyników przedklinicznych, niektóre nowo opracowane leki antymitotyczne nie okazały się skuteczne w badaniach klinicznych6,7,8,9,10,11. Należy wziąć pod uwagę znaczenie modeli eksperymentalnych i przedklinicznych. Wiele typów normalnych komórek ssaków i nowotworów dzieli się w trójwymiarowych (3D) matrycach, takich jak fibroblasty i komórki włókniakomięsaka w tkankach łącznych 3D bogatych w kolagen I oraz przerzutowe komórki rakowe w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej zrębu (ECM). Jednak zdecydowana większość eksperymentów i testów podziału komórek ssaków została przeprowadzona na komórkach hodowanych na dwuwymiarowych (2D) podłożach. Zaprojektowana matryca 3D może lepiej podsumować mikrostrukturę, właściwości mechaniczne i sygnały biochemiczne ECM 3D zarówno normalnych, jak i patologicznych tkanek12,13,14,15,16,17.

Badanie regulacji podziału komórek ssaków w środowiskach 3D pozostaje w dużej mierze niezbadane, pomimo zarówno znaczenia fizjologicznego, jak i terapeutycznego18,19. Możliwe przyczyny to trudności techniczne i wyzwania eksperymentalne związane z badaniem podziału komórek w matrycach 3D. Mitoza komórkowa stanowi niewielką frakcję czasową w całym cyklu komórkowym20. Wcześniejsze prace wykazały, że tempo proliferacji wielu komórek ssaków, takich jak ludzki gruczolakorak piersi MCF-7, ludzki kostniakomięsak U2OS i ludzka wątroba HepG2, jest znacznie niższe w matrycach 3D w porównaniu z ich odpowiednikami na podłożach 2D21,22. Co więcej, komórki osadzone w matrycach 3D poruszają się i znikają z ostrości podczas obrazowania żywych komórek. Wszystkie te czynniki przyczyniają się do wyjątkowo niskiej skuteczności wychwytywania zdarzeń podziału komórek w hodowli 3D przy użyciu technik obrazowania.

Interakcje między ECM a komórkami odgrywają kluczową rolę w regulacji podziałów komórkowych. W tym miejscu opisujemy podejście do efektywnego badania podziału komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D. Metoda obejmuje wprowadzanie markerów mitotycznych do komórek, synchronizację podziału komórek, a także monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D przy użyciu techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną oraz analizę obrazowania ilościowego. Znakowane fluorescencyjnie białko histonowe H2B jest najpierw wprowadzane do komórek jako marker różnicowania komórek mitotycznych i interfazowych. Następnie komórki są synchronizowane za pomocą kombinacji blokowania tymidyny i leczenia nokodazolem, a następnie techniki mechanicznego wytrząsania. Zsynchronizowane komórki są następnie bezpośrednio kapsułkowane w matrycach kolagenowych 3D. Zdarzenia podziału wielu komórek są skutecznie monitorowane za pomocą poklatkowego obrazowania żywych komórek w małym powiększeniu. Deformacja włókien kolagenowych, która jest wskaźnikiem interakcji komórka-macierz, jest monitorowana za pomocą konfokalnej mikroskopii refleksyjnej w dużym powiększeniu.

Wcześniej używaliśmy tej techniki do monitorowania i ilościowego określania interakcji komórka-matryca przed, w trakcie i po mitozie dwóch przerzutowych linii komórkowych raka, ludzkiego inwazyjnego raka przewodowego MDA-MB-231 i ludzkich komórek włókniakomięsaka HT1080, w matrycach kolagenowych 3D19. Przedstawione tutaj metody zapewniają skuteczne i ogólne podejście do badania zarówno podziału komórek ssaków w środowisku 3D, jak i interakcji komórka-macierz. Linia komórkowa MDA-MB-231 jest używana jako przykład w całym artykule. Protokół ten dostarcza nowych informacji na temat molekularnych podstaw rozwoju prawidłowych tkanek i chorób, a także może pozwolić na zaprojektowanie nowatorskich podejść diagnostycznych i terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczony protokół jest zgodny z wytycznymi The Homewood Institutional Review Board (HIRB).

1. Stabilna ekspresja H2B-mCherry jako markera mitozy komórkowej

  1. Wytwarzanie cząstek lentiwirusa z ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T (HEK 293T)
    1. Umieścić komórki HEK 293T na 10-centymetrowej szalce do hodowli komórkowej o gęstości 5 x 106 komórek/szalkę w pożywce do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca wysoką zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep)). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2 ). Pożądane zlanie komórek w dniu transfekcji wynosi około 70 - 80%.
      UWAGA: Komórki HEK 293T są tutaj wykorzystywane do produkcji cząstek wirusa, które zostaną później wykorzystane do transdukcji komórek MDA-MB-231 w celu wytworzenia linii komórkowej stabilnie eksprymującej H2B-mCherry. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na całej płytce. Dodawanie komórek kroplami do płytki i delikatne przesuwanie płytki do przodu iz powrotem może pomóc w równomiernym rozprowadzeniu. Komórki można również wysiewać na płytkach lub kolbach o innych rozmiarach, co spowoduje zebranie różnych objętości cząstek wirusa.
    2. Transfekcja komórek HEK 293T za pomocą odczynnika do transfekcji z trzema plazmidami (wektor lentiwirusowy, CMV ΔR 8,91 i pMDG-VSVG). Plazmid kodujący H2B-mCherry jest klonowany w wektorze lentiwirusowym z promotorem kinazy fosfoglicerynianowej (PGK). CMV ΔR 8.91 zawiera trzy wymagane geny HIV: gag, pol i rev. pMDG-VSVG zawiera gen otoczki VSV-G.
      UWAGA: Do wyboru jest wiele środków do transfekcji.
      1. Przed użyciem należy odczekać, aż fiolka z odczynnikiem do transfekcji osiągnie temperaturę pokojową (RT). Odwrócić lub krótko zawirować fiolkę.
      2. Wymieszaj 16 μg DNA, który składa się z 6 μg plazmidu H2B-mCherry, 8 μg CMV ΔR 8,91 i 2 μg pMDG-VSVG w 1 ml zredukowanej pożywki surowicy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
        UWAGA: Ilość i stosunek trzech wektorów jest zróżnicowany i zoptymalizowany dla różnych wektorów przenoszenia lentiwirusa.
      3. Dodać 48 μl (stosować odczynnik do transfekcji 1:3) odczynnika do transfekcji do powyższego roztworu DNA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
        UWAGA: Stosunek odczynnika do transfekcji DNA jest zróżnicowany i zoptymalizowany dla różnych wektorów przenoszenia lentiwirusa. Upewnij się, że odczynnik do transfekcji nie styka się z bokiem probówki wirówkowej o pojemności 1.5 ml.
      4. Dodać kroplami do komórek roztwór kompleksu DNA-lipid sporządzony w kroku 1.1.2.3. Delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie kompleksu w płytce.
    3. Około 6 godzin po transfekcji odessać pożywkę i dodać świeże podłoże do hodowli komórkowych (DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep).
    4. Zebrać supernatant 24, 48 i 72 godziny po transfekcji. Wymieniaj pożywkę po każdym zbiorze (DMEM, 4,5 g/L glukozy, pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep).
    5. Przefiltruj cząsteczki lentiwirusa przez filtr 0,45 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Alternatywnie, odkręć supernatant, aby oddzielić resztki komórek. Supernatant może być od razu użyty do transdukcji lub może być przechowywany w temperaturze -80 °C.
  2. Generowanie linii komórkowych stabilnie eksprymujących H2B-mCherry
    UWAGA: Ten protokół jest szczegółowo opisany dla komórek MDA-MB-231. Przed użyciem w eksperymencie ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231 (Centrum Onkologii Nauk Fizycznych, NIH) są hodowane w DMEM zawierającym wysoki poziom glukozy (4,5 g / L), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen / Strep.
    1. Umieść komórki MDA-MB-231 w gęstości 1 x 105 komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.
      UWAGA: Gęstość posiewu dla różnych linii komórkowych powinna być zoptymalizowana, a zatem może różnić się od optymalnej gęstości dla ogniw MDA-MB-231.
    2. 24 godziny po posianiu komórek dodać 1 ml wirusa i 1 ml świeżej pożywki (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep).
    3. Inkubować komórki przez okres od 6 godzin do nocy.
      UWAGA: Zarówno objętość wirusa, jak i czas inkubacji muszą być zoptymalizowane dla różnych linii komórkowych. Na przykład, jeśli komórki nie wyglądają zdrowo kilka godzin po dodaniu wirusa, użyj 1 ml wirusa i 2 ml świeżej pożywki (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep) dla kroku 1.2.2. Długość czasu inkubacji opisanego w kroku 1.2.3 można również skrócić.
    4. Odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep). Inkubować przez 24–72 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Sprawdź ekspresję H2B-mCherry w komórkach za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
      UWAGA: Jeśli wydajność transdukcji w komórkach jest niska, objętość wirusa w kroku 2.2 i czas inkubacji w kroku 2.3 mogą zostać zwiększone.

2. Synchronizacja komórek stabilnie wyrażających H2B-mCherry

  1. Płytkie komórki w 50 do 60% zbiegu, tj. Płytka 2 x 104 komórki MDA-MB-231 w każdym dołku 24-dołkowej płytki.
  2. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Zastąp pożywkę 0,5 ml pożywki (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep) zawierającej 2 mM tymidyny i pozostaw w inkubatorze na 24 godziny
    UWAGA: Komórki wystawione na działanie tymidyny są zatrzymywane w fazie wzrostu komórki (G1) / syntezy DNA (S) i przez całą fazę S z powodu zahamowania syntezy DNA. Długość czasu inkubacji powinna być zróżnicowana i zoptymalizowana dla różnych linii komórkowych.
  4. Uwolnij komórki z ekspozycji na tymidynę, przemłukując je trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Następnie inkubuj komórki w normalnej pożywce do hodowli komórkowych (DMEM, wysoka glukoza (4,5 g / L), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen / Strep) przez 5 godzin
    UWAGA: Uwolnienie komórek z ekspozycji na tymidynę umożliwia komórkom przejście do fazy wzrostu komórek (G2)/mitotycznej (M) dla komórek wcześniej zatrzymanych w fazie G1/S oraz do fazy G1 dla komórek wcześniej zatrzymanych w fazie S. Długość czasu uwalniania powinna być zróżnicowana i zoptymalizowana dla różnych linii komórkowych.
  5. Zablokuj komórki za pomocą 250 ng/ml nokodazolu przez 12 godzin
    UWAGA: Wszystkie komórki wystawione na działanie nokodazolu są zatrzymywane w fazie G2/M. Nokodazol jest cytotoksyczny. Długotrwałe narażenie na nokodazol może powodować apoptozę. Dostosuj okres lub stężenie ekspozycji dla różnych linii komórkowych, jeśli obserwuje się śmierć komórek. Komórki, które zostaną pomyślnie zsynchronizowane, będą wykazywać morfologię sferyczną.
  6. Potrząsaj ogniwami przez 45 s do 1 minuty za pomocą wytrząsarki orbitalnej z prędkością od 150 do 200 obr./min.
    UWAGA: Komórki mitotyczne, które mają niewielką przyczepność do podłoża, zostaną strząśnięte podczas procesu.
  7. Usuń pożywkę, aby wyekstrahować komórki, pipetując pożywkę do probówki wirówkowej, a następnie dodaj 0,5 ml świeżej pożywki (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g / l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen / Strep) do każdego dołka płytki.
  8. Powtórz kroki 2.6 i 2.7 trzy razy.
  9. Odwirować zebrane podłoże zawierające komórki mitotyczne przy 800 x g przez 3 min.
    UWAGA: Ten etap służy do usunięcia nokodazolu z pożywki komórkowej.

3. Włączenie zsynchronizowanych komórek do matryc kolagenu I

UWAGA: Kolagen typu I jest najobficiej występującym białkiem w ludzkim ciele i w ECM tkanek łącznych, dlatego jest szeroko stosowany do badania, jak funkcje komórek eukariotycznych są modulowane przez środowisko 3D17,23,24. Kolagen jest rozpuszczalny w kwasie octowym. Po zneutralizowaniu i podgrzaniu roztworu kolagenu do temperatury 20 - 37 °C, monomery kolagenu polimeryzują w siatkę włókien kolagenowych.

  1. Przygotować 10-krotny roztwór DMEM, rozpuszczając opakowanie proszku DMEM, 3,7 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 1 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) w 50 ml wody destylowanej. Przefiltrować roztwór, a następnie przygotować 1 M wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 2 g granulek NaOH w 50 ml wody destylowanej. Przefiltrować i przelać roztwór do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Na tym etapie nie należy używać normalnego roztworu DMEM. Dodanie znacznej objętości roztworu kolagenu spowoduje rozcieńczenie podłoża. Dlatego stężony roztwór DMEM jest przygotowany tak, aby zapewnić, że końcowe stężenie DMEM w matrycy kolagenowej będzie takie samo jak w normalnym DMEM.
  2. Kontynuuj pracę z komórkami zebranymi z kroku 2.9. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w około 0,25 - 0,5 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych (DMEM, wysoka glukoza (4,5 g / l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen / Strep).
    UWAGA: Aby osiągnąć określoną gęstość komórek w macierzy kolagenowej, początkowa gęstość komórek w zawiesinie nie może być zbyt niska. W związku z tym objętość pożywki użytej do ponownego zawieszenia komórek będzie zależeć od całkowitej liczby dostępnych komórek.
  3. Umieścić 10 μl ponownie zawieszonego roztworu komórek z kroku 3.2 na hemocytometrze i policzyć gęstość komórek w roztworze.
  4. Określ objętości potrzebne do wytworzenia matrycy kolagenowej 3D. Jako przykład użyto tutaj 500 μl żelu kolagenowego 2 μg/μL.
    1. Oblicz objętość roztworu komórkowego potrzebną do uzyskania 40 000 komórek/ml (lub 20 000 komórek na 500 μl żelu kolagenowego). Ta liczba w μL wynosi X. Potrzebne będzie 50 μL 10x DMEM. Potrzebne będzie 50 μL FBS.
    2. Oblicz potrzebną objętość kolagenu, którego mam w zapasie. Stężenie kolagenu I wynosi około 4 μg/μL. Ilość kolagenu potrzebna w μL wynosi Y.
    3. Obliczyć objętość wodorotlenku sodu potrzebną do zneutralizowania kwasu octowego w roztworze kolagenu: Y μL kolagenu * 0,023 * 1000 = Z μL NaOH potrzebne.
    4. Określić objętość roztworu wypełniającego: (500 μL całkowitego żelu - X μL komórek - 50 μL 10X DMEM - 50 μL FBS - Y μL kolagenu - Z μL NaOH) = R μL
      UWAGA: Roztworem wypełniającym jest woda destylowana. Jeśli obliczona objętość roztworu wypełniacza jest liczbą ujemną, pierwotna gęstość komórek w zawiesinie komórek jest zbyt niska. Komórki należy ponownie odwirować i ponownie zawiesić w mniejszej objętości podłoża (DMEM, wysoka glukoza (4,5 g / l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen / Strep).
  5. Dodaj składniki w następującej kolejności do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml: komórki w pożywce, 10x DMEM, FBS, woda dejonizowana (DI), kolagen, NaOH. Umieść wszystkie składniki na lodzie, aby spowolnić żelowanie roztworu kolagenu. Należy stosować odpowiednie techniki pipetowania, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
  6. Po dodaniu NaOH dokładnie wymieszać roztwór z pipetą o pojemności 1 ml
    UWAGA: Żelowanie kolagenu rozpocznie się natychmiast po dodaniu NaOH. Mieszanie powinno odbywać się ostrożnie i szybko.
  7. Gdy roztwór jest dobrze wymieszany, dodać 500 μl roztworu do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Umieścić świeżą pożywkę do hodowli komórkowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Plastikowe płytki dolne są używane do mikrokopii żywej komórki o małym powiększeniu, w której odległość robocza obiektywu wynosi powyżej 1 mm. Szklane płytki dolne są używane do mikroskopii żywych komórek o dużym powiększeniu ze względu na niewielką odległość roboczą soczewki o dużym powiększeniu.
  8. Dodaj 500 μl wstępnie podgrzanego podłoża (DMEM, wysoka zawartość glukozy (4,5 g/l), pirogronian sodu, 10% FBS i 1% Pen/Strep) do wierzchu żelu 30 minut po wykonaniu kroku 3.7.

4. Obrazowanie żywych komórek dzielących się w matrycach kolagenowych 3D (małe powiększenie)

UWAGA: Obrazy komórek są zbierane w odstępach 2-minutowych za pomocą kamery CCD (Charge Coupled Device) zamontowanej na mikroskopie kontrastu fazowego, który jest wyposażony w obiektyw 10X i kontrolowany przez oprogramowanie do obrazowania.

  1. Włącz ogniwo pod napięciem zamontowane na górze soczewki obiektywu. Poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C, stężenie CO2 wyniesie 5%, a wilgotność 75%.
  2. Umieść 24-dołkową płytkę z żelami w jednostce żywej komórki pod mikroskopem. Znajdź spód płytki, a następnie przesuń soczewkę obiektywu w górę, aż mikroskop ustawi ostrość na około 500 μm od spodu płytki.
    UWAGA: Komórki w macierzy kolagenowej, które znajdują się zbyt blisko dna płytki, nie są całkowicie osadzone w matrycy 3D. Obrazowanie komórek oddalonych o 500 μm od spodu płytki zapewni, że efekty krawędzi nie będą miały wpływu na komórki16,17,25.
  3. Przesuń stół montażowy, aby znaleźć komórki, i wybierz wiele pozycji do obrazowania.
  4. Skonfiguruj eksperyment poklatkowy w odstępach 2-minutowych.
    UWAGA: Maksymalna liczba pozycji, które można zająć w odstępie 2 minut, jest ograniczona prędkością ruchu zmotoryzowanego stolika oraz długością czasu naświetlania podczas robienia zdjęć.

5. Deformacja sieci kolagenowej podczas podziału komórki (mikroskopia w dużym powiększeniu)

  1. Włącz ogniwo pod napięciem zamontowane na górze soczewki obiektywu. Poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C, stężenie CO2 wyniesie 5%, a wilgotność 75%.
  2. Aby uwidocznić włókna kolagenowe w niebarwionych matrycach kolagenowych 3D, skonfiguruj mikroskop konfokalny tak, aby przechwytywał tylko światło odbite (488 nm) z lasera 488 nm używanego do oświetlania próbki. Laser wykorzystuje obiektyw 60X zanurzony w wodzie, NA = 1,2, WD = 200 μm i jest sterowany przez oprogramowanie do obrazowania.
  3. Umieść próbkę (komórki w matrycach kolagenowych) do żywej jednostki komórkowej. Znajdź spód płytki, a następnie przesuń soczewkę obiektywu w górę, aż mikroskop ustawi ostrość na około 100 μm od spodu płytki. Obrazowanie komórek, które znajdują się w odległości 100 μm od spodu płytki, zapewni, że efekty krawędzi nie będą miały wpływu na komórki.
    UWAGA: W tym przypadku zamiast soczewki olejowej stosuje się obiektyw zanurzeniowy w wodzie, ponieważ odległość robocza soczewki olejowej wynosi tylko około 100 μm. Zastosowanie soczewki olejowej stanowi problem, ponieważ grubość szkła na dnie płytki wynosi zwykle około 100 μm.
  4. Przesuń stół montażowy, aby znaleźć komórki, i wybierz wiele pozycji do obrazowania.
    UWAGA: Mikroskopia konfokalna optycznie przecina próbkę i przechwytuje tylko sygnały z płaszczyzny ogniskowej. Żywe komórki mogą pojawiać się i znikać z ostrości podczas eksperymentu poklatkowego. Aby umożliwić przechwytywanie obrazów komórek w długich okresach czasu, stos Z służy do zbierania obrazów z kolejnych warstw w odstępach 5 μm. Obrazowanych jest łącznie 5 warstw o rozpiętości 25 μm.
  5. Ustaw eksperyment poklatkowy w odstępach 5-minutowych.
    UWAGA: 5 minut jest tutaj używane jako interwał zamiast 2 minut używanych w sekcji 4, ponieważ do każdej pozycji stosuje się wiele trybów skanowania, w tym skanowanie fluorescencyjne dla H2B-mCherry, skanowanie odbiciowe dla kolagenu i skanowanie stosu Z. Korzystanie z wielu trybów skanowania zmniejsza szybkość skanowania pozycji w porównaniu z obrazowaniem w małym powiększeniu.
  6. Określ ilościowo deformację macierzy kolagenowej w pobliżu komórki pod wpływem sił wywieranych przez tę komórkę za pomocą prędkości obrazowania cząstek (PIV) z rozdzielczością subpikselową20. Przeprowadzenie tej analizy na obrazach 2D pozwala na wyraźną wizualizację zarówno sygnałów H2B-mCherry, jak i włókien kolagenowych. Zastosuj anizotropowe filtrowanie dolnoprzepustowe, aby wzmocnić sygnał sieci kolagenowej20.
  7. Aby zmierzyć lokalne przemieszczenie obszaru zainteresowania obrazu podrzędnego znajdującego się w punkcie (x,y) od klatki k do klatki k+1, wyodrębnij okno regionalne o długości 15×15 pikseli wyśrodkowane na (x,y) w klatce k. Następnie zidentyfikuj najlepiej pasujące lokalizacje (x,y)* poprzez lokalizacje, które mają maksymalny znormalizowany współczynnik korelacji krzyżowej na obrazie uzyskanym w klatce k+1. Wektor odkształcenia jest obliczany jako (x,y)* - (x,y).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest przedstawienie opartej na obrazowaniu metody badania procesów podziału komórek ssaków w matrycach 3D oraz ilościowe określenie interakcji między komórką a macierzą zewnątrzkomórkową 3D podczas i po podziale komórki. Aby ułatwić obrazowanie mitozy komórek, włączyliśmy H2B-mCherry do komórek MDA-MB-231 za pomocą transdukcji lentiwirusowej. H2B sprzężony z białkami fluorescencyjnymi jest używany jako marker mitotyczny do odróżniania komórek mitotycznych od komórek in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednie badanie podziału komórek w 3D nie było efektywne ze względu na ograniczenia eksperymentalne i wyzwania techniczne18,19. Kluczowymi etapami skutecznego badania podziału komórek ssaków w matrycach kolagenu 3D są: (1) włączenie markerów mitotycznych znakowanych fluorescencją do komórek; (2) synchronizacja podziału komórek; oraz (3) monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D przy użyciu techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczej konfokaln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01CA174388 i U54CA143868. Autorzy pragną podziękować za przyznanie nagrody PURA przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa za wsparcie dla Wei-tong Chena. Materiał ten oparty jest na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 1232825.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nerka ludzka zarodkowa 293TATCC
MDA-MB-231Centrum Onkologii Nauk Fizycznych, NIH
DMEM Corning10-013-CV
DMEM w proszkuThermoFisher Scientific12100-046
Surowica bydlęca płoduHyklonSH30910.03
Penicylina-Streptomycyna 100XSigma-AldrichP0781
Fugene HDPromegaE2311
Lipofectamine 2000Life technologies11668-07
Plazmid kodujący H2B-mCherry w wektorze lentiwirusowymPlazmid Addgene21217
TymidynaSigma-AldrichT1895
NokodazolSigma-AldrichM1404
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Wodorowęglan soduGibcoBRL11810-025
HEPESSigma-Aldrich113375-100
CollagenCorning354236
NaOHJ.T. Bake3722-01
Jednostka filtrująca strzykawkę Millex-HV, 0,45-μ m, PVDF, 33 mmMilliporeSLHVM33RS
Nikon TE2000E mikroskop epifluorescencyjnyKamera CCD NikonTE2000E
Cascade 1KRoper Scientific
NIS-Elements Oprogramowanie do obrazowania ARNikon
Nikon A1NikonA1
Mikroskop konfokalny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 11 (1), 18-21 (2001).
  4. Phillip, J. M., Aifuwa, I., Walston, J., Wirtz, D. The Mechanobiology of Aging. Annu Rev Biomed Eng. 17, 113-141 (2015).
  5. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  6. Martin, M. D., et al. Effect of ablation or inhibition of stromal matrix metalloproteinase-9 on lung metastasis in a breast cancer model is dependent on genetic background. Cancer Res. 68 (15), 6251-6259 (2008).
  7. Knox, J. J., Hotte, S. J., Kollmannsberger, C., Winquist, E., Fisher, B., Eisenhauer, E. A. Phase II study of Triapine in patients with metastatic renal cell carcinoma: a trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group (NCIC IND.161). Invest New Drugs. 25 (5), 471-477 (2007).
  8. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D. L., Fojo, A. T. Inhibitors targeting mitosis: tales of how great drugs against a promising target were brought down by a flawed rationale. Clin Cancer Res. 18 (1), 51-63 (2012).
  9. Tong, W. G., et al. Phase I and pharmacologic study of SNS-032, a potent and selective Cdk2, 7, and 9 inhibitor, in patients with advanced chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. J Clin Oncol. 28 (18), 3015-3022 (2010).
  10. Matulonis, U. A., et al. Phase II study of MLN8237 (alisertib), an investigational Aurora A kinase inhibitor, in patients with platinum-resistant or -refractory epithelial ovarian, fallopian tube, or primary peritoneal carcinoma. Gynecol Oncol. 127 (1), 63-69 (2012).
  11. Boss, D. S., et al. Clinical evaluation of AZD1152, an i.v. inhibitor of Aurora B kinase, in patients with solid malignant tumors. Ann Oncol. 22 (2), 431-437 (2011).
  12. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
  13. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  14. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  15. Giri, A., et al. The Arp2/3 complex mediates multigeneration dendritic protrusions for efficient 3-dimensional cancer cell migration. FASEB J. 27 (10), 4089-4099 (2013).
  16. Fraley, S. I., Feng, Y., Giri, A., Longmore, G. D., Wirtz, D. Dimensional and temporal controls of three-dimensional cell migration by zyxin and binding partners. Nat Commun. 3, 719(2012).
  17. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  18. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. J Cell Biol. 205 (2), 155-162 (2014).
  19. He, L., et al. Local 3D matrix confinement determines division axis through cell shape. Oncotarget. 7 (6), 6994-7011 (2016).
  20. Held, M., et al. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7 (9), 747-754 (2010).
  21. Fallica, B., Maffei, J. S., Makin, G., Zaman, M. Alteration of cellular behavior and response to PI3K pathway inhibition by culture in 3D collagen gels. PLoS One. 7 (10), e48024(2012).
  22. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  23. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-20 (2010).
  24. Gunzer, M., Kampgen, E., Brocker, E. B., Zanker, K. S., Friedl, P. Migration of dendritic cells in 3D-collagen lattices. Visualisation of dynamic interactions with the substratum and the distribution of surface structures via a novel confocal reflection imaging technique. Adv Exp Med Biol. 417, 97-103 (1997).
  25. Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. J Vis Exp. (80), e50763(2013).
  26. Lleres, D., James, J., Swift, S., Norman, D. G., Lamond, A. I. Quantitative analysis of chromatin compaction in living cells using FLIM-FRET. J Cell Biol. 187 (4), 481-496 (2009).
  27. Poincloux, R., et al. Contractility of the cell rear drives invasion of breast tumor cells in 3D Matrigel. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (5), 1943-1948 (2011).
  28. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  29. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods Mol Biol. 761, 75-83 (2011).
  30. Jackman, J., O'Connor, P. M. Methods for synchronizing cells at specific stages of the cell cycle. Curr Protoc Cell Biol. 8, (2001).
  31. Zwanenburg, T. S. Standardized shake-off to synchronize cultured CHO cells. Mutat Res. 120 (2-3), 151-159 (1983).
  32. Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol Biol. 296, 157-166 (2005).
  33. Kihara, T., Ito, J., Miyake, J. Measurement of biomolecular diffusion in extracellular matrix condensed by fibroblasts using fluorescence correlation spectroscopy. PLoS One. 8 (11), e82382(2013).
  34. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
  35. Harjanto, D., Maffei, J. S., Zaman, M. H. Quantitative analysis of the effect of cancer invasiveness and collagen concentration on 3D matrix remodeling. PLoS One. 6 (9), e24891(2011).
  36. Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
  37. Petroll, W. M. Differential interference contrast and confocal reflectance imaging of collagen organization in three-dimensional matrices. Scanning. 28 (6), 305-310 (2006).
  38. Fraley, S. I., et al. Three-dimensional matrix fiber alignment modulates cell migration and MT1-MMP utility by spatially and temporally directing protrusions. Sci Rep. 5, 14580(2015).
  39. Ikeda, Y., Collins, M. K., Radcliffe, P. A., Mitrophanous, K. A., Takeuchi, Y. Gene transduction efficiency in cells of different species by HIV and EIAV vectors. Gene Ther. 9 (14), 932-938 (2002).
  40. Ma, H. T., Poon, R. Y. Synchronization of HeLa cells. Methods Mol Biol. 761, 151-161 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa matryca kolagenowaobrazowanie ywych kom reksynchronizacja kom rekblokada tymidyntraktowanie nocodazolemznakowanie H2B mCherryizolacja kom rek w fazie mitozyilo ciowa analiza obrazu

Powiązane artykuły