Precyzyjna ocena reakcji na ból w neuropatycznym modelu zwierzęcym jest kluczowa dla zbadania patofizjologii chorób bólowych i opracowania nowych leków przeciwbólowych. Przedstawiamy czułą i obiektywną metodę określania funkcji sensorycznej tylnej łapy gryzonia za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy chodu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana analiza chodu u myszy z przewlekłym urazem zwężenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Test von Freya to klasyczna metoda, która jest szeroko stosowana do badania funkcji sensorycznych u zwierząt z bólem neuropatycznym. Ma jednak pewne wady, takie jak subiektywne dane i wymóg wykwalifikowanego, doświadczonego eksperymentatora. Do tej pory różne modyfikacje udoskonaliły metodę von Freya, ale nadal ma ona kilka ograniczeń. Ostatnie doniesienia sugerują, że analiza chodu dostarcza dokładniejszych i bardziej obiektywnych danych od zwierząt neuropatycznych. Protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić automatyczną analizę chodu w celu określenia stopnia bólu neuropatycznego u myszy. Po kilku dniach aklimatyzacji myszom pozwolono swobodnie chodzić po szklanej podłodze, aby oświetlić ślady stóp. Następnie przeprowadzono kwantyfikację śladów stóp i chodu za pomocą klipów wideo z automatyczną analizą różnych parametrów chodu, takich jak obszar odcisku łapy, czas zamachu, kąt łapy itp.
Głównym celem tego badania jest opisanie metodologii automatycznej analizy chodu i krótkie porównanie jej z danymi z klasycznego testu sensorycznego z użyciem filamentu von Freya.
Wprowadzenie
Patologiczne zmiany w układzie nerwowym wywołane urazem, dysfunkcją metaboliczną, stanem zapalnym, infekcją, niedokrwieniem lub chorobą autoimmunologiczną czasami powodują ból neuropatyczny, który jest definiowany jako ból powstający jako bezpośrednia konsekwencja zmiany lub choroby wpływającej na układ somatosensoryczny1. Ból neuropatyczny jest zwykle nie do zniesienia i niestety, konwencjonalne leki przeciwbólowe na ogół nie przynoszą wystarczającej ulgi w bólu2. Główną cechą bólu neuropatycznego są bóle spontaniczne i wywołane stymulacją (tj. allodynia i hiperalgezja). Allodynia jest reakcją nocyceptywną, która występuje na normalnie niebolesne bodźce, takie jak lekki dotyk lub ciepła stymulacja. Hiperalgezja wskazuje na wzmożoną reakcję bólową na szkodliwe bodźce mechaniczne i/lub termiczne3. Chociaż oba te objawy krytycznie pogarszają jakość życia pacjenta, allodynia mechaniczna wywoływana przez delikatną stymulację dotykową jest najbardziej obciążającym objawem, ponieważ miękki kontakt jest trudny do uniknięcia w życiu codziennym.
Aby zbadać mechanizm leżący u podstaw i nowe leki przeciwbólowe w leczeniu bólu neuropatycznego, niezbędny jest dokładny pomiar reakcji na ból. Wiele zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego rozwinęło reakcje nocyceptywne w okolicy tylnej łapy ze względu na jego wysoką dostępność4,5,6,7. W związku z tym większość ocen reakcji bólowych przeprowadzono na podeszwowej lub grzbietowej powierzchni tylnej łapy poprzez zastosowanie bodźców mechanicznych za pomocą specjalnych instrumentów, takich jak włókna von Freya. Jedną z najczęściej używanych metod jest metoda góra-dół opisana przez Dixon8 i późniejsze zmodyfikowane wersje9,10. Jednak do wykonania testu von Freya potrzebni są bardzo wykwalifikowani, doświadczeni eksperymentatorzy, a wyniki mogą być subiektywne.
Zautomatyzowany system analizy chodu może badać zaburzenia neurologiczne i nerwowo-mięśniowe, mierząc różne parametry chodzenia u swobodnie poruszających się gryzoni. W różnych modelach zwierzęcych uszkodzeń nerwów stopień nocycepcji i efekt antynocyceptywny kilku zabiegów można ocenić bez dodawania stymulacji bólu11,12,13,14. Ten system analizy może wykrywać statyczne i dynamiczne parametry chodu, takie jak: obszar odcisku łapy (obszar całego odcisku łapy, który styka się z podłogą), intensywność łapy (średnia intensywność stykającego się obszaru łapy), długość kroku (odległość między kolejnymi ułożeniami tej samej łapy), faza postawy (czas kontaktu z podłożem dla pojedynczej tylnej łapy), sekwencja kroków (kolejność, w jakiej cztery łapy są umieszczone na podłodze), huśtawka (czas trwania fazy wymachu) i prędkość wymachu (obliczana na podstawie długości kroku i czasu trwania wymachu i wyrażona w pikselach na sekundę). W artykule przedstawiono zastosowanie systemu analizy i przedstawiono krótkie porównanie danych z testem von Freya na myszach neuropatycznych z przewlekłym zwężeniem (CCI).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Międzynarodowego Stowarzyszenia Badań nad Bólem i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Narodowym Chungnam (Daejeon, Korea Południowa).
1. Indukcja CCI na nerw kulszowy
- Trzymanie w domu samców myszy ICR o wadze 20 - 25 g w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w kontrolowanej temperaturze pokojowej (utrzymywanej na poziomie 20 - 25 °C) i wilgotności (40 - 60%), ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Pozwól na okres aklimatyzacji dla myszy w pomieszczeniu do opieki nad zwierzętami wynoszący co najmniej 1 tydzień przed zabiegiem.
- Podczas trzymania należy obserwować wygląd i zachowanie myszy i nie używać myszy wykazujących nieprawidłową aktywność lokomotoryczną.
UWAGA: Na dzień przed operacją CCI zmierz czułość mechaniczną tylnej łapy, nakładając włókna von Freya i wykonaj automatyczną analizę chodu, aby uzyskać normalne wartości wyjściowe. Następnie losowo przypisz myszy do grup kontrolnych i eksperymentalnych.
- Podczas trzymania należy obserwować wygląd i zachowanie myszy i nie używać myszy wykazujących nieprawidłową aktywność lokomotoryczną.
- W dniu zabiegu znieczulić myszy, wstrzykując 2,2,2-tribromoetanol (250 mg/kg, dootrzewnowo (IP)).
UWAGA: Nosić środki ochrony osobistej, takie jak fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maska.- Odważyć 2,5 g 2,2,2-tribromoetanolu i dodać 2-metylo-2-butanol do końcowej objętości 5 ml. Trzymaj roztwór z dala od światła (np. użyj ciemnego pojemnika lub zawiń w folię).
- Pozostawić odczynniki do całkowitego rozpuszczenia, ogrzewając je w temperaturze 40 °C i mieszając przez 10-30 minut.
- Dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 200 ml i mieszaj, aż dobrze się wymiesza.
- Przechowywać podwielokrotności w temperaturze 4 °C i przechowywać w ciemności. Po dwóch tygodniach środek znieczulający należy zastąpić nowymi podwielokrotnościami.
- Wstrzyknąć objętość 20 μl na 1 g masy ciała. Na przykład, jeśli masa ciała myszy wynosi 25 g, podaj 500 μl roztworu. Typowy czas trwania tego znieczulenia wynosi 1 h.
UWAGA: Ten roztwór stanie się toksyczny pod wpływem światła i/lub ciepła, dlatego należy uważać, aby unikać ekspozycji na światło i ciepło. Zdecydowanie zalecana jest trasa wstrzykiwania adresu IP.
- Kiedy mysz wpadnie w głęboką narkozę, połóż ją na stole operacyjnym grzbietem do góry (tj. w pozycji leżącej) i wysterylizuj zewnętrzną część środkowej części uda po prawej stronie wacikiem nasączonym 70% alkoholem.
UWAGA: Potwierdź głębokie znieczulenie, sprawdzając brak reakcji na bodziec szczypiący lub uciskowy na tylnych łapach lub ogonie. - Wywołaj CCI na prawym nerwie kulszowym myszy.
- Wykonaj nacięcie na skórze w okolicy połowy uda o długości 1,0 - 1,5 cm za pomocą ostrza skalpela.
- Tępo wypreparuj mięśnie ud hemostatem mikrokomarów, aby odsłonić nerw kulszowy.
- Podwiązać odsłonięty nerw kulszowy 3 razy w odstępach 1,0 - 1,5 mm za pomocą chromowego szwu katgutowego 4-0.
UWAGA: Wykonaj luźne podwiązania, odwiązując nerw kulszowy, aż pojawi się łagodne drżenie na tylnej łapie ipsilateralnej. Pozorowana grupa myszy otrzymała ten sam otwór chirurgiczny w podobnych warunkach, z wyjątkiem podwiązania nerwów.
- Zamknij otwór chirurgiczny za pomocą 3 - 4 prostych przerywanych szwów za pomocą jedwabiu 5-0 i wysterylizuj jodem powidonu w celu dezynfekcji zewnętrznego obszaru operacji.
- Po operacji umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej. Kiedy zwierzęta zostaną wyleczone ze znieczulenia, należy je umieścić z powrotem w klatce domowej.
UWAGA: W tym badaniu nie stosowano antybiotyków. Grupa CCI+GBP otrzymywała IP gabapentynę (GBP) w dawce 50 mg/kg raz na dobę jako kontrolę pozytywną.
2. Pomiar mechanicznej Allodynii (test von Freya)
UWAGA: Oceń częstotliwość reakcji wycofania na bodźce mechaniczne, używając 1 g włókna von Freya do podeszwowej powierzchni ipsilateralnej tylnej łapy.
- W każdym dniu testu przynieś myszy do pokoju testów behawioralnych i zaaklimatyzuj je w ich własnej klatce domowej przez co najmniej 30 minut przed testem.
UWAGA: Nosić środki ochrony osobistej, takie jak fartuch chirurgiczny, rękawiczki i maska. - Umieść mysz w przezroczystym akrylowym pudełku na podłodze z metalowej siatki i zaaklimatyzuj się w myszy przez 30 minut.
- Delikatnie nałóż 1 g filamentu von Freya na podeszwową powierzchnię tylnej łapy, aż filament się ugnie.
- Zastosuj stymulację filamentem do ipsilateralnej tylnej łapy 10 razy w odstępach co najmniej 10 s i zapisz wynik.
UWAGA: W tym badaniu liczba odpowiedzi na wycofanie łapy z 10 prób jest pokazana jako procent częstotliwości wycofywania łap (PWF, %). Test von Freya wykonywano co dwa dni po operacji CCI.
3. Przeprowadzanie automatycznej analizy chodu
UWAGA: System analizy chodu wizualizuje każdy odcisk łapy podczas chodzenia zwierzęcia i automatycznie analizuje różne parametry chodu, takie jak odcisk łapy, intensywność łapy, długość kroku, faza postawy, sekwencja kroków, zamach, prędkość wymachu, itp. W tym badaniu pokazaliśmy obszar odcisku łapy i pojedynczą postawę po przekształceniu danych w procentową zmianę między przeciwległą lewą a ipsilateralną prawą tylną łapą. Zatem wynik 50% wskazuje, że wielkość odcisku łapy i czas kontaktu obszaru łapy z podłogą, między lewą i prawą stroną są takie same. Ponadto, niższe wartości danych zbliżające się do 0% wskazują, że zarówno rozmiar, jak i czas trwania kontaktu są zmniejszone w ipsilateralnej tylnej łapie w porównaniu z przeciwległą stroną (patrz panel B w Rysunek 2 i Rysunek 3).
- W celu aklimatyzacji trzymaj myszy w urządzeniu do analizy chodu przez 10 minut raz dziennie, począwszy od 5 dni przed operacją CCI.
UWAGA: Test analizy chodu, w tym aklimatyzacja, powinien być wykonywany w ciemności. - Przynieś myszy do pokoju testowego w celu analizy chodu i zaaklimatyzuj się w ich domowej klatce przez co najmniej 30 minut przed testem.
- W zakładce ustawień w menu programu ustaw "długość chodnika" na 30 cm, a "maksymalny czas trwania biegu" na 5 s, a "maksymalny wariant biegu" na 50%.
- Wybierz zarejestrowaną kamerę z zakładki "ustawienia" w menu "program".
- Wybierz "otwórz akwizycję" z zakładki "nabyj" w menu "program".
- Po wyświetleniu komunikatu o stanie kliknij przycisk "przyciągaj tło", aby zrobić zdjęcie tła pustego (tj. pustego) chodnika.
- Kliknij przycisk "Rozpocznij akwizycję" i umieść mysz na chodniku; nagrywanie rozpocznie się automatycznie zgodnie z ruchem myszy.
UWAGA: Gdy mysz wyraźnie przejdzie przez chodnik, program automatycznie klasyfikuje ten ruch jako "Bieg zgodny" z zieloną ikoną. Jeśli oprogramowanie nie wykryje odcisku stopy, eksperymentator zobaczy czerwoną ikonę i będzie musiał powtórzyć nagranie. Do analizy potrzebnych jest co najmniej pięć pomyślnych zgodnych przebiegów. - Po zakończeniu testu wybierz opcję "klasyfikuj przebiegi" z zakładki pobierania w menu "program".
- Wybierz przebiegi do analizy i kliknij przycisk "automatyczna klasyfikacja".
UWAGA: Po klasyfikacji wszystkie parametry statystyczne są automatycznie zapisywane, a eksperymentator może znaleźć wyniki, klikając "wyświetl statystyki przebiegu" w menu analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadziliśmy test von Freya oraz zautomatyzowaną analizę chodu u myszy z modelem CCI do 10 dni po operacji CCI. W analizie statystycznej zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami w celu określenia efektów ogólnych, a analiza post-hoc Dunnetta została wykonana w celu wyznaczenia wartości p pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Wyniki przedstawione na Rysunku 1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecnie pomiar allodynii mechanicznej za pomocą włókien von Freya jest najpowszechniej stosowaną metodą w zwierzęcych modelach bólu w celu wykazania nadwrażliwości dotykowej. Wraz z dalszym rozwojem zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego udoskonalono również metodologię oceny funkcji sensorycznych 8,9,10,15. W tych raportach zasugerowano, że te modyfikacje mogą zapewnić dokładniejsze, szybsze ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez Chungnam National University, Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM) oraz grant Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (numer grantu: HI15C0007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% sól fizjologiczna | JW Pharmaceutical | N/A | Pojazd do leków |
| Strzykawka | 1ml BD Plastipak | 300013 | Urządzenie do wstrzykiwania |
| 2, 2, 2-tribromoetanol (czystość 97%) | Sigma | T48402 | Znieczulenie |
| 2-metylo-2-butanol (czystość 99%) | Sigma | 152463 | Rozpuszczalnik do 2, 2, 2-tribromoetanolu |
| Wybieg Zautomatyzowany system analizy chodu | Noldus | N/A | Oprogramowanie do automatycznej analizy chodu aniaml |
| Chromowy katgut (grubość 4-0) | AILEE | C442 | Ligatura do przewlekłego uszkodzenia zwężenia nerwu kulszowego |
| Gabapentyna | Sigma | Y0001280 | Analgeisc, stosowany jako lek kontroli pozytywnej w tym badaniu |
| Graefe Kleszcze | FST | 11051-10 | Instrument chirurgiczny |
| Podkładka grzewcza | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | Regulacja temperatury ciała |
| Mysz ICR | Samtaco | N/A | Zwierzę doświadczalne |
| Mersilk (grubość 3-0) | ETHICON | W598H | Materiał szwowy do chirurgicznego zamykania skóry |
| Micro-Mosquito | FST | 13010-12 | Narzędzie chirurgiczne |
| Mikronożyczki | FST | 14090-09 | Chirurgiczne instrument |
| Uchwyt igły | FST | 12002-12 | Instrument chirurgiczny |
| Povidone Jodine | Firson | N/A | Środek dezynfekujący zapobiegający infekcjom po operacji |
| Ostrze skalpela | FST | 10010-00 (#10) | Narzędzie chirurgiczne do wykonania nacięcia |
| Rękojeść skalpela | FST | 10003-12 (#3) | Narzędzie chirurgiczne do wykonania nacięcia |
| Filamenty Von-Frey | North Coast | NC12775-99 | Urządzenie pomiarowe do badania funkcji sensorycznych dla stymulacji mechanicznej |
Bibliografia
- Loeser, J. D., Treede, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137 (3), 473-477 (2008).
- Colloca, L., et al. Neuropathic pain. Nat Rev Dis Primers. 3, 17002(2017).
- Vranken, J. H. Mechanisms and treatment of neuropathic pain. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 9 (1), 71-78 (2009).
- DeLeo, J. A., et al. Characterization of a neuropathic pain model: sciatic cryoneurolysis in the rat. Pain. 56 (1), 9-16 (1994).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 20, 441-462 (1980).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Mol Pain. 10, 26(2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. J Neurosci Methods. , (2017).
- Kang, D. W., et al. Antinociceptive Profile of Levo-tetrahydropalmatine in Acute and Chronic Pain Mice Models: Role of spinal sigma-1 receptor. Sci Rep. 6, 37850(2016).
- Huehnchen, P., Boehmerle, W., Endres, M. Assessment of paclitaxel induced sensory polyneuropathy with "Catwalk" automated gait analysis in mice. PLoS One. 8 (10), e76772(2013).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. 'CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. J Vis Exp. (82), e51212(2013).
- Ferland, C. E., Laverty, S., Beaudry, F., Vachon, P. Gait analysis and pain response of two rodent models of osteoarthritis. Pharmacol Biochem Behav. 97 (3), 603-610 (2011).
- Mogil, J. S., et al. Hypolocomotion, asymmetrically directed behaviors (licking, lifting, flinching, and shaking) and dynamic weight bearing (gait) changes are not measures of neuropathic pain in mice. Mol Pain. 6, 34(2010).
- Ferreira-Gomes, J., Adaes, S., Castro-Lopes, J. M. Assessment of movement-evoked pain in osteoarthritis by the knee-bend and CatWalk tests: a clinically relevant study. J Pain. 9 (10), 945-954 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
