Artykuł metodologiczny

Obrazy na żywo transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56409

⸱

7 grudnia 2017

 ,  , 
1The Ph.D. Program for Cancer Biology and Drug Discovery, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 2Integrated Laboratory, Center of Translational Medicine, Taipei Medical University, 3Core Facility, Taipei Medical University, 4The Ph.D. Program for Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Graduate Institute of Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 6TMU research center for Neurotrauma and Neuroregeneration, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę obserwacji w czasie rzeczywistym transportu białka GLUT4 (Glucose Transporter 4) w czasie rzeczywistym po stymulacji insuliną oraz charakterystykę biologicznej roli CCR5 w szlaku sygnałowym insuliny-GLUT4 za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej.

Streszczenie

Cukrzyca typu 2 (T2DM) to globalny kryzys zdrowotny, który charakteryzuje się upośledzeniem sygnalizacji insuliny i przewlekłym stanem zapalnym w tkankach obwodowych. Podwzgórze w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) jest centrum kontroli regulacji energii i odpowiedzi na sygnał insuliny. Przewlekły stan zapalny w tkankach obwodowych i brak równowagi niektórych chemokin (takich jak CCL5, TNFα i IL-6) przyczyniają się do cukrzycy i otyłości. Jednak mechanizmy funkcjonalne łączące chemokiny i regulację sygnału insuliny w podwzgórzu nadal pozostają niejasne.

Modele hodowli pierwotnych neuronów in vitro są wygodnymi i prostymi modelami, które mogą być używane do badania regulacji sygnału insuliny w neuronach podwzgórza. W tym badaniu wprowadziliśmy egzogenne białko GLUT4 sprzężone z GFP (GFP-GLUT4) do pierwotnych neuronów podwzgórza w celu śledzenia translokacji błony GLUT4 po stymulacji insuliną. Obrazy poklatkowe transportu białka GFP-GLUT4 zarejestrowano za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej, co pozwoliło użytkownikom na generowanie szybkich obrazów o wysokiej rozdzielczości bez znacznego uszkodzenia neuronów podczas przeprowadzania eksperymentu. Udział CCR5 w regulowanej insuliną translokacji GLUT4 zaobserwowano w neuronach podwzgórza z niedoborem CCR5, które wyizolowano i wyhodowano od myszy z nokautem CCR5. Nasze wyniki wykazały, że skuteczność translokacji błony GLUT4 była zmniejszona w neuronach podwzgórza z niedoborem CCR5 po stymulacji insuliną.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 2 (T2DM) to globalny kryzys zdrowotny. Cukrzyca typu 2 charakteryzuje się upośledzeniem sygnalizacji insulinowej i przewlekłym stanem zapalnym w tkankach obwodowych. Podwzgórze jest centrum kontroli, które reguluje homeostazę energetyczną organizmu, apetyt i rytm okołodobowy. Co najważniejsze, podwzgórze pośredniczy również w odpowiedzi na sygnał insuliny w celu regulacji metabolizmu ogólnoustrojowego1,2,3,4,5. Zakłócenie szlaku sygnałowego insuliny w podwzgórzu może wywołać insulinooporność6,7. Podwzgórze koordynuje stan energii komórkowej i wydzielanie hormonów, takich jak insulina i adipokiny (np. leptyna) z tkanek obwodowych, w celu regulacji ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy, odpowiedzi na insulinę i przyjmowania pokarmu. Wiązanie insuliny z receptorem insuliny aktywuje białka substratu receptora insuliny (IRS), które następnie aktywują cząsteczki sygnałowe insuliny, takie jak PI3K (kinaza 3-fosfatydyloinozytolowa) i AKT (kinaza białkowa B (PKB/AKT)), w celu indukowania translokacji błony GLUT4. Neurony nie są głównym celem wychwytu glukozy w odpowiedzi na insulinę; jednak zidentyfikowano znaczne poziomy ekspresji GLUT4 w regionie jądra łukowatego podwzgórza (ARC). Dlatego regulacja GLUT4 w neuronach podwzgórza może odgrywać ważną rolę w sygnalizacji insuliny w osi mózgowo-obwodowej.

Wiele badań sugeruje, że przewlekłe stany zapalne i chemokiny zapalne w podwzgórzu również odgrywają ważną rolę w rozwoju cukrzycy i otyłości, a hamowanie zapalenia podwzgórza może odwrócić insulinooporność wywołaną przez dietę8,9,10. Co więcej, chemokina-CCL5 (ligand motywu C-C 5, znany również jako RANTES, regulowany przy aktywacji-normalnej-limfocytach T wyrażanych i wydzielanych) i poziomy jej receptora CCR5 również korelują z rozwojem T2DM11,12. Rola CCL5 i CCR5 w funkcjonowaniu insuliny i metabolizmie glukozy pozostaje niejasna. Jedno z badań wykazało, że niedobór CCR5 chronił myszy przed stanem zapalnym wywołanym otyłością, rekrutacją makrofagów i insulinoopornością11; Natomiast inne badanie wykazało, że niedobór CCR5 upośledza ogólnoustrojową tolerancję glukozy, a także sygnalizację insuliny w adipocytach i mięśniach12. Stwierdzono, że CCL5 zwiększa wychwyt glukozy w limfocytach T i zmniejsza spożycie pokarmu poprzez działanie na podwzgórze13,14, jednak zarówno mechanizm działania, jak i zaangażowane receptory nie zostały jeszcze zidentyfikowane.

Trudno jest badać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw wpływu zapalenia tkanek obwodowych na funkcjonowanie insuliny w neuronach podwzgórza. Wynika to z heterogeniczności komórkowej i regulacji sprzężenia zwrotnego obwodów neuronów. Z tego powodu model hodowli komórkowej in vitro zapewnia czysty model do badania wpływu chemokiny na regulację sygnału insuliny w podwzgórzu. Chociaż istnieje wiele uznanych nieśmiertelnych linii komórek neuronalnych podwzgórza do użytku badawczego, te linie komórkowe wyrażają różne markery, a zatem reprezentują różne typy neuronów podwzgórza15. Mimo że pierwotne hodowle podwzgórza mogą być trudne do utrzymania, mogą zapewnić najbardziej realistyczną odpowiedź neuronów podwzgórza na stymulację insuliną, a także mogą uniknąć potencjalnych nieznanych efektów, które wchodzą w grę podczas długotrwałego utrzymywania komórek w pożywce hodowlanej ze sztucznymi czynnikami wzrostu.

Tutaj wykorzystujemy pierwotne neurony podwzgórza zarówno myszy C57BL/6 typu dzikiego (WT), jak i myszy CCR5 z nokautem (CCR5-/-) i transfektujemy oba typy komórek za pomocą konstruktu GFP-GLUT4. Aby zbadać udział CCR5 w transfekowanym przez insulinę transfekowanym transfekcji neuronów GLUT4 podawano insulinę lub rekombinowaną CCL5. Następnie charakteryzujemy ruch GFP-GLUT4 na błonie plazmatycznej w pierwotnych neuronach podwzgórza za pomocą mikroskopii dekonwolucyjnej.

Protokół

Wszystkie protokoły i metody stosowane na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Tajpej (numery protokołów: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)

1. Pierwotna hodowla neuronów

  1. Przygotowanie przed kulturą
    1. Posmaruj szalki hodowlane poli-D-lizyną (Tabela 1) na dzień przed hodowlą. W przypadku naczynia 6-dołkowego dodaj 1,5 ml poli-D-lizyny (0,05 mg / ml) do każdej studzienki. Do obrazowania na żywo, hodowla komórek na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 12 mm x 12 mm na standardowej powlekanej płytce 6-dołkowej.
    2. Wyjąć/poddać recyklingowi poli-D-lizynę i umyć naczynia dwukrotnie 2 ml ddH2O.
    3. Przygotuj narzędzia chirurgiczne: parę nożyczek do mikropreparacji, kleszcze z zakrzywioną końcówką i standardowe kleszcze z prostą końcówką. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne i przechowuj je w 75% etanolu podczas operacji.
    4. Napełnij 10-centymetrowe szalki Petriego 20 ml roztworu myjącego (tabela 1) i trzymaj na lodzie.
    5. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml 15 ml roztworem myjącym i trzymaj probówkę na lodzie.
  2. Izolacja tkanki mózgowej z różnych obszarów mózgu
    1. Uśmierc 16-19-dniowe ciężarne samice myszy za pomocą standardowych protokołów eutanazji, umieszczając myszy w niewentylowanej klatce, a następnie odurzając się CO2 . Zarodki E15.5 ~ E16.5 są zalecane do hodowli neuronów podwzgórza, a E16.5 ~ E17.5 są bardziej odpowiednie do hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej.
    2. Wysterylizuj platformę, mikroskop preparacyjny i narzędzia chirurgiczne 75% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    3. Przetnij obszar pępowiny (ciemnoczerwony obszar, Rysunek 1A, linia kreskowa 1B), aby łatwo odizolować młode bez ich uszkadzania ( Rysunek 1C, 1D).
    4. Usuń część głowy każdego szczeniaka za pomocą nożyczek (Rysunek 1E, F), a następnie zabezpiecz część głowy na miejscu za pomocą prostych szczypiec z cienką końcówką w okolicy oczu (Rysunek 1G). Użyj innych zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką, aby usunąć zewnętrzną skórę i czaszkę z dwóch stron i oderwij je od przodu do kierunku grzbietowego (Rysunek 1H, strzałka wskazuje kierunek). Mózg powinien być odizolowany bez żadnych uszkodzeń (Rysunek 1I).
      UWAGA: Niezbędne jest zachowanie integralności mózgu, aby zapewnić dokładność podczas izolowania różnych obszarów mózgu.
    5. Trzymaj odizolowane mózgi na czystej szalce Petriego z lodowatym środkiem myjącym do wykonywania kolejnych czynności.
    6. Odwróć mózg i trzymaj brzuszną stronę do góry. Podwzgórze to okrągła struktura w środku mózgu (Ryc. 1J, strzałka wskazuje obszar podwzgórza). Odizoluj tkankę podwzgórza za pomocą zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką. Ostrożnie usuń opony mózgowe (które mają żółtawo-czerwony kolor).
      UWAGA: Całkowite usunięcie opon mózgowych jest krytycznym krokiem, aby uniknąć zanieczyszczenia fibroblastami.
    7. Przytrzymaj płat węchowy ostrymi kleszczami i oderwij cienkie opony mózgowe otaczające cały mózg zakrzywionymi kleszczami (Rysunek 1K, L).
    8. Hipokamp ma kształt przypominający banana, który jest osadzony w dolnej części kory. Odwróć się do spodu kory i oddziel hipokamp od kory, ciągnąc go na bok za pomocą zakrzywionych kleszczy (Ryc. 1M, N i O). Pamiętaj, aby usunąć wszystkie pozostałe opony mózgowe otaczające tkankę mózgową.
    9. Po wyizolowaniu wszystkich obszarów mózgu, posiekaj te tkanki w 15 ml probówkach zawierających lodowato zimne podłoże do mycia za pomocą kleszczy (krok 1.1.5).
      UWAGA: Tkanki mózgowe można przechowywać w lodowatym podłożu myjącym przez 2-3 godziny.
  3. Trawienie tkankowe, posiew i hodowla
    1. Opłucz tkanki, odwracając probówkę zawierającą 15 ml 2-3 razy, a następnie trzymaj probówkę prosto, aby tkanki mogły się uspokoić (1-3 min).
    2. Usuń górną pożywkę za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego. Aby umyć chusteczkę, dodaj 15 ml lodowatego podłoża do mycia i odwróć probówkę 2-3 razy. Powtórz kroki prania 3 razy przed następnym krokiem.
      UWAGA: Uważaj na chusteczki znajdujące się na dnie podczas wyjmowania górnego podłoża za pomocą systemu próżniowego.
    3. Po ostatnim umyciu usuń medium myjące za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    4. Inkubować tkanki z buforem do trawienia papainy-trypsyny (Tabela 1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 7-14 minut. Wstrząsać probówkami co dwie minuty, aby upewnić się, że wszystkie tkanki są odpowiednio wystawione na działanie buforu wytrawiającego .
      UWAGA: Czas inkubacji i objętość bufora trawiennego można dostosować w zależności od wielkości tkanki. W przypadku tkanki podwzgórza pobranej od 6-8 młodych zaleca się 300 μl buforu do trawienia papainy-trypsyny i czas inkubacji wynoszący 7 minut. Więcej tkanek będzie wymagało większego bufora trawiennego.
    5. Zneutralizuj aktywność enzymu, dodając 1 objętość płodowej surowicy bydlęcej. Wstrząśnij probówką 3-5 razy w temperaturze pokojowej.
    6. Trzymaj probówkę na stojakach i odczekaj 1-2 minuty, aby chusteczki się uspokoiły; ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    7. Dodać 6 ml pożywki galwanicznej (Tabela 1) do probówki i delikatnie pipetować tkankę w górę iw dół 50 razy za pomocą pipety 5 ml (w przypadku płytki 6-dołkowej zaleca się 1,5 ml pożywki galwanicznej na studzienkę). Większość komórek dysocjuje na pojedyncze komórki po wielokrotnym pipetowaniu.
      UWAGA: Staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków podczas wykonywania tego kroku. Większość laboratoriów używa pipet z palonego szkła do dysocjacji tkanki. Dobrą alternatywą na tym etapie może być pipeta o pojemności 5 ml z wąską końcówką.
    8. Trzymaj rurkę na stojaku i odczekaj 1-2 minuty, aby grube, niezdysocjowane tkanki mogły się uspokoić. Przenieś górną fazę zawierającą zdysocjowane komórki do nowej probówki i rozcieńcz pożywką galwaniczną (5 razy objętość pożywki galwanicznej na 1 objętość zdysocjowanych komórek. Na przykład dodaj 5 ml pożywki galwacyjnej dla 1 ml zdysocjowanych komórek).
    9. Obliczyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru i wprowadzić wymaganą liczbę komórek do płytki hodowlanej pokrytej poli-D-lizyną, jak w kroku 1.1.1. Zalecamy 2-4 x 105 komórek na dołek dla naczynia 6-dołkowego / 35 mm naczynia zalecanego do badań obrazowania neuronów. Do zbierania i analizy białek potrzebna byłaby większa gęstość.
      UWAGA: Nie dodawaj zbyt dużo podłoża galwanicznego, do zamocowania wystarczy 1-1,5 ml pożywki galwanicznej w jednym naczyniu 6-dołkowym. Nadmierna ilość podłoża wydłuży czas potrzebny do prawidłowego przymocowania komórki.
    10. Odczekaj 2-3 godziny i sprawdź rozsiane neurony pod mikroskopem. Neurony zaczną rosnąć w zapaleniu nerwów, gdy przyczepią się prawidłowo.
    11. Usunąć podłoże galwaniczne i dodać 2 ml podgrzanego medium do mycia (37 °C) do naczynia, aby zmyć podłoże galwaniczne. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    12. Dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej (Tabela 1) do każdego dołka w naczyniu 6-dołkowym.
    13. Zmieniaj połowę podłoża co 3-4 dni. Za każdym razem należy przygotowywać całe podłoże na świeżo. Neurony wyhodowane z różnych regionów mózgu myszy będą miały różną morfologię i cechy charakterystyczne (Rysunek 2).

2. Transfekcja plazmidowego DNA do pierwotnego neuronu z systemem liposomowym

UWAGA: Do transfekcji neuronów, do przygotowania DNA zalecany jest zestaw do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn (Tabela Materiałów). Dodatkowe wytrącanie etanolu może usunąć nadmiar rozpuszczalnika i zwiększyć stężenie DNA.

  1. Transfekcja DNA oparta na liposomach w neuronach pierwotnych.
    UWAGA: Czas transfekcji zależy od stanu dojrzewania wymaganego w eksperymentach. Neurony podwzgórza transfekowano w DIV 7-10 (DIV, dni in vitro).
    1. DNA: Przygotowanie mieszaniny liposomów: Rozcieńczony plazmid GFP-GLUT4 DNA16 (2 μg) w probówce mikrowirówkowej zawierającej 300 μl pożywki hodowlanej o niskiej surowicy. Przygotować kolejną probówkę do mikrowirówek z 2 μl liposomu w 300 μl pożywki hodowlanej o niskiej surowicy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Połączyć zawartość obu probówek i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usuń pożywkę do hodowli neuronów z naczynia hodowlanego. Dodać 600 μl mieszaniny DNA-liposomów do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-6 godzin.
    4. Po 4-6 godzinach usuń mieszaninę DNA-liposom i dodaj 2 ml pożywki hodowlanej.
    5. Sygnały fluorescencyjne, takie jak sam GFP i białko GLUT4 sprzężone ze znacznikiem GFP (Rysunek 3 i Ryc. 4), można zaobserwować po 18-72 godzinach.

3. Nagrywanie obrazu na żywo

  1. Przygotowanie komórek do obrazowania na żywo
    1. Hodowla komórek neuronów podwzgórza WT i CCR5-/- eksprymujących białko zielonej fluorescencji znakowane transporterem glukozy 4 (GFP-GLUT4) na szklanym szkiełku nakrywkowym o grubości #1,5 (lub 0,17 mm), które zostało wstępnie pokryte poli-D-lizyną w kroku 1.1.1 na płytce 6-dołkowej.
    2. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z neuronami za pomocą kleszczy i ostrożnie umieść je na szkiełkach
      3. podstawowych.
    3. Usuń nadmiar podłoża/płynu za pomocą delikatnych chusteczek do zadań. Złóż chusteczki dwukrotnie i ostrożnie umieść je na szkiełku nakrywkowym. Delikatnie dociśnij chusteczki bez przesuwania szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Nie dociskaj mocno szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego. Celem tego etapu jest upewnienie się, że szkiełko nakrywkowe nie przesuwa się/nie dryfuje podczas akwizycji obrazu spowodowanej siłą wyporu.
    4. Umieść szkiełka nakrywkowe i szkiełka podstawowe na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół i odpowiednio zabezpieczone. Ten krok ma na celu zapewnienie, że pozycja slajdu pozostaje stała, aby użytkownicy mogli później śledzić ten sam zestaw komórek docelowych.
    5. Obserwuj komórki neuronów podwzgórza WT i CCR5-/- za pomocą soczewki obiektywowej z olejkiem 60x/1,42 NA.
    6. Traktuj wybrane próbki komórek CCL5 (10 ng/ml) lub insuliną (10 U/ml) przez jedną minutę. Dodaj 1,5 μl rozcieńczonej insuliny na brzegu szkiełka nakrywkowego.
    7. Natychmiast wizualizuj i rejestruj wybrane próbki komórek. Zaprogramuj oprogramowanie do nagrywania wideo tak, aby nagrywało przez 30 minut.
  2. Mikroskopia dekonwolucyjna i analiza
    UWAGA: Ta część protokołu wymaga użycia mikroskopu dekonwolucyjnego oraz specjalistycznego oprogramowania do analizy.
    1. Włącz zasilanie systemu obrazowania, poczekaj, aż stolik mikroskopu zostanie prawidłowo zainicjowany, a następnie włącz źródło światła LED.
    2. Dodaj olejek immersyjny (współczynnik załamania światła 1,520 dla żywych próbek w temperaturze 37 °C) na soczewkę obiektywu 60x 1,42 NA. Umieść szkiełko podstawowe na mikroskopie ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę soczewki obiektywu i odpowiednio zabezpiecz szkiełko.
    3. Użyj jasnego pola lub oświetlenia fluorescencyjnego, aby zidentyfikować komórki docelowe. Dostosuj ostrość, aż będzie można wyraźnie obserwować komórki docelowe. Nie przesuwaj soczewki obiektywu poza obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć niepotrzebnych zadrapań.
    4. Zidentyfikuj transporter glukozy 4 sprzężony z białkiem zielonej fluorescencji (GFP-GLUT4) za pomocą sygnału GFP. Zidentyfikuj żądane komórki docelowe do akwizycji obrazu. Wybrana pozycja komórki docelowej może zostać zapamiętana do wykorzystania w przyszłości (Rysunek 4).
    5. Ustaw odpowiednie parametry eksperymentalne (w tym liczbę pikseli, długość fali wzbudzenia, procent transmisji, czas ekspozycji, grubość stosu, przedział czasowy i całkowity czas obrazowania) na każdej komórce docelowej. W tym eksperymencie numer piksela obrazu został ustawiony na 512 x 512 (można go ustawić na 1 024 x 1 024 w celu uzyskania wyższej rozdzielczości) dla sygnałów GFP. Czas naświetlania został ustawiony w zakresie od 0,025 do 0,05 s na każde 5 minut. Drobne boczne korekty x, y i z mogą być kontrolowane przez zalecane oprogramowanie (tabela materiałów).
    6. Ustaw parametr ekspozycji na około 2 000 do 3 000 zliczeń, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli. Aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne, zmniejsz procent transmisji światła wzbudzającego tak bardzo, jak to możliwe, utrzymując czas ekspozycji krótszy niż 1 s. Powtórz te kroki dla każdego dodatkowego kanału fluorescencyjnego (kanałów) fluorescencji i każdego indywidualnego obszaru zainteresowania.
    7. Ustaw górny i dolny limit stosu Z dla każdej komórki docelowej. Można to osiągnąć, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna i dolna część komórki docelowej będą nieznacznie nieostre. Użytkownicy mogą dostosować rozdzielczość osi Z, ustawiając liczbę obrazów między górnym a dolnym limitem (można to zrobić, ustawiając odległość między każdym obrazem).
    8. Stosy obrazów zostały zdekonwolucjonowane, a następnie przeanalizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania – w tym przypadku Velocity firmy PerkinElmer.

Wyniki

Neurony podwzgórza hodowane z myszy zostały dodatkowo zidentyfikowane poprzez immunobarwienie przeciwciałem przeciwko białku specyficznemu dla podwzgórza – proopiomelanokortynie (POMC) oraz markerowi neuronalnemu – białku MAP2 (microtubule-associated protein 2) (Rysunek 2A). Potwierdziliśmy, że pierwotne hodowle neuronów podwzgórza wykazują ekspresję białka podwzgórza POMC. Ekspresję receptora CCR5 oraz CCL5 w neuronach podwzgórza zidentyfikowano za pomocą specyficznych przeciwciał i współbarwiono przeciwciałem przeciwko POMC (Rysunek 2A, 2B).

Po 3 dniach hodowli neurony przetransfekowano DNA GFP (Rysunek 3) lub GLUT4 sprzężonym z GFP (Rysunek 4). Ekspresja GFP jest zazwyczaj widoczna w całej komórce bez określonego wzorca (Rysunek 3), natomiast GLUT4-GFP wykazuje ekspresję w postaci struktur punktowych w cytozolu (Rysunek 4). Zestaw do transfekcji użyty w tej badaniu nie jest najskuteczniejszą metodą transfekcji neuronów; jest on jednak metodą mniej rygorystyczną, co zapewnia lepszą przeżywalność komórek po transfekcji, co z kolei przekłada się na lepsze obrazowanie i rejestrację żywych komórek w dalszej części eksperymentu. Obrazy neuronów wykazujących ekspresję GFP-GLUT4 wykonano przed nagraniami time-lapse (Rysunek 4A-B, wideo uzupełniające 1, 2) po stymulacji insuliną lub stymulacji CCL5 (Rysunek 4C, wideo uzupełniające 3). Sygnały GFP oraz GFP-GLUT4 w neuronach są wyraźne i silne.

Neurony podwzgórza z transfekcją GLUT4-GFP zostały następnie poddane działaniu insuliny (40 U), aby scharakteryzować transport GFP-GLUT4. Reprezentatywne filmy przedstawiające ruch GLUT4-GFP po stymulacji insuliną w neuronach podwzgórza typu WT oraz CCR5-/- pokazano odpowiednio w Video 1 i Video 2.

Disekcja embrionów i stadia rozwoju; obrazy mikroskopowe w ustawieniu eksperymentu naukowego.
Rysunek 1: Izolacja tkanek z różnych obszarów mózgu myszy w stadium embrionalnym (dzień 16,5). (A-D) Kroki obejmujące oddzielenie płodów od łożyska. (E, F) Disekcja głowy płodu od ciała. (G-I) Kroki obejmujące izolację całego mózgu z czaszki. Czarna strzałka wskazuje kierunek pociągnięcia podczas usuwania czaszki za pomocą pęsety. (J) Izolacja podwzgórza. Czarna strzałka wskazuje obszar podwzgórza pomiędzy ramionami pęsety. (K-L) Izolacja kory mózgu myszy. Czarna gwiazdka oznacza obszar korowy mózgu myszy, a biała strzałka wskazuje oddzielenie kory od całego mózgu. (M-O) Oddzielenie części hipokampa od kory. Górna biała strzałka oznacza tkankę hipokampa, a dolna biała strzałka oznacza tkankę korową. Paski skali = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna, marker neuronów MAP2, CCR5, POMC, CCL5, nałożone obrazy. Badanie immunofluorescencyjne.
Rycina 2: Charakterystyka hypothalamicznego markera neuronalnego - POMC oraz koekspresja CCL5 i CCR5. (A) Pierwotne hodowle neuronów podwzgórza zostały znakowane hypothalamicznym markerem neuronalnym - POMC (czerwony), koekspresją CCR5 (zielony) oraz markerem neuronów MAP2 (szary). (B) Ekspresja CCL5 (zielony) w pozytywnych pod kątem POMC (czerwony) neuronach podwzgórza (Adaptowano z danych uzupełniających do referencji17). DAPI posłużył do znakowania jąder komórkowych kolorem niebieskim. Paski skali = 50 µm na zdjęciach (A) i (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna hodowli neuronalnej barwionej GFP i DAPI; analiza żywotności komórek.
Rycina 3: Ekspresja białka GFP w pierwotnych neuronach myszy. Plazmidowe DNA GFP przetransfekowane do pierwotnych hodowli neuronów po 4 dniach hodowli (DIV4) za pomocą liposomów i eksponowane przez kolejne 3 dni (DIV7). (A-B) GFP wykazuje ekspresję zarówno w neurytach, jak i somie. (C-D) Neurony po pozornej transfekcji; DAPI oznakował jądra komórkowe w panelach (B, D). Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna pokazująca INS i CCL5 w komórkach WT oraz CCR5^-; analiza ekspresji białek.
Rycina 4: Obrazy GFP-GLUT4 w neuronach podwzgórza. (A, C) Białko GFP-GLUT4 wykazane w neuronach podwzgórza typu dzikiego (WT) oraz (B) w neuronach podwzgórza CCR5-/-. Neurony stymulowano insuliną (A, B) lub CCL5 (C). Strzałki wskazują punkty GFP-GLUT4 w neurytach przed (-) i po (+) stymulacji insuliną lub CCL5, a gwiazdki wskazują GLUT4-GFP na powierzchni przed (-) i po (+) stymulacji CCL5 w (C). (Rycina zaadaptowana z referencji17). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bufor boranowy 5xFirmaNumer katalogowyObjętość
Kwas borowySigma-AldrichB67681.55 g
BoraksSigma-Aldrich719972.375 g
ddH2O100 mL
Przefiltrować, przechowywać w 4 °C
Roztwór stokowy poli-D-lizyny 20xFirmaNumer katalogowyObjętość
Poli-D-lizynaSigma-AldrichP6407100 mg
ddH2O100 mL
Przefiltrować, przechowywać w -20 °C
Poli-D-lizyna 1xObjętość
Poli-D-lizyna 20x5 mL
Bufor boranowy 5x20 mL
ddH2O75 mL
Suma100 mL
Przechowywać w 4 °C
Medium do płukaniaFirmaNumer katalogowyObjętość
DMEM-High glucoseGibco12800-017495 mL
Antibiotic-AntimyoticGibco15240-0625 mL
Suma500 mL
Przechowywać w 4° C
Bufor do trawienia papainą i trypsyną:FirmaNumer katalogowyObjętość/stężenie końcowe
Papaina (10 mg/mL)Sigma-AldrichP4762200 µL (2 mg/mL)
Trypsyna-EDTA (0.25%)Gibco25200-072200 µL (0.05%)
Medium do płukania600 µL
Suma1,000 µL
Przechowywać w -20 °C
Medium do wysiewania:FirmaNumer katalogowyObjętość
Medium NeurobasalGibco21103-049176 mL
Płodowa surowica bydlęcaGibco10437-02820 mL
L-glutaminian (200 mM)Gibco250302 mL
Antibiotic-AntimyoticGibco15240-0622 mL
Suma200 mL
Przechowywać w 4 °C
Pełna pożywka hodowlanaFirmaNumer katalogowyObjętość
Medium NeurobasalGibco21103-04995 mL
Suplement N2 (100x)Gibco17502-0481 mL
Suplement B27 (50x)Gibco17504-042 mL
L-glutaminian (200 mM)Gibco250301 mL
Antibiotic-AntimyoticGibco15240-0621 mL
Suma100 mL
Przygotować bezpośrednio przed użyciem

Tabela 1: Skład buforu do trawienia i pożywek użytych w niniejszym badaniu.

Wideo uzupełniające 1: Ruch GFP-GLUT4 stymulowany insuliną w neuronach podwzgórza typu WT. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 2: Ruch GFP-GLUT4 stymulowany insuliną w neuronach podwzgórza CCR5-/-. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 3: Ruch GFP-GLUT4 stymulowany przez CCL5 w neuronach podwzgórza typu WT (Wideo zaadaptowane z referencji17). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Możliwość monitorowania żywych komórek po CCL5 lub stymulacji insuliną jest niezwykle ważna dla badania szybkiego wpływu CCL5 lub insuliny na ruch GLUT4. W rzeczywistości pozwala nam to uwidocznić znaczącą różnicę między neuronami podwzgórza WT i CCR5-/- po stymulacji insuliną. Przeprowadziliśmy znakowanie powierzchniowe endogennego białka GLUT4 w neuronach podwzgórza WT i CCR5-/- w różnych punktach czasowych po stymulacji insuliną17. Znakowanie białek powierzchniowych komórek wymaga przeciwciała o wysokiej swoistości i niskim tle. Ponadto kwantyfikacja fluorescencji powierzchniowej może być również trudna i czasochłonna. W ten sposób zapis poklatkowy pozwala nam być pewnym, że działanie CCL5 lub insuliny jest prawdziwą zmianą fizjologiczną opartą na warunkach eksperymentalnych, a nie zmiennością statystyczną. Wraz z znakowaniem powierzchniowym endogennego GLUT4 dostarczamy mocnych dowodów i eksperymentów, aby pokazać, w jaki sposób CCL5 i CCR5 uczestniczą w translokacji GLUT4 i sygnalizacji insuliny.

We współczesnych badaniach biologii komórki i biologii molekularnej wiele eksperymentów wymaga wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej. Technologia ta pozwala naukowcom na wizualizację relacji przestrzennych między białkami i/lub organellami komórkowymi, a także kierunku i prędkości ruchu, efektów stymulujących, zmian morfologicznych i transportu białek. Jednak technologia ta nadal ma swoje ograniczenia: gdy fluorofory są wzbudzane, sygnały emitowane z docelowego białka (lub obszaru) mogą zostać przytłoczone przez fluorescencję tła. W rezultacie obrazy fluorescencyjne mogą wydawać się rozmyte, a oczekiwane sygnały są głęboko zakopane w sygnałach tła. Zjawisko to jest szczególnie widoczne w przypadku obserwacji białek związanych z błoną.

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) została opracowana w celu przezwyciężenia tej trudności. Pozwala naukowcom na wizualizację wzbudzenia wybranych fluoroforów związanych z powierzchnią bez wpływu na fluorofory tła. Pozwala naukowcom na selektywne charakteryzowanie cech i zdarzeń na bardzo cienkim obszarze powierzchni, takim jak błona plazmatyczna. Mikroskopia dekonwolucyjna to technika przetwarzania obrazu wymagająca dużej mocy obliczeniowej, która stała się możliwa dzięki postępowi technologicznemu w ostatnich latach. Jest często wykorzystywany do poprawy rozdzielczości obrazu fluorescencji cyfrowej. Jak wspomniano wcześniej, gdy fluorofory są wzbudzane przez dowolny rodzaj oświetlenia (taki jak laser lub dioda LED), wszystkie fluorofory będą emitować sygnały świetlne niezależnie od tego, czy są ostre, czy nie, więc obraz zawsze będzie wyglądał na rozmyty. To rozmycie jest spowodowane zjawiskiem zwanym "funkcją rozproszenia punktowego" (PSF), ponieważ światło pochodzące z małego źródła fluorescencyjnego (jasnego punktu) rozchodzi się dalej i staje się nieostre (rozmycie). Zasadniczo zdarzenie to wytworzy sygnał fluorescencyjny w kształcie klepsydry, a obraz fluorescencyjny może składać się z wielu takich sygnałów świetlnych. Proces dekonwolucji może ponownie przypisać wszystkie sygnały fluorescencji do ich pierwotnej formy jasnej plamki i wyeliminować większość nieostrego światła, aby poprawić kontrast obrazu.

W ostatnich latach algorytmy dekonwolucyjne wygenerowały obrazy o rozdzielczości porównywalnej do mikroskopu konfokalnego. Co więcej, w porównaniu z TIRFM, który zapobiega wykrywaniu rozmycia nieostrego przez ograniczony obszar wzbudzenia, mikroskopia szerokokątna umożliwia wykrycie wszystkich sygnałów świetlnych i ponowne przypisanie ich z powrotem do źródła w procesie dekonwolucji. Dlatego w praktyce mikroskopia dekonwolucyjna stała się nie tylko bardziej wydajną metodą pozyskiwania obrazu, ale także bardziej opłacalną metodą w porównaniu z mikroskopią TIRF.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za dotacje udzielone przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) oraz dopłatę zdrowotną i socjalną do wyrobów tytoniowych - MOHW106-TDU-B-212-144001 dla S-Y C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop dekonwolucyjny DeltaVisionApplied Precision Inc./(GE Healthcare, Life Science) wyposażony w soczewkę obiektywową zanurzeniową z olejkiem 60x/1,42 NA; służy do robienia zdjęć na żywo komórek
Oprogramowanie aplikacyjne SoftWorXApplied Precision Inc.służy do sterowania mikroskopem i kamerą
Oprogramowanie VoloCITYPerkinElmersłuży do analizy obrazów
InsulinaActrapid, Dania
LiposomeInvitrogen11668019Lipofectamine® 2000, używany do transfekcji plazmidu DNA
GFP plazmidowe DNAdostarczone przez profesora Samuela Cushmana
Plazmidowe DNAdostarczone przez profesora Samuela Cushmana
Anty-mysie Alex-488Invitrogen#A-11001Wtórne przeciwciało
anty-królicze IgG -Alex-568Invitrogen#A-11036Wtórne przeciwciało
CCL5/RANTESR& D Systems478-MR-02510ng / ml
KimwipesKimberly-Clark#FL42572Agrubość 0,17
mm 12 mm Szkło nakrywkowe mikroskopuDeckglaser#41001112używane do badania niebezpiecznego
nożyczek do mikropreparowaniaKlappeneckerNarzędzie chirurgiczne
kleszcze z zakrzywioną końcówkąIdeal-tekNarzędzie
chirurgicznestandardowe kleszcze z prostą końcówkąIdeal-tekNarzędzie chirurgiczne
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362Purify Pipeta plazmidowa DNA 5 ml Purify Endotoksyna bez endotoksyn
Corning costar 4487dysocjacja tkanki mózgowej
kontrola GFP-GLUT4

Bibliografia

  1. Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
  2. Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
  3. Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017(2012).
  4. Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
  5. Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
  6. Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
  7. Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
  8. Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
  9. Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
  10. Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246(2012).
  11. Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
  12. Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
  13. Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
  14. Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
  15. Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
  16. Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
  17. Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659(2016).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pierwotna hodowla neuronówstymulacja insulinąmyszy z nokautem genu CCR5translokacja GFP-GLUT4obrazowanie żywych komórektrawienie tkanekmikroskopia fluorescencyjna
Obrazy na żywo transportu białka GLUT4 w pierwotnych neuronach podwzgórza myszy przy użyciu mikroskopii dekonwolucyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.