Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Podsumowanie

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, ^MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Streszczenie

Insulina reguluje systematyczny metabolizm w podwzgórzu i obwodową odpowiedź na insulinę. Reakcja zapalna w obwodowych tkankach tłuszczowych przyczynia się do rozwoju cukrzycy typu 2 (T2DM) i regulacji apetytu w podwzgórzu. Sugeruje się, że poziomy chemokiny CCL5 i receptora chemokiny C-C typu 5 (CCR5) pośredniczą w miażdżycy i nietolerancji glukozy w cukrzycy typu 2 (T2DM). Ponadto CCL5 odgrywa rolę neuroendokrynną w podwzgórzu, regulując przyjmowanie pokarmu i temperaturę ciała, co skłania nas do zbadania jego funkcji w sygnalizacji insuliny podwzgórzowej i regulacji obwodowego metabolizmu glukozy.

System infuzji mózgu z mikropompą osmotyczną to szybki i precyzyjny sposób na manipulowanie funkcją CCL5 i badanie jej wpływu na mózg. Zapewnia również wygodne alternatywne podejście do generowania transgenicznego zwierzęcia nokautującego. W tym systemie sygnalizacja CCL5 została zablokowana przez infuzję śródmózgowo-komorową (ICV) jego antagonisty, ^MetCCL5, za pomocą pompy mikroosmotycznej. Obwodowy metabolizm glukozy i odpowiedź na insulinę wykryto za pomocą doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT). Aktywność sygnalizacyjną insuliny analizowano następnie za pomocą blot białkowego z próbek tkanek pochodzących od zwierząt.

Po 7-14 dniach infuzji ^MetCCL5, metabolizm glukozy i reakcja na insulinę były upośledzone u myszy, co widać w wynikach OGTT i ITT. Fosforylacja seryny302 IRS-1 była zwiększona, a aktywność Akt została zmniejszona w neuronach podwzgórza myszy po zahamowaniu CCL5. Podsumowując, nasze dane sugerują, że blokowanie CCL5 w mózgu myszy zwiększa fosforylację IRS-1 S302 i przerywa sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do zmniejszenia funkcji insuliny w tkankach obwodowych, a także upośledzenia metabolizmu glukozy.

Wprowadzenie

Insulina wpływa na wiele różnych tkanek, w tym na mózg. Insulina przechodzi przez barierę krew-mózg, dostaje się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i wiąże się z receptorem insuliny (IR) w podwzgórzu, aby regulować przyjmowanie pokarmu, aktywność współczulną i obwodową odpowiedź na insulinę. Zaproponowano, że przewlekły stan zapalny w obwodowych tkankach tłuszczowych przyczynia się do cukrzycy typu 2 (T2DM), ale sposób, w jaki te reakcje zapalne wpływają na sygnały insuliny w podwzgórzu, pośrednicząc w ogólnoustrojowej odpowiedzi na insulinę i nietolerancji glukozy, pozostaje niejasny. Niektóre chemokiny uczestniczą w regulacji apetytu i regulacji temperatury ciała w podwzgórzu¹, takie jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), interleukina (IL)-6, IL-1β, białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) i CCL5 (ligand motywu C-C 5). Ponadto stan zapalny w podwzgórzu prowadzi do insulinooporności w T2DM^2,3.

Wśród tych chemokin, zmiana poziomów ekspresji chemokiny CCL5 i jej receptora, CCR5, w tkance tłuszczowej była związana z miażdżycą i nietolerancją glukozy w cukrzycy typu 2 zarówno u ludzi, jak i u zwierząt. CCL5 pełni również funkcje neuroendokrynne, w tym regulację spożycia pokarmu i temperatury ciała w podwzgórzu. Dlatego ważne jest zbadanie, czy CCL5 uczestniczy w aktywacji sygnału insuliny w podwzgórzu lub tkankach obwodowych.

Sygnalizacja insuliny jest ściśle regulowana w komórkach. Wiązanie insuliny z receptorami insuliny (IR) aktywuje białka substratu receptora insuliny (IRS), a następnie kinazę 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) i aktywację kinazy białkowej B (PKB/AKT) oraz translokację błonową transportera glukozy-4 (GLUT4)⁴. Białka IRS są kluczowymi regulatorami w tym szlaku sygnałowym: mają wiele reszt tyrozyny i seryny, które mogą być fosforylowane w odpowiedzi na pozytywne lub negatywne sygnały insuliny⁵. Na przykład fosforylacja seryny 302 na IRS-1 może prowadzić do fizycznej dysocjacji IRS-1 od IR i blokować transdukcję sygnału insuliny, prowadząc do insulinooporności⁶. Wykazano, że upośledzenie aktywności białek IRS w podwzgórzu indukuje insulinooporność i nietolerancję glukozy u myszy⁷.

Jednym z powszechnych sposobów badania funkcji określonego genu jest manipulowanie ekspresją docelowych genów rozmieszczonych w całym ciele organizmu. Może to jednak mieć kilka wad: 1) może generować różne efekty regulacyjne lub kompensacyjne sprzężenia zwrotnego w czasie oraz 2) ta metoda nie pomaga nam zilustrować roli białka docelowego w określonych regionach mózgu. Ponadto zwierzęta z nokautem genów specyficznych dla tkanek i komórek potrzebują dużo czasu na rozmnażanie i są kosztowne. W związku z tym stosujemy system krótkotrwałej pompy osmotycznej do infuzji mózgu - stosunkowo szybki i wygodny sposób na zakłócenie sygnalizacji białka docelowego w mózgu za pomocą leku antagonistycznego w celu przezwyciężenia wyżej wymienionych problemów. Zastrzyki stereotaktyczne wymagały skomplikowanych umiejętności chirurgicznych i rozległych inwestycji w oprzyrządowanie i czas. W tym protokole zapewniamy prosty i bezpieczny sposób wykonania wstrzyknięcia stereotaktycznego oraz szybką, mniej szkodliwą i natychmiastową metodę wykrywania stężenia glukozy we krwi i badania roli CCL5 w regulacji sygnalizacji insuliny w podwzgórzu.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły i metody stosowane u zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Tajpej (numery protokołów: LAC-2014-0387)

1. Przygotowanie systemów infuzyjnych z mikropompą osmotyczną

UWAGA: Przygotuj pompę, bufor sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) i lek (roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL w aCSF)) w sterylnych warunkach, używając przefiltrowanych filtrami 0,2 μm i przeprowadź wszystkie procedury pod kapturem hodowlanym w rękawiczkach. Zabiegi chirurgiczne przeprowadza się w następujący sposób:

1. Przygotuj pompy mikroosmotyczne na dzień przed zabiegiem: Napełnij pompę mikroosmotyczną mózgu sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły z główką dostarczonych wraz z zestawem. Zanurz pompę mikroosmotyczną w płynie CSF, umieść ją na shakerze i delikatnie wstrząśnij przez noc.
   UWAGA: Pompę należy napełnić płynem CSF i unikać pęcherzyków powietrza wewnątrz pompy (Rysunek 1A).
2. Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować rekombinowany roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml, rozcieńczony w aCSF) do wykorzystania w eksperymencie. Usunąć płyn CSF z pompy i powoli napełniać pompę roztworem leku, aż nadmiar wycieknie.
   UWAGA: 15 ml roztworu aCSF lub Met-CCL5/RANTES wystarcza na 5-8 pomp.
   UWAGA: Powtórz procedurę, aby upewnić się, że pompa jest całkowicie wypełniona lekiem bez pęcherzyków w środku.
3. Przyciąć rurki cewnika na żądaną długość i przymocować je igłą do infuzji mózgu w zestawie do infuzji mózgu. Napełnij zestaw infuzyjny i probówki lekiem.
4. Na koniec zmontuj i podłącz zestaw do infuzji mózgu do pompy mikroosmotycznej.
   UWAGA: W rurze ani pompie nie powinny tworzyć się pęcherzyki powietrza (Rysunek 1A).
5. Zanurz cały zestaw do fuzji pompy osmotycznej i mózgu w CSF w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 ml, aby zapobiec wysychaniu pompy. Zestaw do fuzji pompy osmotycznej z mózgiem jest teraz gotowy do użycia podczas operacji.
   UWAGA: Systemy pomp mikroosmotycznych mogą być używane do długotrwałego wlewu leków. Zapewnia to bezpieczny i wygodny sposób dostarczania leku do mózgu myszy.

2. Chirurgia komorowa śródmózgowa – wszczepienie mikropompy osmotycznej

UWAGA: Wysterylizuj środowisko chirurgiczne 75% etanolem i upewnij się, że osoby biorące udział w badaniu noszą sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny. Narzędzia/instrumenty chirurgiczne muszą być autoklawowane i suszone przed użyciem, a następnie sterylizowane 75% etanolem pomiędzy operacjami na myszach.

1. Zważ mysz i znieczul ją za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) z ketaminą/ksylazyną (ketamina 50 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
   UWAGA: Masy ciała myszy o masie ciała mniejszej niż 24 g nie są zalecane do operacji implantacji pompy osmotycznej.
2. Zamontuj i zamocuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym (Rysunek 1B).
3. Użyj nożyczek chirurgicznych i szczypiec, aby rozciąć zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Użyj jodu do oczyszczenia czaszki obwodowej.
4. Oddziel najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej za pomocą pary szczypiec z głową w pobliżu okolicy szyi w celu implantacji zestawu do fuzji pompy osmotycznej i mózgu (Rysunek 1C).
5. Oznacz punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu (Rysunek 1D) za pomocą aparatu stereotaktycznego. W tym eksperymencie igła musi zostać wszczepiona w obszar 3. komory (Bregma: 0,0 mm boczny, 1,3 mm tylny, 5,7 mm brzuszny).
6. Wywierć otwór za pomocą wiertła do gwoździ wokół obszaru zaznaczonego na czaszce (Rysunek 1E).
   UWAGA: Uważaj, aby nie połamać opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy, unikając w ten sposób przerwania mikronaczyń krwionośnych w mózgu.
7. Umieść zestaw do fuzji pompy mikroosmotycznej z mózgiem zawierający CSF (jako kontrolę) lub lek (roztwór białka Met-CCL5 / RANTES) pod skórą za obszarem szyi i włóż igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu, aby wstrzyknąć lek do mózgu myszy (Rysunek 1E). Igła przebije opony mózgowe i dostanie się do komory. Przymocuj igłę do czaszki za pomocą żelu odczulającego powierzchnię (Rysunek 1F) i odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Następnie odetnij wystającą część na górze igły (Rysunek 1G-H).
8. Użyj kleju do tkanek, aby zagoić ranę pooperacyjną na głowie. Nałóż 50 μl kleju na wierzch rany, przyciągnij obie strony skóry do siebie i przytrzymaj przez 30 sekund, aby skóra się uszczelniła (Rysunek 1I).
   UWAGA: Użyj 100% wacika nasączonego alkoholem do oczyszczenia rany po operacji i 100% ul penicyliny ze streptomycyną, aby zapobiec infekcji. UWAGA: Skóra myszy utworzy tkankę bliznowatą i zagoi się w ciągu kilku dni po podaniu kleju chirurgicznego. Główną zaletą kleju jest uniknięcie stosowania szwów chirurgicznych, które mogą powodować podrażnienia lub stany zapalne skóry.
9. Umieść mysz w czystej klatce umieszczonej na ciepłym talerzu (podgrzanym do 37 °C) i poczekaj, aż mysz wyzdrowieje po działaniu znieczulającym.
   UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie temperatury ciała myszy, aby zwiększyć szansę na przeżycie po operacji.
10. Po tygodniowym okresie rekonwalescencji myszy będą gotowe do dalszych eksperymentów, takich jak doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test tolerancji insuliny (ITT).

3. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT)

UWAGA: Wykonaj doustny test tolerancji glukozy 7 dni po infuzji aCSF i ^MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Utrzymuj 6-godzinny post dla myszy przed OGTT z wystarczającym dopływem wody. Trzymaj zwierzęta na tym samym stole roboczym, na którym będą wykonywane eksperymenty, aby mogły zaaklimatyzować się do środowiska i zmniejszyć stres podczas zabiegu.

1. Przygotowanie roztworu glukozy: Przed przeprowadzeniem eksperymentu należy przygotować roztwór glukozy, rozpuszczając 3,75 g glukozy w 15 ml destylowanego_H2O.
2. Ustal harmonogram rejestrowania odczytów podczas procedury doświadczalnej (Tabela 1).
   UWAGA: Ważne jest, aby ustalić harmonogram z odpowiednimi odstępami czasu między każdym badaniem krwi, aby umożliwić dokładne rejestrowanie podczas eksperymentu.
3. Zważ każdą mysz po poście i oblicz odpowiednią ilość glukozy do wstrzyknięcia. Na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość podawanego roztworu glukozy powinna wynosić 300 μl.
4. Na stole warsztatowym przygotuj następujące instrumenty:
   1. Glukometr (naciśnij przycisk start, aby sprawdzić stan baterii, upewnij się, że działa przed testem.)
   2. Chip glukozowy
   3. Strzykawka insulinowa (0,3 ml strzykawki insulinowej)
   4. Żyletki
   5. minutnik
5. Po ustawieniu ławki zmierz i zapisz poziom glukozy we krwi w następujący sposób: Włóż czysty i nowy chip glukozowy do glukometru i naciśnij przycisk start, aby go wyzerować.
6. Podnieś mysz za kark i pogłaszcz ogon kilka razy, aby zapewnić wystarczający przepływ krwi do okolicy ogona.
7. Za pomocą nowej żyletki odetnij mały kawałek ogona i wyciśnij jedną małą kroplę krwi (około 10-20 μl) do chipa glukozowego. Krew powinna wypełnić chip, aby umożliwić dokładny pomiar. Glukometr natychmiast wyświetli poziom glukozy. Jeśli urządzenie pokazuje "błąd", powtórz procedurę z nowym chipem glukozowym.
   UWAGA: Chip glukozowy wymaga tylko jednej kropli krwi. Gdy próbka krwi musi zostać pobrana więcej niż raz, po prostu należy wycisnąć, kilkakrotnie przesuwając palcami wzdłuż ogona myszy, trzymając koniec ogona bezpośrednio na chipie, aby pobrać krew. Nie jest konieczne obcinanie końca ogona za każdym razem podczas pobierania próbek krwi.
8. Następnie nakarm myszy glukozą (0,25 g / ml) doustnie, stosując technikę gajnika żołądkowego. Ilość glukozy, która ma być podawana, powinna być obliczana za pomocą wzoru: 10X masa ciała (m.c.) μl roztworu glukozy (na przykład, jeśli mysz waży 30 g, ilość roztworu glukozy do podania wyniesie 300 μL). Uruchom minutnik natychmiast po podaniu doustnie glukozy.
9. Powtórz procedurę pomiaru glukozy po 15, 30, 60, 90 i 120 minutach.
10. Po zarejestrowaniu wszystkich odczytów poziomu glukozy wyrzuć żyletki i wiórki glukozy do pojemnika na zagrożenie biologiczne. Włóż jedzenie z powrotem do klatek dla myszy i załóż je z powrotem do pokoju dla zwierząt.

4. Test tolerancji insuliny (ITT)

UWAGA: Test tolerancji insuliny i doustny test tolerancji glukozy powinny być zaplanowane w odstępie co najmniej 7 dni, aby zmniejszyć efekt postu u zwierząt. W teście tolerancji insuliny (ITT) insulina ludzka (0,75 j./kg) będzie podawana we wstrzyknięciu IP.

1. Przygotowanie roztworu insuliny 0,25 j.: Rozcieńczyć insulinę ludzką 100 j. w stosunku 1:400 w roztworze soli fizjologicznej.
2. Zważ każdą mysz po poście i odpowiednio oblicz wstrzykniętą ilość insuliny: objętość (μL) 0,25 U insuliny do wstrzyknięcia IP = 3 X BW (0,75 U insuliny/kg masy ciała). Na przykład: dla myszy o masie ciała 28,8 g wstrzyknąć: 28,8 X 3 = 86,4 μl (0,25 j. rozcieńczonej insuliny) (Tabela 2).
   UWAGA: Te same zwierzęta mogą mieć różną masę ciała po 6 godzinach postu w różne dni. W związku z tym konieczne jest zmierzenie masy ciała tuż przed i po poście oraz przeprowadzenie testu OGTT i ITT. Masa ciała myszy może spaść w zależności od gatunku, płci i czasu trwania postu. Wyższe dawki insuliny mogą spowodować wstrząs insulinowy i doprowadzić do śmierci zwierzęcia.
3. Ustawić tabelę (Tabela 2) do zapisywania odczytów podczas procedury doświadczalnej. Powtórz kroki 3.4. zgodnie z pkt 3.8. do pomiaru poziomu glukozy we krwi.

Wyniki

Na myszach przeprowadzono chirurgiczne implantacje pomp infuzyjnych zawierających albo CSF jako kontrolę, albo antagonistę CCL5 ^MetCCL5 (w celu zablokowania efektów CCL5 w mózgu). Po 7 i 14 dniach od operacji tolerancję glukozy obwodowej i reakcję na insulinę myszy analizowano za pomocą OGTT (po 7 dniach) i ITT (po 14 dniach), jak wspomniano w protokole. Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test tolerancji insuliny (ITT) myszy przeprowadzono po 6 godzinach na czczo. Myszom podawano doustnie glukozę, której ilość zależała od ich masy ciała. Zmiany poziomu glukozy we krwi zostały zarejestrowane, jak pokazano na Rysunek 3. Test wrażliwości na insulinę przeprowadzono przez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie insuliny myszom i natychmiast zmierzono zmianę poziomu glukozy we krwi. Zmiany poziomu glukozy we krwi po stymulacji insuliną u myszy z różnymi lekami infuzyjnymi zostały zarejestrowane, jak pokazano na Rysunek 4. Poziom glukozy we krwi był tylko nieznacznie obniżony po podaniu glukozy (Figura 3B) i wstrzyknięciu insuliny (Figura 4B) u myszy z infuzją antagonisty CCL5 (^MetCCL5) w porównaniu z myszami z infuzją CSF. Wyniki te sugerują upośledzenie funkcji insuliny w obwodowym metabolizmie glukozy u myszy z ^MetCCL5 podawanym do mózgu.

Następnie przeanalizowaliśmy aktywację sygnału insuliny, oceniając poziom fosforylacji IRS-1 i aktywacji Akt w tkankach podwzgórza. Fosforylacja seryny na 302 IRS-1 była regulowana w górę u myszy leczonych antagonistą (^MetCCL5) (Figura 5B-C), gdy myszy były karmione normalnie. W grupie kontrolnej aCSF podawano podwzgórzu myszy, a prowokacja insuliną aktywowała cząsteczkę sygnałową Akt (fosforylowany Akt Serine 473) (Figura 5D, F) bez zwiększania aktywacji IRS-1 seryny302 ( Figura 5D-E) i fosforylacji Akt seryny473. W przeciwieństwie do tego, sygnał Akt nie został zwiększony u myszy, którym podawano ^MetCCL5, ale zamiast tego nastąpił wzrost fosforylacji seryny IRS-1 302. Tymczasem zablokowanie sygnału CCL5 w mózgu myszy przerwało aktywność insuliny w podwzgórzu i upośledzało obwodową funkcję insuliny. Z naszych ogólnych ustaleń, takich jak wyniki ITT, OGTT i prowokacji insuliną ex vivo, doszliśmy do wniosku, że CCL5 w podwzgórzu przyczynia się do aktywacji sygnału insuliny i obwodowego metabolizmu glukozy po stymulacji insuliną.

Rysunek 1. Przygotowanie pompy osmotycznej i zabieg chirurgiczny implantacji u myszy. (A) Zestaw do infuzji mózgu i preparat pompy wypełnione roztworem leku. Czerwone strzałki wskazują rurki cewnika wypełnione płynem. (B) Zamocuj i zamontuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym. (C) Oddzielić najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej w celu wszczepienia zestawu do infuzji pompy mikroosmotycznej i mózgu; Linie kreskowe wskazują lokalizację implantów pompy osmotycznej. (D) Strzałka wskazuje stronę infuzji. (E) Wywierć otwór wokół zaznaczonego obszaru na czaszce. (F) Umieść zestaw do infuzji pompy osmotycznej i mózgu z tyłu myszy i włóż igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu (kreska zakreślona). (G) Przymocuj igłę do czaszki za pomocą kleju tkankowego i odczep górną część igły (nożyczki skierowane w G), jak pokazano na (H). (I) Uszczelnić ranę za pomocą kleju tkankowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy obszaru dyfuzji leku, gdy lek jest podawany w okolicy komorowej za pomocą pompy osmotycznej. Niebieski Evana jest reprezentatywnym lekiem stosowanym na ilustracji wlewu leku pompy osmotycznej do obszaru komorowego (A) i dyfuzji do komór bocznych i trzecich (B). Podziałka = 0,5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Metabolizm glukozy u myszy po operacji mierzony doustnym testem tolerancji glukozy (OGTT). Rozkład poziomu glukozy we krwi zmienił się po doustnym podaniu glukozy myszom WT z infuzją aCSF (A) i antagonisty ^MCCL5 (B). Dane pokazane jako średnia ± SE. (Rysunek zmodyfikowany z⁸). *p<0,05, przez dwukierunkową ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Funkcja insuliny u myszy stężenie glukozy we krwi - test tolerancji insuliny (ITT). Rozkład poziomu glukozy we krwi zmienił się po wstrzyknięciu insuliny u myszy WT z infuzją aCSF (A) i podawaną antagonistą ^MCCL5 (B). Dane przedstawione jako średnia ± SE (rysunek zmodyfikowany z ⁸). p<0,001, przez dwukierunkową ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Aktywność sygnału insuliny u myszy po operacji. (A) Western blot hamującej formy fosforylacji seryny 302 IRS-1 (substrat odpowiedzi insulinowej-1, pIRS1^S302) w tkankach podwzgórza myszy leczonych antagonistą aCSF lub CCL5, pompą infuzyjną ^MetCCL5 (^MCCL5). (B) Powiązane poziomy fosforu-IRS-1^S302 po infuzji u podwzgórza myszy z normalnym karmieniem. (C) Western blot fosforylacji S302 IRS-1 i aktywacji Akt (phosphor-Akt S473, pAkt^S473) z lub bez stymulacji insuliny w tkance podwzgórza po infuzji aCSF lub ^METCCL5. (D-E) Względne poziomy pIRS-1^S302, pS6K^T421 i pAkt^S473. ("2" na każdym wykresie słupkowym oznacza: n=2 dla wszystkich kwantyfikacji). (Puste paski w 5D-E, po lewej: bez insuliny; paski w 5D-E, po prawej: z insuliną). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział TGL TGL

#	Identyfikator myszy	ciało	glukoza	początek	0	15	Rozdział 30	60	90
		ciężar	μL =10xBW	Godzina	Min	Min	Min	Min	Min
1	Okręg wyborczy 501	25,8 gr	Rozdział 258	godz. 9:00	godz. 9:00	godz. 9:00	godz. 9:15	Godzina 9:30	godz. 10:00
cyfra arabska	Okręg wyborczy 502	25,3 gramów	Rozdział 253	Godzina 9:07	Godzina 9:07	Godzina 9:07	Godzina 9:22	Godzina 9:37	Godzina 10:07

Tabela 1. Harmonogram zapisu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT)

. Rozdział Rozdział TGL pkt. TGL pkt.

#	Identyfikator myszy	ciało	Insulina 0,25 j.m	początek	0	15	Rozdział 30	60	90
		ciężar	μL =3xBW	Godzina	Min	Min	Min	Min	Min
1	Okręg wyborczy 501	28,8 gr	86,4	godz. 9:00	godz. 9:00	godz. 9:15	Godzina 9:30	godz. 10:00	godz. 10:30
cyfra arabska	Okręg wyborczy 502	25,3 gramów	75,9	Godzina 9:07	Godzina 9:07	Godzina 9:22	Godzina 9:37	Godzina 10:07	Godzina 10:37

Tabela 2. Harmonogram zapisu testu tolerancji insuliny (ITT)

Dyskusja

Mechanizm przewlekłego stanu zapalnego i związanych z nim chemokin, takich jak CCL5 i jego receptor – CCR5, w rozwoju cukrzycy typu 2 pozostaje niejasny. Przewlekły stan zapalny powoduje infiltrację makrofagów do tkanki tłuszczowej i wpływa na regulację adipokin; w międzyczasie przyciąga również komórki β i upośledza wydzielanie insuliny z wysp Langerhansa w odpowiedzi na poziom glukozy we krwi. Podwzgórze w mózgu odgrywa ważną rolę jako centrum kontroli w koordynowaniu sygnałów insuliny i adipokiny z ogólnoustrojowych tkanek obwodowych w regulacji apetytu, metabolizmu glukozy we krwi obwodowej i odpowiedzi insulinowej. Wiele badań wskazuje również, że zapalenie podwzgórza prowadzi do wadliwej regulacji homeostazy energetycznej, a także wadliwej funkcji wysp trzustkowych i wątroby 2,3,9,10. CCL5 w mózgu przyczynia się do przyjmowania pokarmu i regulacji temperatury ciała w podwzgórzu^11,12; jednak korelacja CCL5 z podwzgórzową i ogólnoustrojową sygnalizacją insuliny jest niejasna. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wygenerowano mysz z nokautem całego ciała CCL5 (CCL5^-/-), która pokazuje fenotyp insulinooporności z wyższym poziomem insuliny i wysokim poziomem glukozy we krwi⁸. Jednak rozwój fenotypu T2DM wymaga dużo czasu i trudno jest zbadać rolę i mechanizm CCL5 w podwzgórzu sygnał insuliny ze względu na możliwe długoterminowe efekty kompensacyjne. Dlatego najlepszym podejściem jest bezpośrednia manipulacja sygnalizacją CCL5 w neuronach podwzgórza. Istnieje jednak wiele typów neuronów w regionie podwzgórza, a generowanie myszy z nokautem specyficznych dla komórek jest dość kosztowne i czasochłonne. Wykorzystanie systemu infuzyjnego ICV może zatem zaoszczędzić czas i zapewnić bardziej szczegółowe podejście do manipulowania funkcją CCL5 bezpośrednio w mózgu, omijając możliwe obwodowe reakcje zapalne.

Badania z wykorzystaniem pomp osmotycznych zostały już wcześniej opublikowane, dostarczając doskonałych przykładów i demonstracji technik związanych z implantacją pomp osmotycznych u gryzoni¹³. Jednak podczas stosowania tych protokołów w naszym badaniu stanęliśmy przed kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, niektóre ze sprzętów użytych w protokole są dość drogie, w tym 1) system elektryczny do dotarcia na miejsce, wyciągnięcia i wszczepienia igły do mózgu myszy, 2) system termiczny do utrzymywania temperatury ciała myszy i 3) system dostarczania tlenu i izofluranu do podawania znieczulenia myszom. Po drugie, techniki opisane w innych artykułach były trudne do powtórzenia, ponieważ byliśmy w stanie wykorzystać do naszych badań tylko zwierzęta w niewielkim zakresie masy ciała i w określonym wieku. Zdajemy sobie sprawę, że większe myszy bardziej nadają się do zabiegu chirurgicznego i implantacji. Jednak w naszym badaniu musieliśmy użyć mniejszych i młodszych myszy, aby uniknąć wpływu nadwagi i starzenia się na insulinę i regulację poziomu glukozy we krwi: w badaniu wybrano tylko samce myszy o masie ciała 25 ± 2 g i wieku około 2 miesięcy. W związku z tym trudno jest wykonać operację i zszyć ranę na głowie myszy. Po trzecie, reakcja zapalna musi zostać zminimalizowana po operacji, ponieważ celem tego badania jest cytokina zapalna. Myszy i szczury mogą łatwo usuwać szwy i otwarte rany po operacji, co spowoduje stan zapalny i nasilenie reakcji chemokin. Dlatego konieczna jest strategia dotarcia do miejsca oraz narysowania i wszczepienia igły do mózgu myszy, która pozwoli uniknąć wtórnej infekcji. Dlatego zmodyfikowaliśmy wcześniej opisane protokoły, aby ta technika była opłacalna, łatwiejsza i mniej szkodliwa dla zwierząt, jak opisano w następnym akapicie.

Po pierwsze, użyliśmy wiertła do gwoździ, aby ręcznie wywiercić otwór wokół obszaru docelowego zaznaczonego na czaszce, jak opisano w kroku 2.6. Ta metoda jest opłacalna i pozwala nam monitorować całą procedurę, aby uniknąć uszkodzenia opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy. Regulacja poziomu glukozy we krwi jest upośledzona po ostrym udarze, takim jak krwotok do mózgu. Ostrą hiperglikemię i zespoły cukrzycopodobne obserwowano również po udarze mózgu w warunkach klinicznych^14,15. Podobnie, stwierdziliśmy również upośledzony poziom glukozy i odpowiedź insulinową u myszy z krwotokiem i ropą w mózgu. Zdajemy sobie sprawę, że lepsza kontrola chirurgii manualnej jest niezbędna do zapewnienia spójności wyników. Po drugie, wykorzystaliśmy nowo opracowany biomateriał medyczny powszechnie stosowany w klinikach, klej tkankowy (Krok 2.8), do uszczelnienia skóry na głowie myszy po operacji, unikając w ten sposób szwów i przyspieszając tempo gojenia. Ułatwia to wykonywanie zabiegów chirurgicznych i zmniejsza ryzyko wtórnego stanu zapalnego. Po trzecie, czas potrzebny na wykonanie całego zabiegu chirurgicznego jest stosunkowo krótszy, co zwiększa szansę na przeżycie myszy i obniża dawkę leku znieczulającego wstrzykiwanego dootrzewnowo. Zaobserwowaliśmy wysoki wskaźnik przeżycia (95%) i uzyskaliśmy stosunkowo dokładne wyniki, postępując zgodnie z tym zmodyfikowanym protokołem.

Ograniczeniem tej techniki jest stosunkowo krótki czas dostarczania leku. Chociaż pompa osmotyczna może być umieszczona w ciele myszy alternatywnie bez ponownego otwierania mózgu, nasze badanie koncentruje się tylko na zapalnym wpływie chemokiny na mózg w celu regulacji obwodowej ogólnoustrojowej sygnalizacji insuliny. Dodatkowa operacja w tkankach obwodowych mogłaby wywołać reakcję zapalną w tkankach obwodowych, co z kolei zwiększyłoby ekspresję chemokiny zapalnej i wpłynęłoby na wyniki. Po drugie, okres półtrwania leku ogranicza również czas trwania badania. Rekombinowane białka, takie jak chemokina, mają zwykle krótszy okres półtrwania, który z czasem traci swoją aktywność, choć pozwala nam to również badać efekt blokowania sygnalizacji CCL5 w mózgu w krótkim okresie. Nasze wcześniejsze badania opisywały również podejście do modyfikacji genetycznej w celu wygenerowania myszy z nokautem CCL5, które zapewnia model o długoterminowych skutkach⁸.

Istnieje kilka nowych technik i alternatywnych metod dostarczania leków do mózgu. Nanotechnologia to potężna technika, która może być wykorzystywana do dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego. Jednak wiele leków jest termoczułych i może zostać zniszczonych podczas próby pakowania ich w nanocząstki¹⁶. Ponadto nanocząstki mogą przechodzić przez barierę krew-mózg i być wychwytywane przez komórki, które są odpowiednie dla siRNA lub większości popularnych leków, ale nie jest to idealna metoda wiązania liganda z receptorem. CCL5 wymaga wiązania się ze swoim receptorem, CCR5, w neuronach ARC podwzgórza, aby zadziałało⁸, a dostarczenie antagonisty CCL5 ^MetCCL5 do neuronów przez nanocząstki może spowodować utratę zdolności do wiązania i blokowania CCR5 na powierzchni komórki.

Poziom glukozy we krwi był znacznie wyższy u myszy, którym podawano antagonistę CCL5 ^MetCCL5 w porównaniu z grupą kontrolną (myszy, którym podawano aCSF) w doustnym teście tolerancji glukozy. Dodatkowe podawanie insuliny (test tolerancji insuliny) również nie było w stanie obniżyć poziomu glukozy we krwi u myszy otrzymujących ^MetCCL5 (Figura 4B), co sugeruje, że zarówno endogenna, jak i zewnętrzna insulina nie mogą obniżyć poziomu glukozy we krwi podczas blokowania sygnalizacji CCL5 w podwzgórzu. Myszy stały się oporne na insulinę bez aktywności CCL5 w podwzgórzu. Zwiększoną fosforylację seryny302 IRS-1 stwierdzono u myszy otrzymujących Met-CCL5 w porównaniu z myszami kontrolnymi otrzymującymi aCSF (Figura 5A-B). Wykazano, że fosforylacja IRS-1 seryny 302 indukuje fizyczną dysocjację IRS-1 od receptora insuliny, co jest główną przyczyną insulinooporności⁶; insulina nie jest w stanie aktywować dalszych sygnałów, takich jak szlak PI3K-Akt. Badanie ex vivo stymulacji insuliną potwierdziło, że cząsteczka sygnałowa insuliny Akt (p-AktS473) nie była aktywowana przez insulinę w tkance podwzgórza myszy z podsłuchem Met-CCL5, a zamiast tego fosforylacja seryny 302 wzrosła. Podsumowując, zarówno dane fizjologiczne (OGTT i ITT), jak i badania molekularne pokazują, że sygnalizacja CCL5 w podwzgórzu pośredniczy w regulacji sygnału insuliny w podwzgórzu, co przyczynia się do systematycznej insulinooporności i metabolizmu glukozy.

Rola i mechanizm CCL5 i CCR5 w cukrzycy związanej z otyłością pozostaje niejasny. Kitade i in. stwierdzili, że niedobór CCR5 chronił myszy przed stanem zapalnym wywołanym otyłością, rekrutacją makrofagów i insulinoopornością¹⁷. Jednak inne badania przeprowadzone przez Kennedy'ego i wsp. wykazały przeciwne wyniki wskazujące, że niedobór CCR5 upośledza ogólnoustrojową tolerancję glukozy, a także sygnalizację insuliny adipocytów i mięśni¹⁸. W obu badaniach zastosowano dietę wysokotłuszczową w celu wywołania otyłości, która prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego całego organizmu i odpowiedzi kompensacyjnej. Badania te nie dostarczyły jasnych i jasnych mechanizmów CCL5 i CCR5 w regulacji sygnalizacji insuliny. Z drugiej strony, technika pompy osmotycznej pozwala na infuzję specyficzną dla mózgu i pozwala uniknąć reakcji kompensacyjnej przy ograniczonym w czasie dostarczaniu.

Podsumowując, chociaż pompa osmotyczna z systemem infuzyjnym mózgu wydaje się być "staromodną" techniką, zapewnia tańszą, łatwiejszą i mniej szkodliwą metodę dostarczania leków i pomaga badać funkcję sygnalizacji receptora ligandowego w mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klej tkankowy Vetbond	3M	#1049SB	Klej używany do uszczelniania miejsca zmiany chorobowej na głowie myszy
Klej błyskawiczny LOCTITE 454	Durect Corporation	#8670	Klej używany do mocowania igły na czaszce myszy
Alzet Micro-Osmotic	Pump Durect Corporation	#9922	0.11 μ l na godzinę, 28 dni
System infuzyjny mózgu	Durect Corporation	#8851	1-3 mm, używany do perfuzji leku do mózgu myszy
Glukometr	Roche	#06870244001	Służy do pomiaru poziomu glukozy we krwi
Chip glukozy	Roche	# 06454011020	Służy do ładowania próbki krwi
Niebieska	Sigma	#MKBK0523V	Aby zademonstrować wlew leku obszar
Strzykawka insulinowa	Becton, Dickinson and Company	#3232145 C	Służy do dootrzewnowego
podawania insuliny MIO NE116 JEDNOSTKA KONTROLNA (wiertło do paznokci)	Mio System	#E235-015	Do wiercenia otworu w czaszce myszy
CCL5/Met-RANTES Białko	R& D	#ADB0111081	Rekombinowany ludzki CCL5, E-coli pochodzący
z wzoru aCSF	119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM glukozy		Filtr sterylizować za pomocą 0,22 &m; m aparat filtrujący i przechowywać w temperaturze 4& stopni C. aCSF jest stabilny przez 3-4 tygodnie
Phospho-IRS-1 Przeciwciało Serine302	Sygnalizacja komórkowa	# 12879	1:1000 rozcieńczenie
IRS-1 (D23G12)	przeciwciało Sygnalizacja komórkowa	# 12879	1:1000 rozcieńczenie
Phospho-Akt Serine 473	przeciwciało Sygnalizacja komórkowa	# 9916	1:2000 rozcieńczenie
Akt (pan) (C67E7) przeciwciało	Sygnalizacja komórkowa	#9916	1:1000 rozcieńczenie
Zwierzęta: C57BL/6	NAR Labs		Szczep myszy typu dzikiego użyty w badaniu