Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56391

⸱

1 czerwca 2018

 ,  , 
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Streszczenie

Embrionalne komórki macierzyste (ES) mają potencjał do różnicowania się w dowolną z trzech listków zarodkowych (endodermę, mezodermę, lub ektodermę) i mogą generować wiele linii dla medycyny regeneracyjnej. Hodowla komórek ES in vitro od dawna jest przedmiotem powszechnych obaw. Klasycznie mysie komórki ES są utrzymywane w surowicy i pożywce zawierającej czynnik hamujący białaczkę (LIF). Jednak w warunkach surowicy/LIF komórki wykazują niejednorodność w morfologii i profilu ekspresji genów związanych z pluripotencją i są w większości w stanie metastabilnym. Co więcej, hodowane komórki ES wykazują globalną hipermetylację, ale naiwne komórki ES wewnętrznej masy komórkowej (ICM) i pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są w stanie globalnej hipometylacji. Stan hipometylacji ICM i PGC jest ściśle związany z ich pluripotencją. Aby ulepszyć metody hodowli mysich komórek ES, opracowaliśmy niedawno nową metodę opartą na selektywnie połączonym wykorzystaniu dwóch drobnocząsteczkowych związków w celu utrzymania stanu hipometylowanego i pluripotencjalnego DNA. Tutaj prezentujemy, że jednoczesne leczenie witaminą C (Vc) i PD0325901 może usunąć około 90% 5-metylocytozyny (5mC) w ciągu 5 dni w mysich komórkach ES. Generowana zawartość 5mC jest porównywalna do tej w PGC. Badania mechanistyczne pokazują, że PD0325901 zwiększa ekspresję Prdm14 w celu stłumienia Dnmt3b (metylotransferazy DNA de novo) i Dnmt3l (kofaktora Dnmt3b), poprzez zmniejszenie syntezy de novo 5mC. Vc ułatwia konwersję 5mC do 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) katalizowanej głównie przez Tet1 i Tet2, co wskazuje na udział zarówno biernych, jak i aktywnych demetylacji DNA. Co więcej, w warunkach Vc/PD0325901 mysie komórki ES wykazują jednorodną morfologię i stan pluripotencjalny. Wspólnie proponujemy nowatorską i chemiczno-synergiczną metodę hodowli w celu osiągnięcia hipometylacji DNA i utrzymania pluripotencji w mysich komórkach ES. Małocząsteczkowa metoda zależna od substancji chemicznych przezwycięża główne niedociągnięcia hodowli surowicy i daje nadzieję na wygenerowanie jednorodnych komórek ES do dalszych zastosowań klinicznych i badań.

Wprowadzenie

Komórki ES pochodzą z ICM blastocysty1. Komórki są w stanie pluripotencji i mogą tworzyć wszystkie linie somatyczne i komórki linii rozrodczej2. Stworzenie komórek ES daje możliwość zbadania procesów rozwojowych in vitro i może generować komórki o znaczeniu medycznym dla medycyny regeneracyjnej w oparciu o ich pluripotencję3.

Dwie grupy stworzyły linie komórkowe ES myszy w 1981 roku, a następnie gdy komórki pochodzące z wczesnego zarodka myszy były hodowane w pożywce zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS) z mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) jako warstwą zasilającą1,4. MEF były inaktywowane mitotycznie i były wstępnie hodowane w szalkach przed hodowlą komórek ES. MEF zapewniają wsparcie dla przyłączania się mysich komórek ES i wytwarzają czynniki wzrostu, które promują propagację i hamują różnicowanie5, podczas gdy FBS oferuje niezbędne czynniki troficzne i hormony do proliferacji komórek. Późniejsze badania wykazały, że LIF wytwarzany przez komórki karmicielskie był kluczową cytokiną dla samoodnawiania i utrzymywania pluripotencji w mysich komórkach ES, a dodanie LIF do pożywki może zastąpić komórki karmiące6. Obecnie utrzymywanie mysich komórek ES w pożywce FBS/LIF na karmnikach jest nadal standardową metodą stosowaną przez wielu badaczy. Z tym klasycznym podejściem kulturowym wiążą się jednak pewne problemy. Po pierwsze, komórki żywicielskie wydzielają nadmiar i niekontrolowane czynniki i mogą powodować zanieczyszczenie chorobotwórcze7. Aby uniknąć tej interferencji, powlekanie powierzchni szalek żelatyną i dodanie LIF w pożywce zawierającej surowicę są alternatywnymi metodami utrzymywania mysich komórek ES bez komórek warstwy zasilającej. Dodatkowo, mysie komórki ES hodowane w warunkach surowicy/LIF wykazują niejednorodność morfologiczną w populacjach komórek, a nawet w poziomie ekspresji czynników związanych z pluripotencją8. Ostatnie badania sugerują, że w warunkach surowicy/LIF podstawowe czynniki transkrypcyjne związane z pluripotencją (w tym SOX2, Nanog i OCT4) mogą podtrzymywać pluripotencję poprzez sygnalizację LIF i WNT; jednakże, co warto zauważyć, aktywują one również sygnał czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), aby wywołać różnicowanie8. Ze względu na ambiwalentne podwójne działanie podstawowych czynników transkrypcyjnych, mysie komórki ES hodowane w surowicy wykazują niejednorodność, składającą się z dwóch wymiennych populacji, jednej podobnej do ICM, a drugiej przypominającej stan primed epiblast 8. Co więcej, mysie komórki ES w surowicy często wykazują globalną hipermetylację9, podczas gdy ICM i PGC są w globalnym stanie hipometylacji, co jest ściśle związane z ich pluripotencją9,10.

Istnieje duże zapotrzebowanie na opracowanie nowych metod hodowli mysich komórek ES. Od 2003 roku ustanowiono kilka ulepszonych protokołów11, ale nadal istnieją pewne ograniczenia i niedociągnięcia7. Od 2008 r. łączne zastosowanie dwóch małocząsteczkowych inhibitorów kinaz, PD0325901 (inhibitora kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)/kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) (MEK)) i CHIR99021 (inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (GSK3)), w pożywce N2B27 z LIF i bez surowicy, otworzyło nowe perspektywy hodowli mysich komórek ES12. To nowo zdefiniowane podłoże charakteryzuje się zastosowaniem dwóch inhibitorów (2i). Mysie komórki ES hodowane w pożywce 2i/LIF są bardziej jednorodne pod względem populacji komórkowych i ekspresji czynników pluripotencjencji. Ponadto, mysie komórki ES hodowane metodą 2i/LIF wykazują globalnie hipometylację DNA, która jest bliższa komórkom podobnym do ICM9,13. Mimo to kultura 2i ma swoje wady. PD0325901 i CHIR99021 są nierozpuszczalne w wodzie i na ogół rozpuszcza się je w roztworze podstawowym na bazie dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu dodania ich do pożywki hodowlanej. Badania wykazały, że długotrwała i niska dawka ekspozycji komórek na DMSO może prowadzić do cytotoksyczności14.

Tutaj wykorzystaliśmy dwa związki małocząsteczkowe i opracowaliśmy nową metodę hodowli mysich komórek ES. Nowatorska metoda hodowli łączy PD0325901 inhibitorów Vc i MEK w celu szybkiego i skutecznego promowania hipometylacji DNA do porównywalnego poziomu PGC, nazwanego protokołem hodowli Vc/PD0325901. Mysie komórki ES w pożywce zawierającej surowicę z dodatkiem Vc/PD0325901 wykazują jednorodność morfologii i utrzymują się w stanie podstawowym. W porównaniu z hodowlą 2i, mysie komórki ES hodowane w warunkach Vc/PD0325901 wykazują szybszą kinetykę demetylacji DNA i mogą osiągnąć poziom hipometylacji porównywalny z PGC. Ponadto zastosowanie pojedynczego inhibitora (PD0325901) zmniejsza ilość wprowadzaną DMSO do pożywki w porównaniu do tej stosowanej w 2i (PD0325901/CHIR99021) i zmniejsza uszkodzenia komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

  1. Przygotować roztwór 1,0 mM PD0325901 (inhibitor MEK) i 3,0 mM CHIR99021 (inhibitor GSK3).
    1. Odważyć 2 mg PD0325901 i dodać 4,15 ml DMSO do fiolki ze szkła bursztynowego.
    2. Odważyć 2 mg CHIR99021 i dodać 1,43 ml DMSO do fiolki z bursztynowego szkła.
    3. Po rozpuszczeniu podwielokrotności (50 μl/probówkę w probówkach PCR o pojemności 200 μl) należy przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem. Przed użyciem wyjmij tubkę zawierającą zamrożony bulion z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej.
  2. Odważyć 0,0176 g Vc w 1 ml probówki wirówkowej i rozpuścić ją w 1 ml sterylnej wody do końcowego stężenia 100 mM przed użyciem.
  3. Inaktywacja FBS: inkubować 500 ml FBS w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut.
  4. Przygotować 600 ml podłoża zasadowego do hodowli mysich komórek ES.
    1. Użyj butelki DMEM/pożywki o wysokiej zawartości glukozy (500 ml) i usuń 40 ml.
    2. Uzupełnienie 460 ml DMEM/pożywki o wysokiej zawartości glukozy 20% inaktywowanym FBS (120 ml), 1000 U/ml LIF (60 μL 107 U/ml roztworu podstawowego), 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA) (6 ml 10 mM roztworu podstawowego), 1 mM pirogronianu sodu (6 ml 100 mM roztworu podstawowego), 2 mM L-glutaminy (6 ml 200 mM roztworu podstawowego), 0,1 mM β-merkaptoenolu (600 μl 100 mM roztworu podstawowego) oraz 33 j.m./ml penicyliny i 33 μg/ml streptomycyny (2 ml mieszaniny penicyliny i streptomycyny (10 000 j.m./ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny)). Zdefiniuj podłoże podstawowe jako podłoże surowicy.
    3. Odpipetować 50 μl roztworu podstawowego odpowiednio PD0325901 (1,0 mM) i Vc (100 mM) do 50 ml pożywki surowicy (stężenie końcowe: 1,0 μM PD0325901 i 100 μM Vc) i zdefiniować pożywkę jako Vc/PD0325901 pożywkę.
      UWAGA: Przed użyciem przygotuj podłoże Vc/PD0325901 świeże ze względu na niestabilność Vc.
    4. Za pomocą pipety przenieść 50 μl roztworu podstawowego odpowiednio PD0325901 (1,0 mM) i CHIR99021 (3,0 mM) do 50 ml pożywki surowicy (stężenie końcowe: PD0325901 1,0 μM i CHIR99021 3,0 μM) i zdefiniować pożywkę jako pożywkę 2i.
  5. Przygotuj naczynia pokryte żelatyną.
    1. Przygotować 0,1% roztwór żelatyny: rozpuścić 0,3 g żelatyny w 300 ml ultraczystej wody w szklanej butelce z odczynnikiem z nakrętką i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Sterylny roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować szalki do hodowli komórkowych (o średnicy 6 cm) z 2 ml 0,1% roztworu żelatyny przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać żelatynę. Wysuszyć naczynia na powietrzu i zużyć je w ciągu 12 godzin.
  6. Przygotuj 10 ml mysiej pożywki do zamrażania komórek ES w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml: 90% FBS (9 ml) i 10% DMSO (1 ml). Zużyć podłoże w ciągu 1 dnia.
  7. Przygotuj pojemnik do zamrażania: dodaj 100% alkoholu izopropylowego do linii napełniania pojemnika do zamrażania i wyrzuć stary alkohol izopropylowy. Dodaj nowy alkohol izopropylowy bezpośrednio po co piątym użyciu.
  8. Przygotować bufor do wytrawiania enzymatycznego: odważyć 1,2114 g proszku Tris w 100 ml ultraczystej wody, aby przygotować 100 mM roztwór Tris i dodać stężony roztwór HCl (około 12 M) do roztworu Tris, aby dostosować pH do 7,6 (około 0,6 ml stężonego roztworu HCl).
  9. Przygotować 50 ml buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (bufor RIPA): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glicerolu, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Przed użyciem uzupełnij 1 mM DTT, koktajl inhibitorów proteazy 1X i 1 mM PMSF. Po dodaniu PMSF należy zużyć bufor w ciągu 30 minut.

2. Hoduj mysie komórki ES na naczyniach pokrytych żelatyną

  1. Wstępnie ogrzej mysie komórki ES (typ dziki, 129 SvEv) pożywkę hodowlaną, trypsynę i roztwór buforowany fosforanem (PBS) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  2. Przejdź przez komórki. Całkowicie odessać pożywkę z naczynia i odpipetować 2 ml PBS do szalek w celu przepłukania komórek.
    1. Usunąć PBS za pomocą pipety i ponownie umyć komórki 2 ml PBS.
    2. Usuń PBS i dodaj 0,3 ml trypsyny-EDTA (0,25%) do każdego naczynia.
    3. Szybko przykryj całe naczynie trypsyną, a następnie natychmiast ją wyjmij.
    4. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 minutę w celu odłączenia komórek od naczynia. Wyjmij szalki z inkubatora i dodaj 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki surowicy, aby zakończyć działanie trypsyny.
    5. Oddzielić kolonie komórkowe do zawiesiny pojedynczej komórki, ponownie zawieszając ją pipetą (końcówka pipety 5 ml) 10 razy.
  3. Przenieś 150 μl z 2 ml roztworu komórkowego (około 190 000 komórek przez zliczenie za pomocą hemocytometru) do nowego naczynia pokrytego żelatyną i uzupełnij 3 ml świeżo przygotowanej pożywki Vc/PD0325901 na 6 cm naczynie hodowlane. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Co 24 godziny podczas inkubacji usuwaj starą pożywkę hodowlaną i dodawaj 3 ml świeżej pożywki Vc/PD0325901 do naczynia hodowlanego ze względu na niestabilność Vc. Spodziewaj się 70-80% konfluencji po 2-3 dniach.
  5. Po osiągnięciu 70-80% konfluencji należy przejść komórki i kontynuować ich hodowlę zgodnie z opisem w krokach 2.2–2.4.

3. Zamroź i rozmroź komórki ES myszy

  1. Zamroź komórki ES myszy.
    1. Odłącz komórki od naczyń z trypsyną, wykonując krok 2.2.
    2. Przenieś komórki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj w temperaturze 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    3. Delikatnie wsypać supernatant do zlewki i ponownie zawiesić osad komórek z 1 ml świeżo przygotowanej pożywki do zamrażania. Przygotuj pożywkę do zamrażania 30 minut przed tym krokiem, aby przed użyciem upewnić się, że ma temperaturę pokojową.
    4. Przenieść komórki w pożywce zamrażającej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i umieścić probówkę mikrowirówki w pojemniku do zamrażania. Dodaj alkohol izopropylowy do linii napełniania pojemnika do zamrażania i utrzymuj go w temperaturze pokojowej przed użyciem.
    5. Pozostaw pojemniki do zamrażania na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    6. Probówki do mikrowirówek należy przenieść do pojemnika z ciekłym azotem na okres do 2–3 lat.
      UWAGA: Nie trzymaj komórek w zamrażarce przez długi czas i szybko przenieś komórki do zamrażarki o temperaturze -80 °C ze względu na toksyczność DMSO.
  2. Rozmrozić komórki ES myszy.
    1. Podgrzej 50 ml pożywki surowicy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Wyjąć fiolkę zawierającą komórki z pojemnika z ciekłym azotem i zanurzyć nakrętkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wstrząśnij szybko w łaźni wodnej do rozmrożenia. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli surowicy do probówki, aby rozcieńczyć pożywkę zamrażającą, a następnie odwirować przy 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    3. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić granulki komórek z 3 ml świeżej pożywki Vc/PD0325901 za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    4. Przenieść komórki z probówki o pojemności 15 ml do naczynia pokrytego żelatyną i hodować komórki przez 24 godziny. Ponownie wyhodować komórki, jak opisano w kroku 2.

4. Ekstrakcja białka całkowitego z komórek

  1. Przepłukać zebrane komórki 1 ml PBS, a następnie odwirować w temperaturze 800 x g i temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  2. Odessać supernatant i dokładnie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu RIPA uzupełnionego DTT, koktajlem inhibitorów proteazy i PMSF, delikatnie pipetując. Objętość bufora RIPA jest około 5 razy większa niż granulki komórki.
    UWAGA: Zawiesinę komórek należy przeprowadzić na lodzie.
  3. Przechowywać komórki w buforze RIPA przez 30 minut na lodzie i odwirowywać w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 5 minut.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  5. Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek Bradforda.

5. Ekstrakcja DNA z komórek i trawienie DNA do pojedynczego nukleozydu za pomocą enzymów

  1. Zbierz komórki z trypsyną zgodnie z opisem w krokach 3.1.1 i 3.1.2.
  2. Wykonaj ekstrakcję DNA za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Przechowuj wyekstrahowane DNA w probówkach wirówkowych o pojemności 1 ml. Dodać 100 μl ultraczystej wody do probówki wirówkowej i rozpuścić DNA, pipetując około 15 razy. Określ stężenie i oceń jakość DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm15. Stężenie DNA wynosi około 500 ng/μL.
  4. Trawić 5 μg DNA w roztworze o objętości 50 μl: dodać 5 μl 100 mM roztworu Tris-HCl o pH 7,6 (stężenie końcowe: 10 mM), 2 U fosfatazy jelitowej cielęcia, 1 U DNazy I, 0,005 U fosfodiesterazy jadu węża I i 5 μg DNA (obliczyć dodaną objętość zgodnie ze zmierzonym stężeniem DNA, ~10 μL) do probówki wirówkowej i zwiększyć objętość roztworu do 50 μL wodą ultraczystą. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez noc. Odwirować strawiony roztwór DNA w temperaturze 1 000 g i temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby zebrać roztwór na dno probówek.
  5. Przenieść strawiony roztwór DNA z probówek wirówkowych do probówek ultrafiltracyjnych (granica masy cząsteczki: 3 kDa) i odwirować w temperaturze 13 000 g i 4 °C przez 30 minut w celu usunięcia enzymów wytrawiających.
  6. Przygotuj próbki do analizy 5mC i 5hmC.
    1. Do analizy 5hmC: odpipetować 36 μl roztworu filtracyjnego do nowej probówki wirówkowej (1 ml) i dodać 4 μl 5'-(hydroksymetylo-d3)-2'-deoksycytydyny ([D3]-5hmC) o końcowym stężeniu 3 nM.
    2. W przypadku analizy 5 mC: dodać 196 μl ultraczystej wody do nowej probówki wirówkowej i odpipetować 4 μl roztworu filtrującego do probówki (50-krotne rozcieńczenie), ze względu na wysoką gęstość 5 mC w genomowym DNA. Przenieść 36 μl rozcieńczonego roztworu do nowej probówki wirówkowej i dodać 4 μl (5'-(metylo-d3)-2'-deoksycytydyny ([D3]-5mC) o końcowym stężeniu 50 nM. Użyj [D3]-5hmC i [D3]-5mC jako wzorca wewnętrznego do kalibracji odpowiednio 5hmC i 5mC.
  7. Przenieść roztwór próbki do probówek miarowych i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić analizę 5mC i 5hmC za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej - potrójna kwadrupolowa spektrometria mas z monitorowaniem wielu reakcji (UHPLC-MS/MS (MRM)) zgodnie z opisem w poprzednim raporcie15.

6. Analiza 5mC i 5hmC za pomocą UHPLC-MS/MS15

  1. Skonfiguruj różne parametry do analizy 5mC i 5hmC za pomocą oprogramowania UHPLC-MS.
    1. Ustal nową metodę. Otwórz oprogramowanie i kliknij "Plik | Nowość | Metoda". Wyświetl okno komunikatu "Edytor metody" z treścią "Czy chcesz zapisać zmiany dla bieżącej metody" i kliknij "Nie".
    2. Zbuduj parametry próbnika. Kliknij "Sampler | Konfiguracja | Wtrysk". Wybierz "Wtrysk standardowy" i wprowadź "5 μl przy objętości wtrysku".
    3. Zbuduj parametry pompy w UHPLC.
      1. Kliknij "BinPump2 | Konfiguracja", aby zbudować parametry pompy. Ustaw "Przepływ" na "0.25 ml/min" i "Czas zatrzymania" na "15 min".
      2. Ustaw "Rozpuszczalnik B na 5%" i "Limity ciśnienia" na "Max 600 bar".
      3. Kliknij "BinPump2 | Harmonogram" w celu zbudowania izokratycznych parametrów elucji dla analizy 5mC. Kliknij "Dołącz", aby dodać wiersz. Wprowadź "0.00" w "Czas" i "5.0" w "B%". Kliknij "Dołącz" jeszcze raz, aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "15.00" w "Godzinie" i "5.0" w "B%".
      4. Kliknij "BinPump2 | Harmonogram" w celu zbudowania gradientowych parametrów elucji dla analizy 5hmC. Kliknij "Dołącz, aby dodać wiersz. Wprowadź 0.00 w czasie i 5.0 w "B%". Kliknij "Dołącz" jeszcze raz, aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "3.00" w "Czas" i "5.0" w "B%". Kliknij "Dołącz" przez kolejne 6 razy, aby dodać 6 wierszy. Wprowadź "3.01" na "Czas" i "15.0" na "B%", "6.00" na "Czas" i "15.0" na "B%", "6.01" na "Czas" i "100" na "B%", "10.00" na "Czas" i "100.0" na "B%", "10.01" na "Czas" i "5.0" na "B%", "15.00" na "Czas" i "5.0" na "B%" kolejno.
        UWAGA: Analizę 5mC i 5hmC należy przeprowadzić indywidualnie ze względu na różne warunki separacji UHPLC.
    4. Zbuduj parametry temperatury komory kolumny (TCC) w UHPLC.
      Kliknij "TCC | Konfiguracja | temperatura (po lewej)" i wprowadź "30 °C".
    5. Ustal parametry QQQ-MS/MS.
      1. Kliknij "MS QQQ | Czas zatrzymania | Bez limitu/Jako pompa", "Źródło jonów | ESI", "Filtrowanie czasu | Szerokość piku: 0,07 min". Ustaw "Segmenty czasu: Czas rozpoczęcia: 0"; "Typ skanowania: MRM"; "Wartość działu: do MS"; "Delta EMV (+): 200" i "Delta EMV (-): 0".
      2. Zbuduj parametry monitorowania przejść 5mC, D 3-5mC, dC, 5hmC i D 3-5hmC
        1. Kliknij "MS QQQ | Akwizycja | Segmenty skanowania: Zatrzymanie: 90"; "Fragmentor: 90"; "Energia zderzenia: 5"; "Napięcie akceleratora ogniwa: 4" i "Polaryzacja: dodatnia".
        2. Wejście "5mC" w "Nazwa związku", "242" w "Jon prekursorowy", "126" w "Jon produktu" do analizy 5mC. Kliknij prawy przycisk i wybierz "Dodaj wiersz", aby dodać nowy wiersz. Wprowadź "D 3-5mC" w "Nazwa związku", "245" w "Jon prekursorowy", "129" w "Jon produktu" do analizy D3-5mC.
        3. Uzupełnij kolejne trzy rzędy w tym samym trybie. Wprowadź "dC" w "Nazwa związku", "228" w "Jon prekursorowy", "112" w "Jon produktu" do analizy DC. Wprowadź "5hmC" w "Nazwa związku", "258" w "Jon prekursorowy", "142" w "Jon produktu" dla analizy 5hmC. Wejście D 3-5hmC w nazwie związku, "261" w "Jon prekursorowy", "145" w "Jon produktu" do analizy D3-5hmC.
      3. Zbuduj parametry źródła gazu. Kliknij "MS QQQ | Źródło | Parametry źródła: Temp. gazu: 300 °C"; "Przepływ gazu: 11 l/min"; "Nebulizator: 15 psi"; "Kapilara dodatnia: 3500 V".
      4. Zapisz proponowaną metodę. Kliknij "MS QQQ | Instrument | Zapisz metodę jako". Wybierz ścieżkę dla proponowanej metody za pomocą "Katalogu" i nadaj nazwę metodzie, wprowadzając zawartość w polu "Metoda", na przykład: analiza 5mC i 5hmC.
  2. Separacja UHPLC i analiza MS/MS mononukleozydów
    1. Przygotować fazę ruchomą do analizy 5 mC i cytozyny (C): uformować fazę ruchomą roztworu A i B. Roztwór A: 500 ml ultraczystej wody z 500 μl kwasu mrówkowego (stężenie końcowe: 0,1%) i roztwór B: 500 ml 100% metanolu. Wymieszaj roztwór A i B w stosunku 95:5 (v:v) jako fazę ruchomą, aby wymyć 5mC i C (ustawione w kroku 6.1.3.3). Ustaw natężenie przepływu na 0.25 ml/min (ustawione w kroku 6.1.3.1).
    2. Przygotować fazę ruchomą za pomocą rozpuszczalnika A i B do analizy 5hmC. Rozpuszczalnik A to 2,0 mM NH4HCO3 roztwór wodny (pH 9,0) (500 ml), a rozpuszczalnik B to 100% metanol (500 ml). Oddzielić 5hmC za pomocą zoptymalizowanej elucji gradientowej: 0-3 min, 5,0% B i 95% A (v:v); 3-6 min, 15,0% B i 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5,0% B i 95% A (ustawione w kroku 6.1.3.4). Ustaw natężenie przepływu na 0.25 ml/min (ustawione w kroku 6.1.3.1).
  3. Użyj elektrorozpylania MS / MS z trybem MRM (ustawionym w kroku 6.1.5.1) do analizy elucji z kolumny i przyjmij tryb jonów dodatnich (ustawiony w kroku 6.1.5.2.1).
    1. Monitorowanie przejść: 5mC, m/z 242→126 (energia zderzenia, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); prąd stały, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (ustawiane w kroku 6.1.5.2.2).
    2. Ustaw napięcia kapilary i fragmentu odpowiednio na +3 500 V (ustawione w kroku 6.1.5.3) i 90 V (ustawione w kroku 6.1.5.2.1).
    3. Ustawić objętość iniekcji na 5 μl i przeanalizować każdą próbkę 3 razy (ustawione w kroku 6.1.2). Zastosuj odpowiednie krzywe standardowe, aby ocenić ilość 5mC i 5hmC.
      1. Ustalić krzywą wzorcową 5mC: przenieść 1–50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, stężenie końcowe) roztworu wzorca o temperaturze 5 mC do probówek wirówkowych i dodać 50 nM [D3]-5mC do probówek. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 μl. Przeprowadzić analizę wzorca 5mC zgodnie z instrukcjami dla próbki 5mC (krok 6).
      2. Zbuduj krzywą wzorcową 5hmC: przenieś 1–20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, stężenie końcowe) roztwór wzorcowy 5hmC do probówek wirowych i dodaj 3 nM [D3]-5hmC do probówek. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 μl. Przeprowadzić analizę wzorca 5hmC zgodnie z instrukcjami dla próbki 5hmC (krok 6).

7. Analizuj istotność statystyczną

  1. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania.
    1. Otwórz oprogramowanie i wybierz "Kolumna" w "Nowa tabela i wykres". Ustaw parametry w następujący sposób: "Przykładowe dane | Zacznij od pustej tabeli danych"; "Wybierz wykres - pierwszy tryb"; "Wykresy replik lub słupków błędów | Fabuła | Średnia z SEM".
    2. Kliknij "Utwórz", aby wprowadzić trzy powtórzenia grupy kontrolnej i grupy Vc/PD0325901 traktowanej odpowiednio w wierszu "A" i "B". Wybierz sześć danych i kliknij "Analizuj" w "Analizie".
    3. Wybierz "testy t (i testy nieparametryczne)" w "Analizach kolumnowych" i kliknij "OK", aby przejść do następnego interfejsu.
    4. Ustaw parametry w następujący sposób: "Wybierz test | Nazwa testu | Niesparowany test t; Opcje | Dwustronny"; "Przedziały ufności: 95%"; "Cyfry znaczące | Pokaż 4 cyfry znaczące". Kliknij "OK", aby uzyskać wartość p między kontrolą a obróbką Vc/PD0325901.
  2. Oceń istotność statystyczną między grupą kontrolną a grupą eksperymentalną stosującą dwustronny i niesparowany test t-test Studenta16.
    UWAGA: p <0,05 oznacza różnicę o istotności statystycznej. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Vc/PD0325901 synergistycznie indukuje globalne wymazanie metylacji w komórkach ES myszy. Komórki ES myszy w surowicy wykazują hipermetylację DNA, podczas gdy pluripotencjalne komórki ICM i PGC wykazują globalne wymazanie metylacji DNA, a stan hipometylacji jest ściśle powiązany z ich pluripotencjalnością9,10.

Wcześniej my oraz inni badacze stwierdziliśmy, że Vc może nasi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy zademonstrowaliśmy nową metodę łączenia Vc i PD0325901 w celu utrzymania mysich komórek ES w stanie niezróżnicowanym i hipometylowanym, co osiągnięto dzięki synergicznemu działaniu promującemu demetylację DNA przez Vc i hamującemu metylację DNA de novo przez PD0325901. Co więcej, mysie komórki ES wykazywały doskonałą morfologię w systemie hodowli Vc/PD0325901.

Aby lepiej utrzymać stan mysich komórek ES w systemie hodowli Vc/PD0325901, należy wykonać kilka krytycznych kroków. P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (21435008 i 21327006 do H.W.) oraz Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDB14030200 do H.W.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
płodowa surowica bydlęca Australia źródłoCorning35-076-CVSkładnik pożywki dla mysich komórek ES
DMEM/hyklon o wysokiej zawartości glukozySH30022Składnik mysiej pożywki z komórek ES
LIFMiliporeESG1107Składnik mysiej pożywki z komórek ES
aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140050Składnik pożywki
pirogronian soduGibco11360070Składnik mysiego podłoża komórkowego ES
L-glutaminaGibco25030081Składnik mysich pożywki z komórek ES
penicylina roztwór streptomycynyGibco15140122Składnik mysiej pożywki z komórek ES
PBSSigmaP5493Płukanie komórek
trypsynaHyconSH30042Dysocjacja komórek
żelatynaSigma48722Powlekanie naczyń
PD0325901Stemolecule04-0006-10drobnocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowych
CHIR99021Stemolecule04-0004drobnocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowej
witamina CSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd XW00508171małocząsteczkowa substancja chemiczna do hodowli komórkowych
System oczyszczania wody Ultra BiosciencePurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Wirówka do zamrażania komórek
Eppendorf5427Rdo ekstrakcji DNA i białek
SigmaP8340Składnik buforu
PMSF Inhibitor proteazyThermoFisher Scientific36978Składnik buforu RIPA
DTTSigma43815Składnik bufora RIPA
EGTASigma E3889Składnik buforu RIPA
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA PromegaA1125Ekstrakcja genomowego DNA
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Oznaczanie stężenia DNA
fosfatazy jelitowej cielęciaNew England BiolabsM0290Trawienie DNA
DNase INew England BiolabsM0303Trawienie DNA
fosfodiesteraza jadu węża ISigmaP4506Trawienie DNA
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtracja strawionego DNA
1290 System UHPLCAgilent 1290Separacja UHPLC
G6410B potrójny kwadrupolowy spektrometr masowyAgilent G6410BAnaliza MS/MS
Kolumna Zorbax Eclipse Plus C18Agilent Zorbax Eclipse Pluscolume do separacji UHPLC
5-metylocytozynaSolarbio Life SciencesSM8900 norma 5mC
5-hydroksymetylocytozyna (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14przeciwciało bioworldBS7634Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne
Przeciwciało Dnmt3abioworldBS6587Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne
Przeciwciało Dnmt3babcam ab13604Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne
Przeciwciało Dnmt3labcamab3493Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne
Przeciwciało Dnmt1abcamab13537Analiza Western blot - przeciwciało pierwotne
i przeciwciało beta;-tubulinabioworldBS1482MHAnaliza Western blot - przeciwciało pierwotne
koza anty-królik IgGabcamab6721Analiza Western blot - przeciwciało
wtórnekozia anty-mysia IgGabcamab6789Analiza Western blot - przeciwciało wtórne
TrizolInvitrogen15596-026
System odwrotnej transkrypcji ekstrakcjiPromegaA3500Odwrotna transkrypcja RNA
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG zestaw do barwienia i aktywności fosfatazy alkalicznejKomórki Biolabs, Inc.CBA-302  analiza barwienia fosfatazą alkaliczną
mysie komórki ES: WT, 129 SvEvDostarczone przez profesora Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)szczep komórkowy mysich komórek ES
mikroskopObserwacja komórekZeissLSM510
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0Analiza statystyczna
z mysich komórek ES Koktajl inhibitorów proteazy RIPA RNA

Bibliografia

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156(2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hipometylacja DNAtraktowanie witamin Canaliza UHPLC MS MSdetekcja 5 metylocytozynyanaliza 5 hydroksymetylocytozynyekspresja Prdm14supresja Dnmt3bprotok hodowli kom rkowej
Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.