Artykuł metodologiczny

Sygnały generacji drugiej harmonicznej w twardówce królika jako narzędzie do oceny terapeutycznego sieciowania tkanek (TXL) w przypadku krótkowzroczności

DOI:

10.3791/56385

⸱

6 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje techniki oceny chemicznego sieciowania twardówki królika za pomocą obrazowania drugiej generacji harmonicznej i różnicowa kalorymetria skaningowa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody wzmacniania tkanek poprzez wprowadzanie wiązań chemicznych (nieenzymatycznego sieciowania) do białek strukturalnych (kolagenów fibrylarnych) do terapii obejmują metody sieciowania fotochemicznego i sieciowania tkanek (TXL). Takie metody wywoływania mechanicznych zmian właściwości tkanek są stosowane w rogówce w zaburzeniach ścieńczenia rogówki (osłabieniu mechanicznego), takich jak stożek rogówki, a także twardówki w postępującej krótkowzroczności, gdzie dochodzi do ścieńczenia i osłabienia tylnej twardówki i prawdopodobnie przyczynia się do wydłużenia osiowego. Pierwszorzędnymi białkami docelowymi dla takiego wzmocnienia tkanek są kolageny fibrylarne, które stanowią zdecydowaną większość białek w suchej masie rogówki i twardówki. Na szczęście kolageny fibrylarne są głównym źródłem sygnałów generacji drugiej harmonicznej w przestrzeni zewnątrzkomórkowej tkanki. W związku z tym modyfikacje białek kolagenowych, takie jak te indukowane przez terapie sieciowania, mogą być potencjalnie wykrywane i określane ilościowo za pomocą mikroskopii drugiej generacji (SHGM). Monitorowanie sygnałów SHGM za pomocą systemu laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu ze źródłem światła wzbudzającego w podczerwieni jest ekscytującą nowoczesną metodą obrazowania, która cieszy się szerokim zastosowaniem w naukach biomedycznych. W związku z tym niniejsze badanie zostało podjęte w celu oceny zastosowania mikroskopii SHGM jako środka do pomiaru indukowanych efektów sieciowania w twardówce królika ex vivo, po wstrzyknięciu chemicznego środka sieciującego do przestrzeni sub-Tenon (sT), podejścia iniekcyjnego, które jest standardową praktyką w przypadku znieczulenia oka podczas okulistycznych procedur klinicznych. Chemiczny środek sieciujący, hydroksymetyloglicynian sodu (SMG), należy do klasy kosmetycznych środków konserwujących znanych jako środki uwalniające formaldehyd (FAR). Zmiany twardówkowe po reakcji z SMG powodowały wzrost sygnałów SHG i korelowały ze zmianami temperatury denaturacji termicznej, standardowej metody oceny indukowanych efektów sieciowania tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postuluje się, że postępująca krótkowzroczność może być leczona poprzez nieenzymatyczne sieciowanie twardówki (fotochemiczne i/lub chemiczne), co ma sens, biorąc pod uwagę, że blokowanie enzymatycznego sieciowania kolagenu może zwiększyć krótkowzroczność wywołaną eksperymentalną deprywacją formy (FD)1. Elsheikh i Phillips2 niedawno dyskutowali o wykonalności i potencjale zastosowania standardowego fotochemicznego sieciowania za pośrednictwem promieniowania ultrafioletem A (UVA) i ryboflawiny (znanego również jako protokół Dresden), w skrócie (ryboflawina CXL) do tylnej stabilizacji twardówki w celu zatrzymania wydłużenia osiowego w krótkowzroczności. Ta metoda fotochemiczna jest z powodzeniem stosowana w leczeniu destabilizacji przedniej powierzchni gałki ocznej (tj. wybrzuszonej rogówki) obserwowanej w stożku rogówki i rogowaceniu po LASIK. Jednak zastosowanie tego protokołu CXL do twardówki jest utrudnione ze względu na kwestie związane z trudnościami w dostępie do tylnej twardówki za pomocą źródła światła ultrafioletowego (UV), a także konieczność modyfikacji znacznie większej powierzchni tkanki. Biorąc to pod uwagę, podejście CXL zostało wykorzystane do zatrzymania wydłużenia osiowego u królików pozbawionych wzroku (przez tarsorrhaphy), chociaż wiele regionów twardówki tylnej wymagało wielu oddzielnych stref napromieniania w tym badaniu3. Natomiast wstrzyknięcie chemicznego środka stabilizującego (tj. środka sieciującego) przez przestrzeń sT może stanowić prostszy sposób modyfikacji tylnej twardówki, unikając konieczności wprowadzania źródła światła UV. Ta technika iniekcji jest dobrze znana jako użyteczny sposób wywoływania znieczulenia oka podczas zabiegów okulistycznych, takich jak operacja zaćmy4,5,6. Wollensak7 opisał wcześniej użycie iniekcji sT przy użyciu aldehydu glicerynowego (chemicznego środka sieciującego podobnego w koncepcji do środków uwalniających formaldehyd (FAR) opisanych w tym badaniu) w celu usztywnienia twardówki królika i wykazano, że genipin ogranicza długość osiową u świnek morskich FD8,9. Badacze ci wykazali wyraźną przewagę stosowania rozpuszczalnego środka chemicznego nad fotochemiczną techniką CXL. Tak więc, sieciowanie twardówki za pomocą wstrzykiwanego środka chemicznego pewnego typu, w tym FAR (tj. TXL)10, może zapewnić wykonalną metodę leczenia w celu zatrzymania postępu wydłużenia twardówki obserwowanego w krótkowzroczności.

W przedstawionych tutaj protokołach używamy chemicznego roztworu sieciującego hydroksymetyloglicynian sodu (SMG), dostarczanego przez wstrzyknięcie sT do twardówki oczu trupa królika. Podobne protokoły wdrożyliśmy już wcześniej do miejscowego sieciowania chemicznego w rogówce. Warto zauważyć, że w tych wcześniej zgłoszonych badaniach, efekty sieciowania zależne od stężenia można było uzyskać za pomocą SMG, z zakresem efektu znacznie przekraczającym osiągalny za pomocą fotochemicznego CXL, jak określono za pomocą termicznej analizy denaturacji11.

Tutaj opisujemy protokoły do oceny efektu sieciowania SMG dostarczanego przez iniekcje sT do tkanki twardówki, denaturację termiczną za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) i mikroskopię drugiej generacji harmonicznej (SHGM).

Za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), znanej również jako analiza termiczna, mierzy się termiczne przejście denaturacji, które w przypadku tkanki twardówki jest głównie kierowane właściwościami kolagenów fibrylarnych, ponieważ stanowią one większość białka. Metoda ta ocenia stabilność struktury molekularnej kolagenu i usieciowanych wiązań, które stabilizują włókna kolagenowe, główną trzeciorzędową strukturę białkową. Podczas ogrzewania w DSC osiągana jest krytyczna temperatura przejścia, która powoduje denaturację cząsteczki kolagenu, co skutkuje rozwinięciem potrójnej helisy, procesem, który tworzy to, co jest powszechnie znane jako żelatyna. Ta termiczna denaturacja rozrywa wiązania wodorowe wzdłuż cząsteczki kolagenu i może być przesunięta do wyższych temperatur za pomocą metod indukowanego sieciowania12,13. Metoda ta jest stosowana od wielu dziesięcioleci, szczególnie w przemyśle biomateriałów oraz w procesach obejmujących produkcję skóry. Jednak metoda ta wymaga ekstrakcji tkanki twardówki i dlatego może być przydatna tylko jako technika ex vivo.

Mikroskopia drugiej generacji harmonicznej (SHGM) opiera się na nieliniowych właściwościach optycznych poszczególnych materiałów, z niecentrycznymi środowiskami molekularnymi. W takich materiałach intensywne światło, na przykład światło wytwarzane przez lasery, generuje sygnały SHG, w których padające światło ma podwojoną częstotliwość. Materiały biologiczne, o których wiadomo, że wytwarzają sygnały SHG, to kolagen, mikrotubule i miozyna mięśniowa. Na przykład kolagen wzbudzony światłem podczerwonym o długości fali 860 nm będzie emitował sygnał SHG w zakresie widzialnym o długości fali 430 nm. Obrazowanie sygnału drugiej harmonicznej (SHG) jest obiecującą metodą oceny terapeutycznego sieciowania kolagenu. Od ponad 30 lat wiadomo, że włókna kolagenowe w tkankach emitują sygnały SHG14. Jednak dopiero od niedawna udało się uzyskać obrazy w wysokiej rozdzielczości15 w różnych tkankach, w tym ścięgnistych16, skórze, chrząstkach17, naczyniach krwionośnych18, oraz w żelach kolagenowych19.

Na podstawie tej wiedzy, to badanie ocenia zmiany sygnału SHG wywołane w twardówce poprzez chemicznie indukowane sieciowanie kolagenu przez SMG. Wyniki wskazują, że modyfikacja SMG twardówki zwiększa sygnały SHG wytwarzane z wiązek włókien kolagenowych tkanek (struktura czwartorzędowa wyższego rzędu składająca się z włókien kolagenowych), a także powoduje strukturalną zmianę morfologiczną w sieci włókien kolagenowych, odzwierciedloną w "prostowaniu" wiązki włókien.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały wykonane przy użyciu zwłokich oczu królika w nienaruszonych nienaruszonych niekrewniaczych głowach królików. Przestrzegano wszystkich instytucjonalnych i krajowych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie pistoletu maszynowego do TXL:
    1. Przygotować 1 ml roztworu roztworu wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o stężeniu 0,2 M, używając 0,0165 g proszku NaHCO3 rozpuszczonego w 1 ml wody destylowanej.
    2. Rozpuścić 0,1016 mg sproszkowanego hydroksymetyloglicynianu sodu (SMG) w 1 ml wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 800 mM SMG. Doprowadzić roztwór wodorowęglanu sodu do końcowego stężenia 0,1 M NaHCO3 i 400 mM SMG. Stężenia SMG w zależności od pożądanego efektu sieciowania. W opisanym tu protokole użyliśmy pistoletów maszynowych o pojemności 40, 100 i 400 mM.

2. Iniekcja SubTenona dla TXL za pomocą SMG

  1. Napełnij dwie strzykawki insulinowe o pojemności 1 ml (igły 25 g) odpowiednio 400 μl roztworu kontrolnego i SMG.
  2. Umieść głowę królika w płaszczyźnie profilu za pomocą poduszki. Do zamocowania głowicy w optymalnej pozycji można użyć styropianu lub stosu papieru.
  3. Cofnij powieki za pomocą wziernika do oczu pediatrycznego.
  4. Zmierz początkowe ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) za pomocą urządzenia do tonometrii aplanacyjnej.
  5. Zaznaczyć miejsce planowanego wstrzyknięcia w górnej środkowej części rąbka za pomocą markera tkankowego.
  6. Cofnąć spojówkę otaczającą miejsce wstrzyknięcia za pomocą kleszczyków spojówkowych (lub dowolnych kleszczy z ząbkowaną okrągłą końcówką) i wprowadzić igłę przez spojówkę, wchodząc do torebki Tenona nieco poza zaznaczone miejsce rąbka (tj. 2-3 mm od rąbka). Małe nacięcie w spojówce można również wykonać nożyczkami do tęczówki, aby ułatwić przejście igły przez torebkę Tenona.
  7. Po znalezieniu się w torebce Tenona upewnij się, że igła jest swobodnie ruchoma, przesuwając ją z boku na bok. W tym czasie kula ziemska nie powinna się poruszać. Potwierdza to prawidłowe ułożenie igły nad twardówką w przestrzeni sub-Tenon (sT).
  8. Wstrzyknąć roztwór ze strzykawki i wyrzucić igłę. Bezpośrednio po wstrzyknięciu płyn gromadzi się w przestrzeni sT, tworząc przednie wybrzuszenie widoczne przez spojówkę (tj. chemozę).
  9. Powtórz pomiar IOP, aby potwierdzić, że nie zmienił się z powodu niezamierzonej perforacji kuli ziemskiej.
  10. Zdejmij wziernik z powieki i wykonuj cyfrowy masaż przez zamknięte powieki przez około 2-3 minuty.
  11. Pozostaw głowę na okres inkubacji wynoszący 3,5 godziny (temperatura pokojowa = 18 °C) przed przejściem do następnego etapu.

3. Przygotowanie tkanek

  1. Cofnij powieki za pomocą wziernika powiek, aby zoptymalizować dostęp do gałki ocznej. Wybierz wziernik o optymalnej wielkości w zależności od wielkości oka.
  2. Oddziel spojówkę otaczającą rąbek. Jeśli inokulum zostało już nacięte w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, należy rozszerzyć obwodowo brzegi, tak aby zawierało inokulum o wymiarach około 1x1 cm.
  3. Przetnij mięśnie zewnątrzgałkowe w miejscach ich przyczepu twardówkowego.
  4. Podnieś gałkę oczną kleszczami, popychając ją od tylnej strony. Zapewni to dostęp do tylnej gałki ziemskiej i ułatwi przecięcie nerwu wzrokowego z tętnicą oczną i żyłą znajdującą się w pobliżu tylnego bieguna gałki ziemskiej.
  5. Wyciąć kompleks korowo-twardówkowy, z zewnętrzną obwódką obejmującą zaznaczone miejsce wstrzyknięcia. Plama powinna być nadal widoczna na pozostałej części twardówki.
  6. Usuń ciało szkliste i wszystkie warstwy przyczepione do wewnętrznej strony twardówki, przykładając trakcję za pomocą kleszczy do tkanek.
    UWAGA: Dalsze kroki zależą od następujących wykonywanych procedur: 4.-Analiza DSC, 5.-SHG mikroskopia.

4. Dla regionalnej analizy DSC

  1. W przypadku leczonego oka: wyciąć nożyczkami cztery sektory twardówki z pozostałej miseczki twardówki tak, aby miejsce wstrzyknięcia znajdowało się w górnym sektorze i było wyrównane centralnie. Wytnij pozostałe 3 sektory z obu bocznych stron (tj. nosowej i skroniowej) oraz dolnej.
    UWAGA: numeracja sektorów (1-4), które są dalej podzielone na kwadraty (1-16) jest pokazana w Rysunek 1A.
  2. Pokrój sektory twardówki (1-4) na mniejsze kwadraty (1-16) o wymiarach około 4 x 4 mm każdy. Sektor 1 powinien być podzielony na 9 kwadratów (dokładne miejsce wstrzyknięcia należy ustawić jako pojedynczy kwadrat [kwadrat 2]). Podziel sektory 2 i 3 na 2 kwadraty każdy (kwadraty 10-11 i 12-13), a sektor 4 na 3 kwadraty (kwadraty 14-16).
  3. Przypisz liczbę do każdego kwadratu, jak pokazano w Rysunek 1A, aby zlokalizować odległość analizowanej tkanki od lokalizacji wstrzykniętego obszaru.
  4. Dla oka kontrolnego: po podzieleniu tkanki na cztery sektory twardówki (podobne do leczonej tkanki) wyciąć kwadratowe kawałki tkanki z następujących miejsc: 3 kwadraty od górnego sektora (sektor 1), po 1 z każdej strony (sektory 2 i 3) i 1 od dolnego sektora (sektor 4).
  5. Zeskrobać pozostałe warstwy siatkówki i naczyniówki i przemyć dwukrotnie za każdym razem świeżym PBS, pozostawiając kawałki zanurzone w roztworze na około 10 sekund na raz.

5. Do obrazowania SHG

  1. Wytnij górną część twardówki za pomocą nożyczek, aby utworzyć obszar o wymiarach 1 x 1 cm z miejscem wstrzyknięcia wyrównanym centralnie.
  2. Zeskrobać pozostałe warstwy siatkówki i naczyniówki i przemyć dwukrotnie świeżym PBS, za każdym razem pozostawiając kawałki w roztworze na około 10 sekund.
  3. Umieść tkankę w probówkach o pojemności 1 ml wypełnionych roztworem PBS w celu transportu do zakładu obrazowania. Wszystkie zabiegi, następujące po czasie inkubacji i rozpoczynające się od wypreparowania gałki ocznej, powinny być wykonane w ciągu godziny.

6. Protokół mikroskopowy

UWAGA: Ten protokół obrazowania wstecznie rozproszonego sygnału SHG z kolagenu tkanki twardówki jest dostosowany do laserowego mikroskopu skaningowego.

  1. Konfiguracja mikroskopii
    1. Aby zmaksymalizować sygnał i rozdzielczość podczas wykonywania mikroskopii SHG, należy użyć soczewki obiektywowej, zoptymalizowanej pod kątem przepuszczania światła podczerwonego i z dużą aperturą numeryczną (NA). Naszym celem jest zanurzenie w wodzie Nikon Apo LWD 25x/NA1.1.
    2. Dostosuj kołnierz korekcyjny soczewki tak, aby pasował do głębokości próbki, w tym przypadku jest to grubość szkiełka nakrywkowego, 0,17 milimetra.
    3. Zamontuj soczewkę obiektywu 25x i dodaj dużą ilość smarującego żelu na bazie wody, aby pokryć powierzchnię obrazowania przed zamontowaniem próbki. Żel na bazie wody nie odparuje podczas eksperymentu, a tym samym zachowa jakość obrazu.
    4. Umieść tkankę twardówki z probówki o pojemności 1 ml z PBS bez suszenia między dwoma okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 25 mm (stroną nadtwardówkową do dołu), zapewniając maksymalny kontakt między twardówką a powierzchnią szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Chusteczkę można również umieścić odkrytą na szkiełku nakrywkowym. Duża ilość PBS powinna utrzymać nawodnienie tkanki podczas obrazowania. W takim przypadku dodaj kawałek tkanki i PBS po zmontowaniu komory komórkowej.
    5. Zmontuj komorę komórki, umieszczając okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm, pojedyncze lub w technice przekładkowej, w dolnej części komory i przykręć górną część w dół, aby stworzyć szczelną okrągłą komorę. Nie dokręcaj mocno, gdy używane jest górne szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć sztucznego spłaszczenia i uszkodzenia tkanki.
    6. Zamontuj komorę komórkową z próbką tkanki na stoliku mikroskopu.
    7. Ustaw mikroskop na oko view przy włączonym świetle przechodzącym.
    8. Ustaw stolik i wyreguluj wysokość obiektywu tak, aby dolna powierzchnia próbki była ostra, zgodnie z kontrolą w jasnym polu przez okular.
    9. Wyłącz wszystkie światła z wyjątkiem monitora komputera i zablokuj jak najwięcej światła z monitora za pomocą arkuszy folii aluminiowej udrapowanych na stoliku mikroskopu. Zminimalizowanie światła rozproszonego docierającego do detektorów zapewni niski poziom hałasu, ponieważ detektory GaAsP NDD mają wysoką czułość.
    10. W panelu Ti Pad oprogramowania sprawdź, czy definicja obiektywu jest poprawna.
    11. W panelu A1 Compact GUI wybierz laser IR do obrazowania, wybierz detektory NDD i wybierz kanał DAPI, który jest wyposażony w filtr pasmowo-przepustowy 400-450 nm.
    12. W panelu GUI A1 MP ustaw długość fali lasera na podczerwień na 860 nm i otwórz migawkę.
    13. Ustaw warunki skanowania laserowego w panelu A1 Compact GUI w następujący sposób. Wybierz: (a) skaner Galvano, (b) skanowanie jednokierunkowe, (c) czas przebywania piksela 6,2 μs, (d) rozmiar klatki 1,024 x 1,024 pikseli, (e) uśrednianie linii 2x
      UWAGA: Skaner Galvano i skanowanie jednokierunkowe zapewniają precyzyjne wyrównanie punkt po punkcie. Rozmiar 1 024 x 1 024 dla pełnego pola widzenia przekłada się na rozmiar piksela 0,5 μm / piksel. Uśrednianie linii zmniejszy szum ujęcia na obrazie.
    14. Ustaw warunki obrazowania w kompaktowym panelu graficznym A1, dostosowując moc lasera i wzmocnienie detektora. Otwórz panel Tablica przeglądowa (LUT), w którym wyświetlany jest histogram wartości intensywności pikseli na bieżącym obrazie. Włącz obrazowanie na żywo w trybie "Znajdź" i zmaksymalizuj wykrywany zakres wartości pikseli, dostosowując moc lasera i wzmocnienie detektora. Unikaj nasycenia. Typowe wartości to 2,5% mocy lasera, z łącznej wartości 2,35 W przy 860 nm i 100 HV (wzmocnienie detektora).
    15. UWAGA: W tej konfiguracji moc lasera mierzona za pomocą wewnętrznego miernika mocy wynosi 5.2 mW. Za każdym razem, gdy przeprowadzany jest eksperyment, należy ponownie dostosować procent lasera tak, aby pomiar mocy wewnętrznej był stały i wynosił 5,2 mW między sesjami obrazowania. Należy zachować ostrożność podczas ustawiania mocy lasera. Laser Chameleon II to laser o mocy 3 W i długości fali 800 nm, a moc 10% lub wyższa może potencjalnie wywołać uszkodzenie tkanek.
  2. Akwizycja obrazu
    1. W trybie podglądu zeskanuj obszar tkanki za pomocą narzędzia Przegląd XYZ.
    2. Ustaw obrazowanie na niższą rozdzielczość (256 x 256 pikseli i brak uśredniania linii), aby przyspieszyć pozyskiwanie obrazów w tym trybie.
    3. Uchwyć 5 x 5, 3 x 3 lub pojedyncze pola widzenia, aby pokryć całą powierzchnię tkanki. W każdym miejscu, przed wykonaniem przeglądu włącz tryb "Skanowanie" na żywo i ustaw ostrość tkanki. Należy pamiętać, że różne obszary tkanki będą miały nieco inne pozycje w kierunku osiowym.
    4. Znajdź płaski obszar, w którym włókna kolagenowe są widoczne w całym polu widzenia i kliknij dwukrotnie tę pozycję w narzędziu przeglądu, aby przesunąć stolik do tej konkretnej lokalizacji.
    5. Włącz tryb "Skanowanie" na żywo, dostosuj pozycję Z obiektywu tak, aby dolna płaszczyzna była ostra, a następnie w Ti Pad użyj napędu Z, aby przesunąć płaszczyznę optyczną o 10-15 μm powyżej tej dolnej warstwy.
    6. Uzyskaj obraz w wysokiej rozdzielczości 1,024 x 1,024 pikseli i 2-krotnym uśrednianiu linii, używając przycisku "Przechwyć".
    7. Zapisz lokalizację w przeglądzie XYZ za pomocą przycisku "+". Gwarantuje to, że ten sam obszar tkanki nie zostanie ponownie przechwycony.
    8. Dla każdego fragmentu tkanki należy wykonać 10 obrazów nienakładających się na siebie pól widzenia.

7. Protokół DSC

Uwaga: Przejdź do tego kroku jak tylko przygotowanie tkanek zostanie zakończone, do regionalnej analizy DSC, lub po obrazowaniu tkanek, gdy wykonywany jest SHGM.

  1. Przygotuj patelnie DSC, zważone i oznaczone.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać przed sekcją tkanek, aby zminimalizować wysuszenie tkanek.
  2. Osusz każdy kwadrat twardówki chłonną chusteczką i połóż go płasko na dnie patelni DSC za pomocą kleszczy zębatych.
  3. Zważyć szalkę z tkanką w środku i pokrywką zaciśniętą i przykrytą w celu uzyskania mokrej masy tkanki (masa próbek powinna mieścić się w zakresie od 5 do 11 mg).
    Uwaga: Uszczelnij każdą miskę za pomocą zaciskarki przed przejściem do następnej próbki tkanki. Patelnie są hermetycznie zamknięte, co zapobiega utracie wody przed analizą termiczną.
  4. Po zaciśnięciu próbki umieść ją w wyznaczonym miejscu na tacy DSC. Powinno być 6 próbek dla kontroli i 16 dla leczonego oka.
  5. Utwórz metodę za pomocą oprogramowania do zarządzania instrumentami, określając masę tkanki i przeprowadź analizę termiczną przy użyciu następujących parametrów: Zakres temperatur od 40 do 80 °C, Szybkość nagrzewania: 1 °C/min, Przepływ ciepła: 17,37 mW, Przepływ gazu (N2): 19,8 mL/min, Ciśnienie gazu: 2,2 bar.
  6. Po zakończeniu przeanalizuj dane dla każdej próbki, wyodrębniając pik temperatury przejścia, przy której następuje denaturacja termiczna, za pomocą oprogramowania zarządzającego instrumentem.

8. Analiza obrazu

  1. Sygnał SHG
    1. Wybierz co najmniej 5-10 najbardziej reprezentatywnych obrazów z każdego zabiegu i jego kontroli, tak aby obszar obrazu był zajęty głównie przez włókna kolagenowe.
    2. Prześlij każdy obraz do oprogramowania ImageJ i zmierz średnią intensywność pikseli, wybierając opcję Analizuj> Zmierz dla aktywnego obrazu.
    3. Wyodrębnione wartości są podawane jako średnia intensywność pikseli i można je również wyświetlić, wykreślając histogram intensywności, wybierając z menu Analizuj > histogram
      4. .
    4. Korzystając z arkusza programu Excel, utwórz tabelę, aby udokumentować wszystkie zmierzone dane zgodnie z identyfikatorem próbki.
    5. Oblicz średnią i odchylenie standardowe intensywności pikseli dla każdego warunku leczenia i kontroli.
    6. Korzystając z testu t-Studenta, porównaj różnice dla wszystkich par porównań stężeń (tj. 40 mM SMG vs. 0 i 400 mM SMG vs. 0). [P≤0.05].
  2. Falistość
    1. Wybierz obraz, który przedstawia włókna kolagenowe. Należy przeanalizować co najmniej 10 obrazów z każdej próbki (w tym próbkę kontrolną dla każdego stężenia - łącznie co najmniej 40).
    2. Otwórz ImageJ>Plugins> NeuronJ. NeuronJ wymaga wcześniejszej instalacji.
    3. Prześlij wszystkie obrazyprzeciągając do otwartego okna NeuronJ.
    4. Utwórz linie śledzące wzdłuż włókien, podążając za konturem włókienki za pomocą myszy (można użyć tabletek do rysowania piórkiem), kliknij M, aby zmierzyć odległość całkowitej długości włókna.
    5. Wybierz "Opcja", aby narysować styczną linię prostą i połączyć początek i koniec wcześniej narysowanego konturu włókna. Teraz kliknij M, aby zmierzyć długość od końca do końca.
    6. Powtórz tę samą procedurę na co najmniej 10 włókienkach na obrazie.
    7. Zbierz te dwa pomiary z każdego z 10 włókien i wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego Excel, wyrażając całkowitą długość włókna (kontur) i długość od końca do końca (prosta linia łącząca) odpowiednio jako długość [krzywa] i długość [liniowa].
    8. Oblicz wskaźnik falistości (W) za pomocą wzoru: W= Długość [krzywa]/ Długość [liniowa].
    9. Obliczyć % falistości, porównując dane z obrazów próbek poddanych działaniu środka (SMG) z obrazami próbek kontrolnych przy użyciu wzoru: (W[SMG] - 1) / ( W[kontrola] - 1 )
    10. Wykonaj parami test t dla wskaźnika falistości (W) w celu określenia różnic statystycznych (wartości p) morfologii włókien kolagenowych między różnymi warunkami leczenia i kontroli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termiczna temperatura denaturacji (Tm) jako metoda testowa do oceny efektu sieciowania TXL: W sumie 16 par oczu królika zostało użytych w tych eksperymentach do procedury TXL. W pierwszej części tego badania oceniono lokalizację efektu sieciowania indukowanego pojedynczym wstrzyknięciem środka sieciującego SMG przez przestrzeń sT w głowie zmarłego królika. Ten rodzaj eksperymentu ma znaczenie w klinicznym leczeniu pacjentów, ponieważ zastrzyki w więcej niż jednym miejscu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzone eksperymenty wykazały dowody potwierdzające zastosowanie mikroskopii sygnałowej SHG jako metody oceny efektów sieciowania kolagenu w twardówce, zwiększając przyszłą możliwość wykorzystania tej techniki jako narzędzia monitorowania zabiegów sieciowania, które są ukierunkowane na białka kolagenowe. Warto zauważyć, że instrument jest już w użyciu klinicznym, który może potencjalnie przechwytywać ten sygnał SHG. Chociaż instrument ten został zaprojektowany przede wszystkim do obrazowania ludzkiej skóry właściw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorowi medycyny Tongalp Tezel za konsultacje dotyczące wstrzykiwania sT; dr Theresa Swayne na konsultacje dotyczące mikroskopii SHG; oraz Jimmy Duong z Działu Projektowania i Biostatystyki oraz Głównego Ośrodka Biostatystycznego Instytutu Irvinga w Centrum Medycznym Uniwersytetu Columbia.

Częściowo wspierane przez Research to Prevent Blindness oraz przez National Institutes of Health Grants NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 i NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University jest właścicielem powiązanej własności intelektualnej: Patenty wydane w USA nr: 8,466,203 i nr: 9,125,856. Międzynarodowy patent zgłoszony: PCT/US2015/020276.

Obrazy zostały zebrane w Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource of the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, wspieranym przez NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Mikroskop konfokalny został zakupiony z grantu NIH #S10 RR025686.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SYNTEZA MILLI-Q A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USAPodwójnie destylowana, dejonizowana woda. - Krok protokołu 1.1.1
Hydroksymetyloglicynian sodu Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, Stany ZjednoczoneOdczynnik do sieciowania - krok protokołu 1.1.2
Igła iniekcyjna ze strzykawką typu luer-lockBD Eclipse, NJ, USAStrzykawka do wstrzykiwań podczopowych. - Krok protokołu 2.1
Głowa królikaDrób La Granjaniekrewniaczegooddzielona i dostarczona w ciągu 1 godziny po sekcji zwłok. - Krok protokołu 2.2
Tono-pen Pomiary ciśnienia wewnątrzgałkowegoReichter Technologies Depew, Nowy Jork
Automatyczny podajnik próbek DSC 6000Perkin-Elmer Waltham, MA, USATermiczny analizator denaturacji - krok protokołu 7.4
Oprogramowanie Pyris Perkin-Elmer, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneVer 11.0  krok protokołu 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAObiektyw do zanurzenia w wodzie o wysokiej przepuszczalności podczerwieni z odległością roboczą 2.0 mm - krok protokołu 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, Teksas B000URVDQ8Żel na bazie wody stosowany jako medium do zanurzania obiektywu zamiast wody, aby zapobiec parowaniu - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara, CA, USALaser impulsowy Ti:Sapphire o szerokości impulsu 140 fs przy 80 MHz i przestrajalnym zakresie od 680 nm do 1080 nm. - krok protokołu 8.1.11
Komora celi AttoFluorThermo Fisher Scientific IncA7816Mocowanie szkiełka nakrywkowego - krok protokołu 8.1.3
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 25 mm, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5krok protokołu 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAkrok protokołu 8.1.4.
Detektor Non-descanned (NDD) GaAsPNikon Instruments, Melville, NY, USAWyposażony w filtr pasmowo-przepustowy 400-450 nm - krok protokołu 8.1.7
System skanowania laserowego A1R-MPNikon Instruments, Melville, NY, USAKompatybilny z wzbudzeniem wielofotonowym w podczerwieni (IR). - Krok protokołu 8.1.8
Oprogramowanie NIS ElementsNikon Instruments, Melville, NY, USAWersja 4.3określany w tekście jako "oprogramowanie" - krok protokołu 8.1.9
Fidżi/ImageJNarodowy Instytut Zdrowia  krok protokołu 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Centrum Medyczne Uniwersytetu Erazma, Rotterdam, Holandiahttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, dla kroku protokołu 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, Stany Zjednoczone14krok 9.2.8
Głowa królika - krok protokołu 2.4 Ver , protokołu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89(2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004(2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040(2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia SHGr nicowa kalorymetria skanuj cawstrzykni cie podt onczawkowew kna kolagenoweczynnik uwalniaj cy formaldehydkonfokalna mikroskopia skaningowadenaturacja termiczna

Powiązane artykuły