Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 listopada 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Streszczenie

Chemotaksja, czyli migracja w górę chemoatraktantu, jest najlepiej rozumianym sposobem migracji kierowanej. Badania z wykorzystaniem ameby społecznej Dictyostelium discoideum wykazały, że złożona sieć transdukcji sygnału równoległych szlaków wzmacnia odpowiedź na chemoatraktanty i prowadzi do tendencyjnej polimeryzacji aktyny i wysunięcia się pseudopoda w kierunku gradientu. Natomiast mechanizmy molekularne napędzające inne rodzaje migracji ukierunkowanej, na przykład spowodowane narażeniem na przepływ ścinający lub pola elektryczne, nie są znane. Wiele regulatorów chemotaksji wykazuje lokalizację na krawędzi natarcia lub opóźnienia migrującej komórki, a także wykazuje przejściowe zmiany w lokalizacji lub aktywacji po globalnej stymulacji chemoatraktantem. Aby zrozumieć mechanizmy molekularne innych typów migracji kierowanej, opracowaliśmy metodę, która pozwala na badanie odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną w oparciu o krótką (2 - 5 s) ekspozycję na przepływ ścinający. Stymulacja ta może być dostarczana w kanale podczas obrazowania komórek wyrażających fluorescencyjnie znakowane biosensory w celu zbadania zachowania poszczególnych komórek. Dodatkowo populacja komórek może być stymulowana na płytce, poddawana lizie i immunoblottowana za pomocą przeciwciał, które rozpoznają aktywne wersje interesujących ich białek. Łącząc oba testy, można zbadać szeroki wachlarz cząsteczek aktywowanych przez zmiany w lokalizacji subkomórkowej i/lub fosforylacji. Za pomocą tej metody ustaliliśmy, że ostra stymulacja mechaniczna wyzwala aktywację chemotaktycznej transdukcji sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego. Zdolność do badania reakcji komórkowych na ostrą stymulację mechaniczną jest ważna dla zrozumienia zdarzeń inicjujących niezbędnych do motoryki wywołanej przepływem ścinającym. Podejście to dostarcza również narzędzia do badania chemotaktycznej sieci transdukcji sygnału bez zakłócającego wpływu receptora chemoatraktantu.

Wprowadzenie

Migracja komórek eukariotycznych jest sterowana przez różne chemiczne i fizyczne sygnały w środowisku, w tym gradienty rozpuszczalnych lub związanych z substratem chemoatraktantów, zmienną sztywność substratów, pola elektryczne lub przepływ ścinający. Chociaż poczyniono wiele postępów w naszym zrozumieniu mechanizmów molekularnych napędzających chemotaksję, mniej wiadomo o innych typach ukierunkowanej migracji i o tym, jak te różnorodne sygnały są integrowane na poziomie komórkowym w celu wytworzenia jednolitej odpowiedzi migracyjnej.

Ukierunkowana migracja w kierunku rosnącego stężenia chemoatraktantu obejmuje trzy komponenty behawioralne: ruchliwość, kierunkowe wykrywanie i polaryzację1. Ruchliwość odnosi się do losowego ruchu komórek osiągniętego przez wysunięcie pseudopodów. Wykrywanie kierunkowe to zdolność komórki do wykrywania źródła chemoatraktantu, który może wystąpić nawet w unieruchomionych komórkach. Polaryzacja odnosi się do bardziej stabilnego asymetrycznego rozkładu składników wewnątrzkomórkowych między krawędzią natarcia i opóźnienia komórki, co prowadzi do zwiększonej trwałości w ruchu.

Odpowiedź komórkowa na chemoatraktant zależy od aktywności czterech koncepcyjnie zdefiniowanych sieci regulacyjnych: receptora/białka G, transdukcji sygnału, cytoszkieletu aktynowego i polarności1. Wiązanie chemoatraktantu z receptorem sprzężonym z białkiem G przekazuje sygnał za pośrednictwem heterotrimerycznych białek G α i βγ do dalszej sieci transdukcji sygnału, która wzmacnia sygnał kierunkowy. Wiele szlaków w sieci transdukcji sygnału działa równolegle i zasila sieć cytoszkieletu aktynowego w celu odchylenia polimeryzacji aktyny, a w konsekwencji wypukłości pseudopodów w kierunku gradientu. Do ważnych regulatorów chemotaksji należą GTPaza Ras, TorC2, kinaza 3-fosfoinozytolu (PI3K), homolog fosfatazy i tensyny (PTEN) oraz cyklaza guanylowa. Mechanizmy sprzężenia zwrotnego w sieci transdukcji sygnału oraz między transdukcją sygnału a sieciami cytoszkieletu aktynowego dodatkowo wzmacniają odpowiedź. Wreszcie, słabo zdefiniowana sieć polaryzacji otrzymuje dane wejściowe z cytoszkieletu aktynowego i dalej odchyla sieć transdukcji sygnału, aby promować trwałą migrację w kierunku gradientu.

Wiele z naszego mechanistycznego zrozumienia chemotaksji stało się możliwe dzięki rozwojowi fluorescencyjnie znakowanych biosensorów dla różnych komponentów sieci regulacyjnych. Wiele regulatorów chemotaksji ma asymetryczny rozkład albo samej cząsteczki regulatorowej, albo jej aktywności. Na przykład bioczujniki, które rozpoznają aktywowane wersje małych GTPaz Ras i Rap1 – domen wiążących Ras odpowiednio Raf1 (określanych tutaj jako RBD) i RalGDS – lokalizują się do krawędzi natarcia komórki chemotaksyjnej2,3. Podobnie, PI3K i jego produkt fosfatydyloinozytol (3,4,5)-trifosforan (PIP3), rozpoznawane przez domenę homologii pleckstrin (PH), również wykazują lokalizację z przodu komórki4,5. W przeciwieństwie do tego, 3-fosfataza PTEN, która przekształca PIP3 z powrotem w fosfatydyloinozytol (4,5)-bisfosforan, lokalizuje się na opóźnionej krawędzi komórki6. Co ważne, te biosensory zmieniają swoją lokalizację w odpowiedzi na globalną stymulację chemoatraktantem. Markery krawędzi natarcia, które są cytozolowe lub znajdują się na końcach wypukłości w komórce spoczynkowej, przemieszczają się do kory, podczas gdy markery krawędzi opóźnionej, które mają lokalizację korową i są nieobecne na końcach wypukłości w komórce spoczynkowej, stają się cytozolowe po stymulacji. Analiza rozkładu biosensorów w odpowiedzi na globalną stymulację chemoatraktantem minimalizuje wpływ ruchliwości i polaryzacji, które często zakłócają obserwacje. Globalna lub jednolita stymulacja zawiesiny komórkowej za pomocą chemoatraktantu jest również wykorzystywana jako narzędzie do oceny zmian w aktywacji białek w całej populacji, często wykrywanych przez fosforylację białek7,8,9. Ten test biochemiczny służy przede wszystkim do uzyskiwania informacji czasowych, podczas gdy mikroskopia służy do zbierania zarówno czasowych, jak i przestrzennych informacji o zachowaniu różnych składników sieci regulacyjnych.

Sieć transdukcji sygnału posiada cechy systemu o wysokiej pobudliwości10,11. Reakcje na ponadprogowe bodźce chemotaktyczne są "wszystko albo nic" i wykazują okresy refrakcji. Odpowiedzi są również wyzwalane stochastycznie i mogą wykazywać zachowanie oscylacyjne. Zdarzenia transdukcji sygnału są zlokalizowane w regionach kory mózgowej, które rozchodzą się jako fale12,13,14,15. Przednie lub tylne markery są rekrutowane do stref aktywnych rozchodzących się fal lub od nich dysocjują. Ze względu na obszar ogniotrwały ciągnący się za strefą aktywną, fale skierowane w przeciwnym kierunku anihilują, gdy się spotykają. Rozchodzące się fale transdukcji sygnału leżą u podstaw wypukłości komórkowych, które pośredniczą w migracji komórek10.

Wiele z wyżej wymienionych informacji na temat chemotaksji pochodzi z badań nad amebą społeczną Dictyostelium discoideum, chociaż podobne mechanizmy regulacyjne mają również zastosowanie do neutrofili i innych typów komórek ssaków16. Dictyostelium jest dobrze ugruntowanym organizmem modelowym, który ma silną odpowiedź chemotaktyczną podczas głodu, kiedy tysiące pojedynczych komórek migrują w kierunku centrum agregacji, ostatecznie tworząc wielokomórkowy owocnik zawierający zarodniki. Chemotaksja jest również niezbędna na etapie wzrostu pojedynczej komórki tego organizmu do lokalizowania bakteryjnych źródeł pożywienia. Co ważne, migracja pojedynczych komórek Dictyostelium jest niezwykle podobna do migracji neutrofili ssaków lub przerzutowych komórek nowotworowych, z których wszystkie przechodzą bardzo szybką migrację typu ameboidalnego. W rzeczywistości zarówno ogólna topologia sieci regulacyjnych, jak i wiele indywidualnych szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w chemotaksję są zachowane między Dictyostelium a leukocytami ssaków17. Ponadto inne komórki, takie jak fibroblasty, wykorzystują receptorowe kinazy tyrozynowe (RTK) zamiast GPCR; jednak RTK mogą zasilać podobne sieci.

W przeciwieństwie do chemotaksji, brakuje dokładnego zrozumienia mechanizmów sygnalizacyjnych, które napędzają różne inne tryby ukierunkowanej migracji. Podobnie jak w przypadku komórek migrujących w gradiencie chemoatraktantu, kilka badań wykazało aktywację i/lub lokalizację typowych markerów krawędzi natarcia, w tym polimeryzacji aktyny, PIP3 i/lub kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) 1/2, na czele komórek poddawanych ukierunkowanej migracji w odpowiedzi na przepływ ścinający lub zmiany pól elektrycznych18,19,20,21. Jednak w tych badaniach ciągła ekspozycja na bodziec powodowała również migrację komórek, pozostawiając otwarte pytanie, czy na przykład markery krawędzi natarcia lokalizują się specyficznie w odpowiedzi na bodziec, czy też po prostu lokalizują się na krawędzi natarcia z powodu zwiększonej liczby pseudopodów z przodu migrującej komórki.

Opracowaliśmy testy, które pozwalają nam obserwować reakcję komórek na ostre zakłócenia mechaniczne dostarczane jako przepływ ścinający, zarówno na poziomie populacji, jak i jako pojedyncze komórki22. Podobnie jak w przypadku globalnej stymulacji chemoatraktantem, ostra stymulacja przepływem ścinającym umożliwia badanie odpowiedzi komórkowej na bodziec mechaniczny bez zakłócającego wpływu ruchliwości lub polaryzacji. Połączenie tych testów biochemicznych i mikroskopowych z perturbacjami genetycznymi lub farmakologicznymi pozwala nam dowiedzieć się, w jaki sposób bodźce mechaniczne są odbierane i przekazywane. Co więcej, podejście to zapewnia również nowatorską metodę łączenia się z systemem za receptorem chemoatraktantu w przypadku braku chemoatraktantu, izolując w ten sposób transdukcję sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego od sieci receptor/białko G.

Korzystając z technik opisanych poniżej, wykazaliśmy niedawno, że ostre naprężenie ścinające prowadzi do aktywacji wielu składników chemotaktycznej transdukcji sygnału i sieci cytoszkieletu aktynowego22. Stosując ostry bodziec mechaniczny w różnych odstępach czasu, wykazaliśmy, że podobnie jak w przypadku chemoatraktantów, odpowiedź na bodźce mechaniczne również wykazuje cechy układu pobudliwego, w tym zachowanie odpowiedzi w warunkach nasycenia typu "wszystko albo nic" w warunkach nasycenia i obecność okresu refrakcji. Wreszcie, łącząc stymulację mechaniczną i chemiczną, wykazaliśmy, że te dwa bodźce mają wspólną transdukcję sygnału i sieci cytoszkieletów aktynowych, co prawdopodobnie pozwala na integrację wielu bodźców w celu odchylenia migracji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj pożywkę HL-5 przy użyciu następujących składników: 10 g/l dekstrozy, 10 g/l peptonu proteozy, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,965 g/L Na2HPO4·7H2O, 0,485 g/L KH2PO4 i, o ile nie wskazano inaczej, 0,03 g/L streptomycyny w wodzie dejonizowanej. Pożywkę należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Ze względu na różnice między peptonem proteozy a ekstraktem drożdżowym uzyskanym od różnych dostawców, a także między poszczególnymi partiami, może być konieczne dostosowanie pH pożywki do typowego zakresu od 6,4 do 6,7.
  2. Przygotuj płytki SM, używając następujących składników: 10 g/L dekstrozy, 10 g/L peptonu, 1 g/L ekstraktu drożdżowego, 2,31 g/L KH2PO4, 1 g/L K2HPO4 i 20 g/L agaru w wodzie dejonizowanej. Autoklaw, schłodzić i wlać 30 ml roztworu agaru na 10-centymetrową szalkę Petriego. Gdy agar zastygnie, przechowuj płytki w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Przygotować 10x bufor fosforanowy (PB) używając 13,4 g/L Na2HPO4·7H2O i 6,8 g/L KH2PO4 w wodzie dejonizowanej. Przechowuj 10x bulion w temperaturze 4°C. Rozcieńczyć do 1x wodą dejonizowaną do użycia.
  4. Przygotuj bufor DB, uzupełniając 1X PB o 2 mMMgSO4 i 0,2 mM CaCl2.
  5. Przygotuj 100 mM kofeiny w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze -20°C.
  6. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy cAMP, rozpuszczając jednowodny roztwór soli sodowej cAMP w wodzie dejonizowanej. Przygotować zapas roboczy o pojemności 1 mM w wodzie dejonizowanej. Przechowywać oba roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C. Przygotować końcowy roztwór cAMP o pożądanym stężeniu w DB w dniu eksperymentu.
    UWAGA: Roztwory podstawowe można kilkakrotnie zamrażać i rozmrażać.
  7. Przygotuj 25 mM kwasu foliowego w 1x PB. Dodać kilka kropli 1 N NaOH, aż proszek całkowicie się rozpuści. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotuj 3 razy bufor do próbek, używając następujących składników: 187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS), 30% glicerolu, 126 mM ditiotreitolu i 0,03% (w/v) błękitu bromofenolowego. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    1. Przed użyciem rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przystąpić do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy, rozcieńczając 3x bufor próbki do 1x i dodając 50 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 25 mM pirofosforanu sodu i 1x kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA w wodzie dejonizowanej. Dodać inhibitory bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury opisanej w krokach 3.1.2-3.1.3.
  9. Przygotować 5 mM roztwór latrunkuliny A w DMSO. Porcję i przechowywać w temperaturze -20°C.

2. Przygotowanie komórek D. discoideum

UWAGA: Utrzymuj komórki D. discoideum w pożywkach HL-5 albo na płytkach do hodowli tkankowej, albo w hodowli zawiesinowej, jak wcześniej opisano23. W razie potrzeby przekształć komórki za pomocą biosensorów znakowanych fluorescencyjnie zgodnie ze standardowymi protokołami elektroporacji24. Różne szczepy D. discoideum, a także plazmidy kodujące biosensory lub inne interesujące geny można uzyskać z Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Wzrost i zbieranie wegetatywnych komórek D. discoideum
    1. Do analizy komórek wegetatywnych hoduj komórki w obecności bakterii, aby zmniejszyć liczbę makropinosomów, które są zwykle obserwowane w komórkach hodowanych osiowo25.
      1. Przygotować kulturę Klebsiella aerogenes poprzez zaszczepienie niewielkiej liczby komórek z glicerolu lub z poprzedniej hodowli do pożądanej objętości pożywki HL-5 bez antybiotyków. Inkubować kulturę bakteryjną na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min (0,42 x g) w temperaturze pokojowej (20-22 °C) przez 16-18 h.
        UWAGA: Plik K. Zastosowany tutaj szczep aerogenes jest niepatogenny (patrz tabela materiałów).
    2. Zebrać D. discoideum w fazie wzrostu wykładniczego z płytek do hodowli tkankowych lub z hodowli zawiesinowej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta. Rozłóż 1 x 105 komórek D. discoideum z zawiesiną 260 μL K. aerogenes na płytce SM. Następnego dnia odwróć talerz do góry nogami. Hoduj komórki w temperaturze pokojowej, aż komórki D. discoideum zaczną oczyszczać trawnik bakteryjny, ale zanim zaczną się agregować (~36-48 godzin).
    3. Zebrać komórki D. discoideum w 5 ml buforze DB, zeskrobując je szklanym rozsiewaczem. Przenieś komórki do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Przepłukać płytkę kolejnym 5 ml buforem DB i połączyć ją z oryginalną zawiesiną. Napełnij probówkę do 50 ml buforem DB.
    4. Odwirować zawiesinę D. discoideum o stężeniu 360 x g przez 3-4 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 ml buforze DB. Powtarzaj etapy mycia, aż supernatant będzie klarowny (~3 do 4 prań). Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w buforze DB do końcowej gęstości ~5 x 106 komórek/ml.
  2. Przygotowanie kompetentnych agregacyjnie komórek D. discoideum
    1. Rozwijaj komórki D. discoideum przez 1 godzinę głodówki, a następnie 4 godziny głodu i pulsowanie 50 nM cAMP co 6 minut zgodnie ze standardowymi protokołami23.
    2. Po opracowaniu zmierz końcową objętość zawiesiny komórek.
    3. Na podstawie początkowej liczby komórek użytych do rozwoju oblicz gęstość komórek końcowej zawiesiny.
      UWAGA: Jeśli cAMP jest dostarczany w objętościach 100 μl co 6 minut, objętość komórek zwiększa się o 1 ml na każdą godzinę pulsowania cAMP. Tak więc w standardowych warunkach przy użyciu 8 x 107 komórek w 4 ml DB, po 4 godzinach rozwoju końcowa objętość wynosi 7 ml, a końcowa gęstość komórek wynosi ~1,1 x 107 komórek/ml.

3. Analiza biochemiczna reakcji komórek na stymulację mechaniczną lub chemiczną

  1. Ostra mechaniczna stymulacja komórek, a następnie liza komórek
    1. Płytka 2 x 106 komór zdolnych do agregacji (od kroku 2.2) po 4 godzinach wywoływania w 35-milimetrowych szalkach z 2 ml DB. Pozwól komórkom przyczepić się na 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml DB. Inkubować komórki w DB z 2,5 mM kofeiny przez 30 minut bez żadnych zakłóceń płytek.
      UWAGA: Jeśli komórki muszą być leczone inhibitorem farmakologicznym, dodaj pożądane stężenie inhibitora lub taką samą objętość odpowiedniego nośnika podczas bazowania kofeiną.
    2. Aby zastosować stymulację mechaniczną, umieść płytkę (pojedynczo) na wytrząsarce orbitalnej i natychmiast włącz ją z prędkością 150 obr./min (0,24 x g) przez 5 s.
      UWAGA: Płytkę można również stymulować ręcznie ruchem w kierunku poprzecznym przez około 5 s.
    3. Odessać bufor we wskazanych momentach po rozpoczęciu stymulacji. Natychmiast poddać komórki lizie, dodając 100 μl buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy.
    4. Umieść płytkę na lodzie i zbierz lizat do probówki o pojemności 1,5 ml. Dla "czasu 0" poddaj komórki lizie bez potrząsania. Przenieść probówki do bloku grzewczego o temperaturze 95 °C na 10 minut bezpośrednio po lizie. Kontynuuj immunoblotting lub przechowuj lizaty w temperaturze -20 °C.
  2. Stymulacja komórek chemoatraktantem
    1. Bazalowane komórki kompetentne do agregacji po 4 godzinach rozwoju poprzez szybkie wytrząsanie ich w obecności 5 mM kofeiny przy 200 obr./min (0,42 x g) na wytrząsarce orbitalnej przez 30 min.
      1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 360 x g przez 3-4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml lodowatego buforu DB. Powtórz krok prania.
    2. Zawiesić końcową osadkę komórkową w lodowatym buforze DB do końcowej gęstości 4 x 107 komórek/ml w oparciu o początkową liczbę komórek użytych do rozwoju komórek (patrz krok 2.2). Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie przed stymulacją.
      1. Odpipetować 50 μL 10 μM cAMP lub nośnika do styropianowego kubka umieszczonego na wytrząsarce orbitalnej.
    3. Aby pobudzić komórki, dodaj 450 μl lodowatej zawiesiny komórkowej do tej samej filiżanki i natychmiast włącz shaker z prędkością 200 obr./min (0,42 x g). W różnych momentach po rozpoczęciu stymulacji (np. 10, 30, 45, 60, 120 s) należy na krótko zatrzymać wytrząsarkę, wyjąć 50 μl podwielokrotności zawiesiny komórek i poddać komórki lizie, dodając je do 1,5 ml probówek zawierających 25 μl buforu do próbek 3X.
      1. Dla 'czasu 0' użyj komórek z niestymulowanej lodowatej zawiesiny komórek.
        UWAGA: Końcowa temperatura zawiesiny komórek podczas stymulacji wynosi ~9 °C26. W tych warunkach odpowiedź szczytowa występuje nieco później niż pik obserwowany dla stymulacji wykonywanej w temperaturze pokojowej (na przykład stymulacja chemoatraktantem komórek adherentnych pod mikroskopem lub mechaniczna stymulacja komórek adherentnych).
    4. Przenieść probówki do bloku grzewczego o temperaturze 95 °C na 10 minut bezpośrednio po lizie. Kontynuuj immunoblotting lub przechowuj lizaty w temperaturze -20 °C.
  3. Analiza odpowiedzi komórek za pomocą immunoblottingu
    1. Uruchomić lizaty (z kroków 3.1.3 lub 3.2.4) na 4-15% żelu poliakrylamidowym Tris-HCl, przenieść do membrany z polifluorku winylidenu, zablokować i immunooblożyć fosfo-PKCζ Thr410 (w celu wykrycia fosfo-PKBR1 i fosfo-PKBA). Wykryj sygnał przez inkubację z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi sprzężonemu z peroksydazą chrzanową, a następnie chemiluminescencję przy użyciu ulepszonego substratu chemiluminescencji.
    2. W celu wykrycia wielu białek, usuń blot buforem odpędzającym i ponownie zbadaj przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko phospho-p42 / 44 MAPK Thr302/304 (w celu wykrycia fosfo-ERK2). Potwierdź równomierne obciążenie białkami, barwiąc membranę z polifluorku winylidenu błękitem Coomassie Brilliant Blue.

4. Ostra stymulacja mechaniczna i obrazowanie na żywo pojedynczych komórek pod mikroskopem

  1. Ocena odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną za pomocą urządzenia przepływowego
    1. Zebrać i rozcieńczyć komórki zdolne do wegetatywności lub agregacji do ~1 x 106 komórek/ml w DB, jak opisano odpowiednio w krokach 2.1 i 2.2. Załaduj ~600 μL do szkiełka z kanałem (szczegóły w tabeli materiałów). Pozwól komórkom przyczepić się przez 10 minut. Upewnij się, że wszystkie wloty w szkiełku są całkowicie wypełnione. W razie potrzeby uzupełnij dodatkowym buforem.
      UWAGA: Konkretny slajd używany do analizy ma trzy wejścia, które zasilają wąskie kanały 1 mm, ale następnie łączą się w jeden szeroki kanał 3 mm. Wysokość kanału wynosi 0,4 mm. Chociaż komórki są pokryte w całym kanale, obrazowana jest tylko szeroka część.
    2. Przeprowadź jeden z przewodów podłączonych do zbiornika o pojemności 50 ml przez przedni prawy zawór jednostki fluidycznej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów). Korzystając z oprogramowania pompy, upewnij się, że zawór jest zamknięty (tj. w lewo). Napełnij zbiornik DB.
      1. Ustaw ciśnienie na 50 mbar i włącz je. Napełnij i przepłucz linię DB, klikając na zawór, aby go otworzyć. Ustaw ciśnienie z powrotem na 0 i zamknij zawór po ~30 s.
    3. Podłącz przewód do jednego z trzech wlotów po jednej stronie zjeżdżalni, nie zatrzymując żadnych pęcherzyków powietrza. Podłącz pozostałe dwa wloty. Podłącz przewód od odpływu do pojedynczego wlotu po drugiej stronie prowadnicy.
      UWAGA: Rurka używana do przewodów wejściowych i odpływowych w tej konfiguracji ma średnicę wewnętrzną 1.6 mm.
    4. Umieść szkiełko na mikroskopie pod obiektywem pneumatycznym 20X. Aby przepłukać kanał, przełącz zawór, aby otworzyć linię i kliknij "Ciśnienie włączone", zaczynając od wyższego ciśnienia (~50 mbar lub ~40 dyn/cm2), aby przepchnąć ciecz do odpływu.
      1. Gdy ciecz wypłynie z odpływu, zmniejsz ciśnienie zewnętrzne do zera (tj. tylko przepływ grawitacyjny, ~15 dyn/cm2) i kontynuuj płukanie przez ~30 s. Ustaw zawór w przeciwnej pozycji, aby zatrzymać przepływ.
    5. Uzyskuj obrazy z oświetleniem RFP lub GFP na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym pod 40-krotnym obiektywem olejowym w odstępach 3 s. Gdy zawór jest w pozycji zamkniętej, włącz ciśnienie na żądane ciśnienie, zwykle w zakresie od 15 do 40 dyn/cm2 (0 - 50 mbar).
    6. Po uzyskaniu 5 ramek należy dostarczyć bodziec poprzez przełączenie zaworu w pozycję "otwartą". Wyłącz przepływ po 2-5 s, przełączając zawór w przeciwnym kierunku.
      UWAGA: W przypadku niektórych słabszych biosensorów (np. PTEN, CynA i RalGDS) może być konieczne obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40X.
  2. Badanie wpływu inhibitorów farmakologicznych na odpowiedź na ostrą stymulację mechaniczną za pomocą urządzenia przepływowego
    1. Umieść komórki na szkiełku z kanałem zgodnie z opisem w kroku 4.1.1. Ustaw dwie linie: przeprowadź jedną linię przez prawy przedni zawór, jak w kroku 4.1.2, a drugą przez tylny lewy zawór. Clamp lewą linię i ustaw zawór w pozycji "zamkniętej" (lewej). Wypełnić jedną linię DB zawierającą odpowiedni nośnik, a drugą roztworem zawierającym badany inhibitor farmakologiczny (np. 5 μM latrunkuliny A).
      UWAGA: Konieczne jest fizyczne zaciśnięcie lewego przewodu, ponieważ "zamknięta" lewa pozycja otwiera zawór dla tej linii.
    2. Napełnij i przepłucz prawy przewód, włączając ciśnienie na 50 mbar i przełączając zawór w pozycję "otwartą" (prawą). Przełącz zawór w lewo po ~30 s. Napełnij i wypłucz lewą linię, zdejmując zacisk na ~30 s. Podłącz oba przewody do dwóch wlotów po jednej stronie zjeżdżalni za pomocą kanału, zatkaj pozostały wlot i podłącz odpływ do pojedynczego wlotu po drugiej stronie.
    3. Umyj szkiełko z buforem w prawej linii i przeprowadź stymulację w tym samym buforze, jak opisano w krokach 4.1.3 i 4.1.4 powyżej.
      UWAGA: Chociaż prawa linia została wybrana jako pierwsza w tej konfiguracji, kolejność można odwrócić.
    4. Po stymulacji przełączyć zawór, aby otworzyć prawą linię przy zerowym ciśnieniu (tj. tylko przepływ grawitacyjny, ~15 dyn/cm2). Usuń zacisk z lewej linii i przełącz zawór w lewo, aby otworzyć ten przewód. Zacisnąć pierwszą linię.
    5. Po przepuszczeniu 3-5 ml buforu z inhibitorem należy przestawić zawór w prawo, aby zatrzymać przepływ i inkubować komórki z inhibitorem przez wymagany czas (np. 15 minut). Włącz przepływ, przełączając zawór co ~10 minut na ~15 s, aby zapobiec niedoborowi tlenu. Powtórz stymulację z drugą linią.
  3. Alternatywna metoda oceny odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną za pomocą mikropipety
    1. Ustawić mikropipetę wypełnioną DB zgodnie ze standardowym protokołem23. Utrzymuj ciśnienie kompensacyjne na poziomie 1,500 psi.
    2. Zebrać i rozcieńczyć komórki wegetatywne zgodnie z opisem w kroku 2.1. Umieść 25 μl kropli ~7,5 x 105 komórek/ml w komorze 1-dołkowej, pozostaw do przylegania na co najmniej 10 minut i przykryj 3 ml DB.
    3. Umieść komorę na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw olejowy 40X. Zlokalizuj komórki. Delikatnie opuść mikropipetę na środek pola widzenia, aż po raz pierwszy dotknie dna komory.
      UWAGA: Ponieważ ciśnienie kompensacyjne zostało ustawione na 1 500 Psi, komórki będą stale wystawione na bardzo powolny przepływ DB z mikropipety.
    4. Rozpocznij pozyskiwanie obrazów z oświetleniem RFP lub GFP w odstępach 3 sekund. Zastosuj funkcję "Wyczyść", aby uwolnić bolus płynu z mikropipety. Kontynuuj obrazowanie w obecności przepływu spowodowanego samym ciśnieniem kompensacyjnym.
  4. Alternatywna metoda oceny odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną przy użyciu masowego dodawania buforu
    1. Zebrać i rozcieńczyć komórki wegetatywne zgodnie z opisem w kroku 2.1. Umieść 20 μl kropli komórek w ~1 x 106 komórek/ml w DB na środku studzienki z komory 8-dołkowej. Pozwól komórkom przylegać przez co najmniej 10 minut.
    2. Rozpocznij pozyskiwanie obrazów z oświetleniem specyficznym dla RFP lub GFP na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw 40X w odstępach 3 s. Skoncentruj się na obszarze znajdującym się blisko krawędzi kropli.
    3. Szybko dodaj 430 μl DB po jednej stronie studzienki. Kontynuuj obrazowanie.
    4. W celu analizy interakcji między bodźcami mechanicznymi i chemicznymi, 12 lub 45 s po stymulacji mechanicznej, delikatnie dodaj 50 μl kwasu foliowego (końcowe stężenie 20 nM) lub nośnika (DB) bez wywoływania reakcji mechanicznej. Kontynuuj obrazowanie.
  5. Kwantyfikacja odpowiedzi
    1. Otwórz 32-bitowy obraz TIFF w oprogramowaniu do analizy obrazu (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów)27.
    2. W zakładce "Analizuj" przejdź do "Ustaw pomiary". Zaznacz pole "Średnia wartość szarości". Upewnij się, że pozostałe pola nie są zaznaczone. Kliknij "OK".
    3. Na karcie "Proces" kliknij "Odejmij tło". Utrzymuj promień toczącej się piłki na poziomie 50 pikseli i nie zaznaczaj żadnej z opcji wymienionych w menu. Powiększ jedną komórkę za pomocą narzędzia "Lupa".
    4. Za pomocą narzędzia "Prostokąt" narysuj ramkę (~2,5 x 2,5 μm2) w cytozolu, uważając, aby nie narysować jej nad jądrem lub błoną plazmatyczną. Naciśnij "Ctrl" + "M" lub przejdź do zakładki "Analizuj" i kliknij "Zmierz", aby określić średnią wartość szarości pola. Przejdź do kolejnych ramek i zmierz ponownie, upewniając się, że pudełko pozostaje w cytozolu.
      UWAGA: Ponieważ komórki D. discoideum poruszają się bardzo szybko, pudełko można przesuwać z jednej klatki do drugiej, aby utrzymać je w cytozolu.
    5. Po przeanalizowaniu wszystkich ramek skopiuj wartości do arkusza kalkulacyjnego. Aby uwzględnić różnice między komórkami w poziomach ekspresji różnych bioczujników, znormalizuj wartości średniej wartości szarości zaobserwowanej w czasie 0. Oblicz odwrotność wartości, aby odzwierciedlić akumulację sygnału w korze mózgowej.

5. Ciągła stymulacja mechaniczna i obrazowanie na żywo pojedynczych komórek pod mikroskopem

  1. Ustaw komórki dokładnie tak, jak opisano powyżej do analizy ostrej stymulacji mechanicznej w krokach 4.1.1 - 4.1.3. Otwórz korek zakrywający zbiornik buforem, aby można było uzupełnić objętość, jeśli odpowiedź jest analizowana dłużej niż kilka minut.
    UWAGA: Ponieważ zbiornik pozostaje otwarty przez cały czas trwania eksperymentu, test ten jest przeprowadzany przy braku ciśnienia zewnętrznego i opiera się wyłącznie na przepływie grawitacyjnym. Aby zwiększyć szybkość przepływu grawitacyjnie, drenaż można umieścić na stole pod mikroskopem.
  2. Rozpocznij obrazowanie komórek od oświetlenia specyficznego dla RFP lub GFP na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw 40X w odstępach 3 s w celu analizy odpowiedzi biosensorów. Alternatywnie, obraz z kontrastem fazowym przy użyciu obiektywu 20X w odstępach 10 s w celu analizy ogólnej migracji komórek.
  3. Włączyć przepływ po kilku klatkach przy ustawieniu ciśnienia zerowego (tzn. przepływ wynika z samej grawitacji lub ~15 dyn/cm2), przełączając zawór w pozycję otwartą. Gdy poziom płynu w zbiorniku spadnie do 5-10 ml, uzupełnij go większą ilością buforu. Upewnij się, że płyn jest dodawany ostrożnie, aby pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione w przewodach.
    UWAGA: Ważne jest, aby dodać płyn o tej samej temperaturze, aby uniknąć reakcji na wstrząs w komórkach.
  4. Określ ilościowo szybkość i trwałość komórek za pomocą oprogramowania do analizy migracji (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odpowiedź czasowa regulatorów chemotaksji na ostrą stymulację mechaniczną

Aby ocenić odpowiedź komórek D. discoideum na stymulację mechaniczną, przyległe komórki zdolne do agregacji poddano krótkiemu impulsowi przepływu ścinającego. Komórki D. discoideum zdolne do agregacji wydzielają cAMP, który może być wykrywany przez sąsiednie komórki. Aby wyeliminować wpływ sygnalizacji międzykomórkowej, komórki potraktowano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody oferują wygodny sposób oceny zarówno zachowania populacji, jak i poszczególnych komórek w odpowiedzi na przepływ ścinający. Co ważne, podczas gdy poprzednie badania analizowały lokalizację znaczników krawędzi natarcia i opóźnień podczas migracji, obecne podejście pozwala na badanie natychmiastowych efektów poprzez ostre zastosowanie przepływu ścinającego. Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że w rzeczywistości początkowa reakcja komórek na przepływ ścinający nie wymaga migracji komórek. Zamiast te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health R35 GM118177 dla PND.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
DextroseFisher D16-1Służy do przygotowania pożywek HL-5 i płytek SM (kroki 1.1, 1.2)
Pepton proteozyFisherDF0120-17-6Służy do przygotowania pożywki HL-5 (krok 1.1)
Ekstrakt drożdżowyFisher50-550-445Służy do przygotowania pożywek HL-5 i płytek SM (kroki 1.1, 1.2)
Na2HPO4· 7H2OFisherS373-500Służy do przygotowania pożywki HL-5 i 10X buforu fosforanowego (kroki 1.1, 1.3)
KH2PO4FisherP386-500Służy do przygotowania pożywki HL-5, płytek SM i buforu fosforanowego 10X (kroki 1.1-1.3)
Streptomycyna (siarczan dihydrostreptomycyny)FisherICN10040525Użyj do przygotowania pożywki HL-5 (krok 1.1)
Pepton (Bacto)FisherDF0118-17-0Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)
K2HPO4FisherP288-100Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)
AgarFisherBP1423-500Służy do przygotowania płytek SM (krok 1.2)
MgSO4FisherM65-500Służy do przygotowania buforu DB (krok 1.4)
CaCl2FisherC79-500Użyj do przygotowania buforu DB (krok 1.4)
Kofeina FisherO1728-500Użyj do przygotowania kofeiny (krok 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenozyna 3 stopy, 5 stóp-cykliczny monofosforan, sól sodowa)Fisher11-680-1100MGUżyj do przygotowania cAMP (krok 1.6)
Kwas foliowySigmaF7876Użyj do przygotowania folic kwas (krok 1.7)
Baza trisFisherBP152-500Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)
Dodecylosiarczan sodu (SDS)FisherBP166-500Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)
GlicerolFisherG33-500Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)
Ditiotreitol (DTT)Bio-Rad1610610Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)
Błękit bromofenolowyBio-Rad1610404Służy do przygotowania 3X buforu próbki (krok 1.8)
NaFFisherS299-100Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (etap 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)
Dekahydrat pirofosforanu soduFisherS390-500Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche)Sigma11873580001Służy do przygotowania buforu próbki z inhibitorami proteazy i fosfatazy (krok 1.8)
Latrunkulina AEnzo Life SciencesBML-T119-0100Służy do przygotowania latrunkuliny A (krok 1.9)
4-15% Tris-HCl żel poliakrylamidowyBio-Rad3450029Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)
Membrana z polifluorku winylidenuBio-Rad1620177Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)
Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Przeciwciało króliczeSygnalizacja komórkowa2060Przeciwciało pierwotne do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Przeciwciało XPSygnalizacja komórkowa4370Przeciwciało pierwotne do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)
Królicze IgG HRP połączone z całym Ab (od osła)GE HealthcareNA934-100ULPrzeciwciało drugorzędowe do stosowania w immunoblottingu (krok 3.3)
Ulepszony substrat chemiluminescencyjny (substrat Clarity Western ECL)Bio-Rad1705060Zastosowanie do immunoblottingu (krok 3.3)
Bufor do usuwania pasów (Restore Plus Western blot striping buffer)PiercePI46430Użyj do immunoblottingu (krok 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278Użyj do immunoblottingu (krok 3.3)
Szczep K. aerogenes (niepatogenny)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Materiały i wyposażenie
Wytrząsarka orbitalna (model G-33 lub porównywalna alternatywa)New Brunswick ScientificSłuży do hodowli komórek K. aerogenes (krok 2.1.1) oraz do bazalacji i stymulacji komórek D. discoideum (krok 3). Promień bezwładności tej wytrząsarki wynosi 9,5 mm.
10 cm szalka PetriegoFisherFB0875712Użyj do przygotowania płytek SM (krok 1.2)
HemocytometrFisher02-671-51BSłuży do liczenia komórek D. discoideum (krok 2.1.2)
Szalka 35 mm (naczynie do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip)Fisher08-772ASłuży do płytki D. discoideumkomórki do stymulacji mechanicznej, a następnie lizy komórek (krok 3.1.1)
Kubek polistyrenowy (5 ml)VWR13915-985Służy do stymulacji zawiesiny komórek D. discoideum za pomocą chemoatraktantu (krok 3.2.2)
Jednostka fluidyczna z pompą (ibidi Pump System)Ibidi10902Służy do dostarczania mechanicznej stymulacji do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5)
Szkiełko z kanałem (μ-Slide III 3w1 ibiTreat: #1.5 polimerowe szkiełko nakrywkowe, poddane działaniu kultur tkankowych, sterylizowane)Ibidi80316Służy do płytki D. discoideum komórek do stymulacji mechanicznej dostarczanej przez urządzenie fluidyczne (kroki 4.1, 4.2 i 5)
Zbiorniki 50 ml (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)Ibidi10978Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5)
Linie dla jednostki płynowej (zestaw perfuzyjny ŻÓŁTY i ZIELONY)Ibidi10964Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5). Uwaga: obie żyłki można również wyciąć z rurki 1,6 mm (numer katalogowy 10842).
Przewód do odpływu (rurka o średnicy wewnętrznej 1,6 mm)Ibidi10842Służy do ustawiania urządzenia fluidycznego do dostarczania stymulacji mechanicznej do komórek D. discoideum w kanale (kroki 4.1, 4.2 i 5).
Mikroskop odwrócony Zeiss Observer.Z1 wyposażony w obiektyw olejowy 40X/1,3 i obiektyw powietrzny 20X/0,3 (lub porównywalną alternatywę)ZeissSłuży do obrazowania komórek D. discoideum z kontrastem fazowym lub oświetleniem fluorescencyjnym (kroki 4 i 5)
Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem UltraView wyposażony w 40×/1.25– Obiektyw olejowy 0,75 (lub porównywalna alternatywa)Perkin-ElmerDM 16000Alternatywa stosowana do obrazowania komórek D. discoideum (krok 4.1.4)
Mikroiniektor FemtoJet (Eppendorf; model 5247 lub porównywalna alternatywa) z Eppendorf InjectManEppendorf5252000021D i 5192000027Służy do mechanicznej stymulacji komórek D. discoideum za pomocą mikropipety (krok 4.3). Uwaga: numery katalogowe dotyczą najnowszej wersji urządzenia (4i).
Mikropipeta (Femtotip; 1 μ m średnica zewnętrzna, 0,5 μ m średnica wewnętrzna )Eppendorf930000035Służy do dostarczania mechanicznej stymulacji do komórek D. discoideum za pomocą mikropipety (krok 4.3)
Końcówki do mikroładowarek (Eppendorf Femtotips Końcówki do mikrowstrzykiwaczy Femtojet)Eppendorf5242956.003Służy do napełniania mikropipety (femtotip) buforem (krok 4.3.1)
Komora 1-dołkowa (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)Fisher12-565-472Służy do powlekania ogniwami D. discoideum do stymulacji mechanicznej dostarczanej za pomocą mikropipety (krok 4.3.2)
Komora 8-dołkowa (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Komorowa szklana osłona)Fisher12-565-338Służy do powlekania ogniw D. discoideum do stymulacji mechanicznej dostarczanej przez masowe dodawanie buforu (krok 4.4.1)
NazwaCompanyNumer katalogowy>Komentarze
Software
Image Analysis Software (Fidżi)NIHhttps://fiji.sc/Użyj do ilościowego określenia odpowiedzi na stymulację mechaniczną (krok 4.5)
Oprogramowanie do analizy migracji (Tracking Tool PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Służy do ilościowego określania szybkości i trwałości komórek (krok 5.4)

Bibliografia

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przepływ ścinającytransdukcja sygnałucytooszkielet aktynowyfluorescencyjne biosensorypotrząsarka orbitalnakomora mikroprzepływowaWestern blotmigracja komórek
Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.