Artykuł metodologiczny

Sygnały generacji drugiej harmonicznej w twardówce królika jako narzędzie do oceny terapeutycznego sieciowania tkanek (TXL) w przypadku krótkowzroczności

DOI:

10.3791/56385

⸱

6 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje techniki oceny chemicznego sieciowania twardówki królika za pomocą obrazowania drugiej generacji harmonicznej i różnicowa kalorymetria skaningowa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody wzmacniania tkanek poprzez wprowadzanie wiązań chemicznych (nieenzymatycznego sieciowania) do białek strukturalnych (kolagenów fibrylarnych) do terapii obejmują metody sieciowania fotochemicznego i sieciowania tkanek (TXL). Takie metody wywoływania mechanicznych zmian właściwości tkanek są stosowane w rogówce w zaburzeniach ścieńczenia rogówki (osłabieniu mechanicznego), takich jak stożek rogówki, a także twardówki w postępującej krótkowzroczności, gdzie dochodzi do ścieńczenia i osłabienia tylnej twardówki i prawdopodobnie przyczynia się do wydłużenia osiowego. Pierwszorzędnymi białkami docelowymi dla takiego wzmocnienia tkanek są kolageny fibrylarne, które stanowią zdecydowaną większość białek w suchej masie rogówki i twardówki. Na szczęście kolageny fibrylarne są głównym źródłem sygnałów generacji drugiej harmonicznej w przestrzeni zewnątrzkomórkowej tkanki. W związku z tym modyfikacje białek kolagenowych, takie jak te indukowane przez terapie sieciowania, mogą być potencjalnie wykrywane i określane ilościowo za pomocą mikroskopii drugiej generacji (SHGM). Monitorowanie sygnałów SHGM za pomocą systemu laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu ze źródłem światła wzbudzającego w podczerwieni jest ekscytującą nowoczesną metodą obrazowania, która cieszy się szerokim zastosowaniem w naukach biomedycznych. W związku z tym niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny zastosowania mikroskopii SHGM jako środka do pomiaru indukowanych efektów sieciowania w twardówce królika ex vivo, po wstrzyknięciu chemicznego środka sieciującego do przestrzeni sub-Tenon (sT), podejścia iniekcyjnego, które jest standardową praktyką w przypadku znieczulenia oka podczas okulistycznych procedur klinicznych. Chemiczny środek sieciujący, hydroksymetyloglicynian sodu (SMG), należy do klasy kosmetycznych środków konserwujących znanych jako środki uwalniające formaldehyd (FAR). Zmiany twardówkowe po reakcji z SMG powodowały wzrost sygnałów SHG i korelowały ze zmianami temperatury denaturacji termicznej, standardowej metody oceny indukowanych efektów sieciowania tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postuluje się, że postępująca krótkowzroczność może być leczona poprzez nieenzymatyczne sieciowanie twardówki (fotochemiczne i/lub chemiczne), co ma sens, biorąc pod uwagę, że blokowanie enzymatycznego sieciowania kolagenu może zwiększyć krótkowzroczność wywołaną eksperymentalną deprywacją formy (FD)1. Elsheikh i Phillips2 niedawno dyskutowali o wykonalności i potencjale zastosowania standardowego fotochemicznego sieciowania za pośrednictwem promieniowania ultrafioletem A (UVA) i ryboflawiny (znanego również jako protokół Dresden), w skrócie (ryboflawina CXL) do tylnej stabilizacji twardówki w celu zatrzymania wydłużenia....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały wykonane przy użyciu zwłokich oczu królika w nienaruszonych nienaruszonych niekrewniaczych głowach królików. Przestrzegano wszystkich instytucjonalnych i krajowych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie pistoletu maszynowego do TXL:
    1. Przygotować 1 ml roztworu roztworu wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o stężeniu 0,2 M, używając 0,0165 g proszku NaHCO3 rozpuszczonego w 1 ml wody destylowanej.
    2. Rozpuścić 0,1016 mg sproszkowanego hydroksymetyloglicynianu sodu (SMG) w 1 ml wody destylowanej, ab....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termiczna temperatura denaturacji (Tm) jako metoda testowa do oceny efektu sieciowania TXL: W sumie 16 par oczu królika zostało użytych w tych eksperymentach do procedury TXL. W pierwszej części tego badania oceniono lokalizację efektu sieciowania indukowanego pojedynczym wstrzyknięciem środka sieciującego SMG przez przestrzeń sT w głowie zmarłego królika. Ten rodzaj eksperymentu ma znaczenie w klinicznym leczeniu pacjentów, ponieważ zastrzyki w więcej niż jednym miejscu .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzone eksperymenty wykazały dowody potwierdzające zastosowanie mikroskopii sygnałowej SHG jako metody oceny efektów sieciowania kolagenu w twardówce, zwiększając przyszłą możliwość wykorzystania tej techniki jako narzędzia monitorowania zabiegów sieciowania, które są ukierunkowane na białka kolagenowe. Warto zauważyć, że instrument jest już w użyciu klinicznym, który może potencjalnie przechwytywać ten sygnał SHG. Chociaż instrument ten został zaprojektowany przede wszystkim do obrazowania ludzkiej skóry właściw.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorowi medycyny Tongalp Tezel za konsultacje dotyczące wstrzykiwania sT; dr Theresa Swayne na konsultacje dotyczące mikroskopii SHG; oraz Jimmy Duong z Działu Projektowania i Biostatystyki oraz Głównego Ośrodka Biostatystycznego Instytutu Irvinga w Centrum Medycznym Uniwersytetu Columbia.

Częściowo wspierane przez Research to Prevent Blindness oraz przez National Institutes of Health Grants NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 i NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University jest właścicielem powiązanej własności intelektualnej: Patenty wydane w USA nr: 8,466,203 i nr: 9,125,856. Międzynarodowy patent zgłoszo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SYNTEZA MILLI-Q A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USAPodwójnie destylowana, dejonizowana woda. - Krok protokołu 1.1.1
Hydroksymetyloglicynian sodu Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, Stany ZjednoczoneOdczynnik do sieciowania - krok protokołu 1.1.2
Igła iniekcyjna ze strzykawką typu luer-lockBD Eclipse, NJ, USAStrzykawka do wstrzykiwań podczopowych. - Krok protokołu 2.1
Głowa królikaDrób La Granjaniekrewniaczegooddzielona i dostarczona w ciągu 1 godziny po sekcji zwłok. - Krok protokołu 2.2
Tono-pen Pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowegoReichter Technologies Depew, Nowy Jork
Automatyczny podajnik próbek DSC 6000Perkin-Elmer Waltham, MA, USATermiczny analizator denaturacji - krok protokołu 7.4
Oprogramowanie Pyris Perkin-Elmer, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneVer 11.0  krok protokołu 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAObiektyw do zanurzenia w wodzie o wysokiej przepuszczalności podczerwieni z odległością roboczą 2.0 mm - krok protokołu 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, Teksas B000URVDQ8Żel na bazie wody stosowany jako medium do zanurzania obiektywu zamiast wody, aby zapobiec parowaniu - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara, CA, USALaser impulsowy Ti:Sapphire o szerokości impulsu 140 fs przy 80 MHz i przestrajalnym zakresie od 680 nm do 1080 nm. - krok protokołu 8.1.11
Komora celi AttoFluorThermo Fisher Scientific IncA7816Mocowanie szkiełka nakrywkowego - krok protokołu 8.1.3
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 25 mm, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5krok protokołu 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAkrok protokołu 8.1.4.
Detektor Non-descanned (NDD) GaAsPNikon Instruments, Melville, NY, USAWyposażony w filtr pasmowo-przepustowy 400-450 nm - krok protokołu 8.1.7
System skanowania laserowego A1R-MPNikon Instruments, Melville, NY, USAKompatybilny z wzbudzeniem wielofotonowym w podczerwieni (IR). - Krok protokołu 8.1.8
Oprogramowanie NIS ElementsNikon Instruments, Melville, NY, USAWersja 4.3określany w tekście jako "oprogramowanie" - krok protokołu 8.1.9
Fidżi/ImageJNarodowy Instytut Zdrowia  krok protokołu 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Centrum Medyczne Uniwersytetu Erazma, Rotterdam, Holandiahttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, dla kroku protokołu 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, Stany Zjednoczone14krok 9.2.8
Głowa królika - krok protokołu 2.4 Ver , protokołu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Op....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia SHGr nicowa kalorymetria skanuj cawstrzykni cie podt onczawkowew kna kolagenoweczynnik uwalniaj cy formaldehydkonfokalna mikroskopia skaningowadenaturacja termiczna

Powiązane artykuły