Method Article

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

DOI:

10.3791/56412

⸱

February 23rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono metodę określania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych oraz optymalizacji parametrów in silico do obliczania współczynników dyfuzji za pomocą symulacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele skóry hodowane in vitro stają się coraz bardziej przydatne w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych, a także są wykorzystywane do opracowywania leków, jak również do testowania substancji. Modele te są najczęściej uprawiane w systemach membranowo-wkładowych, a ich przepuszczalność dla różnych substancji jest istotnym czynnikiem. Zazwyczaj stosowane metody oznaczania tych parametrów wymagają zwykle dużych rozmiarów próbek (np. komórka dyfuzyjna Franza) lub pracochłonnego sprzętu (np. odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)). W pracy przedstawiono metodę wyznaczania współczynników przepuszczalności bezpośrednio w systemach membranowo-wsadowych o średnicach 4,26 mm i 12,2 mm (powierzchnia uprawy). Metodę zwalidowano za pomocą agarozy i żeli kolagenowych, a także modelu komórki kolagenowej reprezentującego modele skóry. Dokładnie opisano procesy przenikania substancji o różnych rozmiarach molekularnych i przenikania przez różne modele komórkowe (składające się z żelu kolagenowego, fibroblastów i HaCaT).

Ponadto, aby wesprzeć powyższą metodę eksperymentalną, stworzono symulację. Symulacja dobrze pasuje do danych eksperymentalnych dla substancji o małych rozmiarach molekularnych, do 14 x 10-10 m promienia Stokesa (4000 MW), a zatem jest obiecującym narzędziem do opisania systemu. Co więcej, symulacja może znacznie zmniejszyć wysiłek związany z eksperymentami i jest wystarczająco solidna, aby można ją było rozszerzyć lub dostosować do bardziej złożonych konfiguracji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organiczne kultury 3D stały się potężnymi narzędziami do opracowywania leków i testowania substancji1. Pod tym względem modele ludzkiej skóry cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na wymogi regulacyjne, takie jak te w przemyśle kosmetycznym. Doprowadziły one następnie do opracowania licznych modeli skóry 3D, które można stosować samodzielnie jako hodowle jednonarządowe na płytkach wielodołkowych lub w chipach wielonarządowych w połączeniu z dodatkowymi modelami narządów, np. liver2.

Jeśli chodzi o uprawę odpowiednika skóry, interfejs powietrze-ciecz (ALI) jest niezbędnym elementem dla prawidłowego różnicowania naskórka3. Wkładki do hodowli komórkowych składające się z naczynia z membraną przepuszczalną dla cieczy na dnie są zwykle używane do wytworzenia ALI. ALI są szeroko stosowane w dostępnych na rynku modelach skóry, takich jak EpiDerm4, Phenion5 i Episkin6, do hodowli modeli skóry o rozmiarach od 96-dołkowych (4,26 mm średnicy) do 12-dołkowych (12,2 mm średnicy). Opisana tutaj metoda określa przenikanie substancji w systemie wkładu membranowego.

Współczynnik przepuszczalności jest istotnym parametrem do oceny jakości każdego modelu skóry z hodowlą w porównaniu do rodzimej skóry5, i jest używany do oceny, jak szybko substancje aktywne migrują przez skórę. Zwłaszcza jeśli na skórę trzeba nakładać leki lub produkty kosmetyczne, parametr ten jest niezbędny, aby zrozumieć, kiedy dokładnie przechodzą przez nią substancje czynne. Symulacja może dodatkowo pomóc w przewidywaniu zachowania systemu, a następnie w zmniejszeniu niezbędnego czasochłonnego wysiłku eksperymentalnego, zwłaszcza gdy w grę wchodzi duży zestaw substancji.

Komórka dyfuzyjna Franza jest najnowocześniejsza do eksperymentów z przenikaniem skóry i modeli skóry5,6,7,8,9. Urządzenie to składa się z dwóch komór, pomiędzy którymi znajduje się nieruchoma próbka (bariera dyfuzyjna). Substancję, która ma być poddana badaniu, nakłada się bezpośrednio na górną część próbki (przedział dawcy), a stężenie przenikającego związku można wykryć w przeciwległym (akceptorowym) komorze. Po stronie akceptora stała temperatura i jednorodne stężenie substancji są zapewnione przez komorę temperaturową i mieszadło magnetyczne. Próbki można pobierać z ramienia do pobierania próbek po stronie akceptora komórki Franza. Z zakresem wysokości od 19 cm do 179 cm, system ten jest stosunkowo duży10,11. Inną metodą oznaczania współczynników dyfuzji w substancjach żelopodobnych i tkankach jest FRAP. Technika ta wykorzystuje zasadę wybielania fluorescencyjnie znakowanych cząstek w żelu, a następnie określania czasu regeneracji bielonego obszaru w celu obliczenia współczynnika dyfuzji12,13,14.

Ponadto, spektroskopia FTIR z transformacją Fouriera może być używana do wykrywania ruchu cząstek za pomocą absorpcji światła podczerwonego w celu określenia procesu przenikania substancji w skórze15,16. Jednak te lub inne metody obrazowania (np. spektroskopia korelacji fluorescencji dwufotonowej17) wymagają kosztownych instrumentów.

W tym artykule przedstawiono metodę bezpośredniego pomiaru przepuszczalności bariery w systemie wkładów membranowych, gdzie można hodować model skóry. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z przepuszczalnością na dużej liczbie małych próbek (o wielkości studni do 4,26 mm) w kompaktowym systemie. Jest to przeciwieństwo celi dyfuzyjnej Franza, gdzie do każdej sondy potrzebne jest osobne urządzenie, które musi być zamontowane na urządzeniu i jest trudne do zrealizowania dla małych próbek (rozmiar 4,26 mm). Ponadto, ponieważ metoda ta nie wymaga dużego oprzyrządowania (np. mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego), uzyskuje się redukcję zarówno czasu, jak i kosztów.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w mikroporowatych systemach wkładek membranowych z próbką (barierą) składającą się z żelu agarozowego lub modelu komórki kolagenowej umieszczonej na membranie. Substancje fluorescencyjne (donor) o różnych rozmiarach molekularnych zostały naniesione na wierzch próbki, a stężenie przenikanej substancji wykryto na dole (akceptorze) za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz Rysunek 1). W celu walidacji metody i przetestowania dokładności tej symulacji wyprodukowano żele agarozowe, które zastosowano jako barierę. Hydrożele są powszechnie używane do badania procesów dyfuzji i przenikania w porowatym ośrodku w naukach biologicznych13. Metoda została następnie przetestowana w systemie komórkowym składającym się z macierzy kolagenowej pierwotnych fibroblastów i komórek ludzkich dorosłych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury (HaCaT) (model macierzy komórkowej), który jest uproszczonym modelem skóry18,19.

Dodatkowo, proces przenikania był symulowany za pomocą symulacji przepływu z obliczeniową dynamiką płynów. Stwierdzono, że za pomocą optymalizacji parametrów można obliczyć współczynnik dyfuzji na podstawie danych doświadczalnych. Ogólnie rzecz biorąc, ta symulacja oferuje różne zastosowania; Na przykład możliwe jest przewidzenie procesu przenikania na podstawie krótkich eksperymentów, a symulacja może znacznie zmniejszyć liczbę eksperymentów.

Eksperymentalna metoda i symulacja zostały zaprojektowane do zastosowania w systemie organ-on-a-chip1,20,21, w szczególności 2-organ-chip (2-OC) opracowany komercyjnie1,22,23,24,25. W zasadzie w ten sposób można opisać proces przenikania dowolnego modelu narządu opartego na systemach wkładów błonowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki do badań przepuszczalności

UWAGA: W celu weryfikacji pomiarów i symulacji przenikania, użyto próbki składającej się z żelu agarozowego lub modelu matrycy komórkowej opartego na hodowli modelu skóry.

  1. Żel agarozowy
    1. Rozpuścić 0,2 g proszku o wysokiej rozdzielczości agarozy w 10 mlH2O(woda podwójnie destylowana).
    2. Wymieszać roztwór i podgrzać go do temperatury 80 °C. Utrzymać temperaturę przez 8 minut.
    3. Nałóż 28,6 μl żelu agarozowego na membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych (średnica 4,26 mm) lub użyj 226 μl na 12-dołkowy system wkładek membranowych (średnica 12 mm) (np. system Transwell).
    4. Odczekaj 10 minut, aż żel stężeje.
  2. Żel kolagenowy
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w sterylnych warunkach, a roztwory są utrzymywane na lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    1. Wymieszaj 125 μl zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) z 1 ml 0,4% roztworu kolagenu R (kolagen ze szczurzego ogona).
    2. Miareczkować roztwór 1 M NaOH (wodorotlenek sodu) (~6 μl) do momentu, gdy kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    3. Do żelu kolagenowego dodać 125 μl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i dokładnie wymieszać końcówką pipety.
    4. Nałóż 28,6 μl żelu kolagenowego na membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych lub 226 μl na 12-dołkowy system wkładek membranowych.
    5. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut.
  3. Model komórek kolagenowych z fibroblastem
    UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w sterylnych warunkach.
    1. Przygotuj pierwotne fibroblasty 5-7 dni przed eksperymentem. Hodować fibroblasty z DMEM + 10% FCS w kolbach do hodowli komórkowych (75cm2) i zmieniać podłoże co 2-3 dni.
      UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można użyć większej liczby komórek.
    2. Usunąć pożywkę z kolby do hodowli komórkowej (80% zlewania) i przemyć dwukrotnie 10 ml (kolba hodowlana 75 cm2) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 3 ml 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    3. Delikatnie postukaj w kolbę hodowlaną, aby oderwać komórki od powierzchni. Zatrzymaj reakcję, dodając 3 ml DMEM + 10% FCS. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
    4. Odwirować zawiesinę komórek przy 120 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 0,5 ml DMEM + 10% FCS.
    5. Policz komórki i dostosuj do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml.
      UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane na lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    6. Wymieszaj 125 μl HBSS z 1 ml 0,4% roztworu R kolagenu.
    7. Miareczkować roztwór 1 M NaOH (~ 6 μl) do momentu, gdy kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    8. Dodać 125 μl zawiesiny komórkowej (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 komórek/ml) do żelu kolagenowego i dokładnie wymieszać pipetą.
    9. Nałóż 28,6 μl żelu kolagenowego na membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych lub 226 μl na 12-dołkowy system wkładek membranowych.
    10. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut.
    11. Nanieść 75 μL DMEM + 10% FCS na powierzchnię żelu i 300 μL na płytkę odbiorczą 96-dołkowego systemu wkładek membranowych. W przypadku 12-dołkowego systemu wkładek membranowych należy użyć objętości 590 μl na powierzchnię i 1,846 μl na płytkę odbiorczą.
    12. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu matrycy komórkowej (winda powietrzna) i kontynuować inkubację modelu matrycy komórkowej przez 7 dni. Użyj 100 μl pożywki na dnie i zmieniaj podłoże codziennie.
  4. Model komórek kolagenu z HaCaT
    UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w sterylnych warunkach.
    1. Przygotuj HaCaT 5-7 dni przed wykonaniem kolejnych kroków. Hodować HaCaT z DMEM + 5% FCS w kolbie do hodowli komórkowej (75mm2) i zmieniać podłoże co 2-3 dni.
      UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można użyć większej liczby komórek.
    2. Wyjąć pożywkę z kolby i przemyć dwukrotnie 10 ml (kolba hodowlana 75cm2) PBS. Dodać 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję za pomocą 3 ml DMEM + 10% FCS. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
    3. Odwirować zawiesinę komórkową przy 120 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 0,5 ml DMEM + 10% FCS.
    4. Policz komórki i dostosuj do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml.
      UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane na lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    5. Wymieszaj 125 μl HBSS z 1 ml 0,4% roztworu R kolagenu.
    6. Miareczkować roztwór 1 M NaOH (~ 6 μl) do momentu, gdy kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    7. Do żelu kolagenowego dodać 125 μL DMEM + 10% FCS i dokładnie wymieszać pipetą.
    8. Nałożyć 28,6 μl zawiesiny komórkowej na membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych lub 226 μl na 12-dołkowy system wkładek membranowych.
    9. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut.
    10. Nanieść 75 μl zawiesiny komórkowej na powierzchnię żelu i dodać 300 μl DMEM + 10% FCS do płytki odbiorczej 96-dołkowego systemu wkładek membranowych. W przypadku 12-dołkowego systemu wkładek membranowych należy użyć objętości 590 μl zawiesiny komórek na powierzchni i 1,846 μl DMEM + 10% FCS na płytkę odbiorczą.
    11. Inkubować model macierzy komórkowej przez 3 dni; wymienić pożywkę po 2 dniach.
    12. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu macierzy komórkowej i inkubować model matrycy komórkowej przez kolejne 7 dni. Użyj 100 μl pożywki na dnie i zmieniaj podłoże codziennie.
  5. Model komórek kolagenowych z fibroblastami i HaCaT
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w sterylnych warunkach na lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego. Przygotuj fibroblasty zgodnie z opisem w kroku 1.3 do kroku 1.3.5, a dzień później przygotuj HaCaT zgodnie z opisem w kroku 1.4 do kroku 1.4.4.
    1. Wymieszaj 125 μl HBSS w 1 ml 0,4% roztworu R kolagenu.
    2. Zneutralizować roztwór 1 M NaOH (~6 μL) do momentu, gdy kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony fiolet.
    3. Dodać 125 μl zawiesiny pierwotnych komórek fibroblastów składającej się z DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 komórek/ml do żelu kolagenowego i dokładnie wymieszać.
    4. Nałożyć 28,6 μl zawiesiny komórkowej na membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych lub 226 μl na 12-dołkowy system wkładek membranowych.
    5. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut.
    6. Następnie nanieść 75 μL DMEM + 10% FCS na powierzchnię żelu i 300 μL na płytkę odbiorczą 96-dołkowego systemu wkładek membranowych. W przypadku 12-dołkowego systemu wkładek membranowych objętość 590 μl jest używana na powierzchnię i 1 846 μl na płytkę odbiorczą.
    7. Inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    8. Usuń pożywkę z powierzchni i dodaj zawiesinę komórek HaCaT o stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml. Wolumin jest taki sam, jak opisano wcześniej w kroku 1.5.6.
    9. Inkubować model macierzy komórkowej przez 3 dni; wymienić pożywkę po 2 dniach.
    10. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu macierzy komórkowej i inkubować model matrycy komórkowej przez kolejne 7 dni. Użyj 100 μl pożywki na dnie i zmieniaj pożywkę codziennie.
      UWAGA: Na potrzeby tego badania przygotowano 3 próbki żelu/modelu komórkowego dla 12-dołkowego systemu wkładek membranowych. W przypadku 96-dołkowego systemu wkładek membranowych użyliśmy 6 próbek do modelu żel/komórka. Dla celów statystycznych powszechne są 3 próbki. Jednak w przypadku eksperymentów z 96-dołkowym systemem wstawiania membrany z modelem matrycy kolagenowej spodziewaliśmy się niepowodzeń i odchyleń dla hodowli komórkowej. W związku z tym wybraliśmy większą liczbę próbek.

2. Badania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych

  1. Substancja dawcy
    UWAGA: Wytwarzane są dwie sole sodowe fluoresceiny (NaFl).
    1. Rozpuścić NaFl wH2Ow stężeniach 0,1 mg/ml i 0,01 mg/mL. Różne izotiocyjanian-dekstrany fluoresceiny (FD) o masie cząsteczkowej 4 000, 10 000, 20 000 i 40 000 g/mol rozpuszcza się wH2Ow stężeniu 2 mg/ml. Użyj tych roztworów jako substancji donorowej do eksperymentów przepuszczalności (patrz Rysunek 1) z żelem agarozowym.
    2. Do konfiguracji z modelem komórki kolagenowej przygotuj wszystkie roztwory z DMEM + 10% FCS zamiast wody.
      UWAGA: Przygotować roztwory podstawowe (10x wyższe stężenie) substancji dawcy. Niewielkie zmiany stężenia donora mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentu przepuszczalności.
  2. Metoda eksperymentalna
    UWAGA: Eksperyment przepuszczalności przeprowadza się w temperaturze 37 °C i wilgotności > 90%. Ten parametr zapewnia żywotność komórek. Temperatura wpływa na proces dyfuzji, dlatego te same parametry stosuje się w eksperymentach z żelem agarozowym, żelem kolagenowym i modelem komórek kolagenowych. Informacja o objętości w nawiasie odnosi się do 12-dołkowego systemu wkładów membranowych.
    1. Przygotować 96- (lub 12-) dołkowy system wkładek membranowych z barierą składającą się z żelu agarozowego (patrz Protokół 1.1) lub modelu komórkowego (patrz Protokół 1.2-1.5) i substancji donorowej fluorescencji.
    2. Przygotować rozcieńczenia substancji donorowej w stosunku 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 i 1:320 w celu wyznaczenia krzywej wzorcowej. Odpipetować 300 μl (1,846 μl) każdego rozcieńczenia w trzech dołkach płytki odbiorczej. W przypadku 12-dołkowego systemu wkładek membranowych należy użyć oddzielnej płytki odbiorczej. Seryjne rozcieńczenia służą do przeliczenia zmierzonej fluorescencji [RFU] na stężenie równoważne [mg/mL].
    3. Dodać 75 μl (590 μL) substancji dawcy na próbkę (żel agarozowy lub model komórkowy) i 300 μl (1,846 μL) substancji akceptorowej (H2Olub DMEM + 10% FCS) do płytki odbiorczej (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Upewnij się, że powierzchnie cieczy w systemie wkładek membranowych i w płycie odbiorczej mają ten sam poziom, aby uniknąć ciśnienia hydrostatycznego.
    4. Przenieść cały system na wytrząsarkę w inkubatorze. Dostosuj wytrząsanie, aby uzyskać jednorodne mieszanie (całkowita orbita skoku wynosi 1,5 mm, prędkość jest regulowana na poziomie 3,5, co jest związane z obrotem ~ 480 1/min), aby uniknąć gradientu stężenia, który wpływa na proces dyfuzji.
    5. Oznaczaj fluorescencję okresowo co godzinę. Aby zmierzyć fluorescencję, należy przenieść system wkładów membranowych do pustej płytki i zmierzyć fluorescencję w odbiorniku za pomocą czytnika płytek. Dla fluoresceiny należy użyć długości fali wzbudzenia 485 nm i emisji 535 nm.
    6. Uruchom eksperyment dla 5 h.
      UWAGA: Podczas eksperymentów ciecz odparowuje z całego układu. Parowanie zmienia stężenie w donorze i akceptorze i wpływa na wyniki. Efekt ten jest pomijany w przypadku czasu pracy wynoszącego 5 godzin, ale przy dłuższych czasach pracy należy go wziąć pod uwagę.
  3. Obliczanie współczynnika przepuszczalności
    1. Aby wyznaczyć krzywą standardową, należy wykreślić fluorescencję seryjnych rozcieńczeń w funkcji stężenia i przeprowadzić regresję liniową na danych.
    2. Użyj nachylenia regresji liniowej, aby przekonwertować dane fluorescencji z eksperymentu przenikania na stężenie. Na potrzeby symulacji należy przeliczyć jednostki na mol/m3.
    3. Wykreśl stężenie jako funkcję w czasie i ustal segment liniowy danych (patrz Rysunek 2).
    4. Określ nachylenie tej części liniowej i oblicz współczynnik przepuszczalności zgodnie z następującym równaniem (patrz przykład w Rysunek 2):
      figure-protocol-1
      gdzie dcA/ dt jest zmianą stężenia substancji po stronie akceptora w czasie (nachylenie); CD oznacza stężenie po stronie dawcy; P jest współczynnikiem przepuszczalności; A to powierzchnia przenikania, a VA to objętość akceptora. To równanie wywodzi się z pierwszego prawa Ficka i może być stosowane tylko wtedy, gdy CD » CA6,22.
    5. UWAGA: Stężenia w donorze muszą być znacznie wyższe niż stężenia wykryte w akceptorze. Zostało to zweryfikowane w konfiguracji eksperymentalnej.

3. Symulacja

UWAGA: Symulacja została przeprowadzona za pomocą COMSOL Multiphysics 5.1. Zakłada się podstawową wiedzę na ten temat. Dla symulacji dyfuzji przyjmuje się następujące założenia: a) współczynnik dyfuzji substancji wH2Ojest znacznie wyższy w porównaniu z tym w żelu. Aby skompensować tę różnicę, w symulacji wykorzystuje się wartość 1 x 10-9 m2/s, która jest wyższa od 10 do 100 razy w porównaniu ze współczynnikiem dyfuzji NaFl przez 2% żel agarozowy. b) W doświadczeniu substancja dyfunduje przez barierę, a następnie przez membranę systemu wkładek membranowych. W przeciwieństwie do konfiguracji eksperymentalnej, wirtualny żel agarozowy lub matryca komórkowa i błona są uważane za jedną jednorodną fazę. (c) Efekty graniczne na ściankach są ustawione na "brak poślizgu", wszystkie efekty poślizgu na ściankach (nie między cieczą a żelem lub cieczą a modelem komórkowym) systemu wkładek membranowych są zaniedbywane i nie mają znaczenia dla procesu dyfuzji.

  1. Konfiguracja symulacji dyfuzji
    UWAGA: Poniższe kroki pokazują konfigurację symulacji eksperymentu przepuszczalności. Symulacje dla 96- i 12-dołkowych systemów wkładów membranowych zostały przeprowadzone oddzielnie. Moduł "Transport gatunków chemicznych" wykorzystuje równanie oparte na drugiej zasadzie dyfuzji Ficka:
    figure-protocol-2
    gdzie c jest stężeniem substancji, t jest czasem, u jest prędkością, D jest współczynnikiem dyfuzji, a R jest szybkością reakcji. Szybkość reakcji została pominięta, ponieważ w procesie dyfuzji nie zaszła żadna reakcja chemiczna.
    1. Otwórz program i uruchom nowy model. Wybierz "Kreator modeli", wybierz model 3D, dodaj "Transport rozcieńczonych gatunków" do interfejsu fizyki w menu rozwijanym, kliknij "Badanie", wybierz badanie "Zależne od czasu" i kliknij "Gotowe".
    2. Przejdź do "Definicje globalne" i dodaj "Parametry" prawym przyciskiem myszy. Wprowadź parametry geometryczne i fizyczne w siatce (patrz Tabela 1, Tabela 2 i Rysunek 3e).
      UWAGA: Wklęsła powierzchnia żelu agarozowego w 96-dołkowym systemie wkładek membranowych została przybliżona za pomocą kulki zanurzeniowej.
    3. Ustaw geometrię systemu wkładek membranowych na podstawie eksperymentów. W kroku 3.2 pokazano przykład, jak zbudować geometrię systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. Jednostką długości jest metr.
      UWAGA: Nie buduj całej geometrii, aby zaoszczędzić czas obliczeń. Zamiast tego geometrię można zmniejszyć, używając linii środkowych jednej czwartej geometrii (patrz Rysunek 3a i Rysunek 3b).
    4. Dodaj dwie "Sondy domeny" w "Definicjach" (kliknij prawym przyciskiem myszy "Definicje" i znajdź "Sonda") i wybierz jedną sondę jako domenę akceptującą, a drugą jako domenę dawcy. Zarówno dla typu "Średnia", jak i wyrażenia "c" należy wybrać z jednostką "mol/m3".
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i pokazuje stężenie akceptora i dawcy podczas symulacji.
    5. Ustaw współczynnik dyfuzji (Dc) w "Właściwości transportowe 1" w "Transport rozcieńczonych gatunków" jako "Dif_w".
      UWAGA: "Właściwości transportu 1" są używane zarówno dla domeny akceptora, jak i darczyńcy. W kolejnym kroku domena bariery zostanie nadpisana.
    6. Dodaj drugą "Właściwości transportu 2" z prawym przyciskiem myszy na "Transport rozcieńczonych gatunków" i wybierz barierę (2) w "Wyborze domeny". W zależności od celu symulacji, współczynnik dyfuzji można ustawić jako wartość bariery lub jako zmienną fikcyjną "D". Dla pierwszego uruchomienia testowego ustaw wartość 2E-10 m2/s.
      UWAGA: "D" zostanie zadeklarowane później w kroku 3.3.
    7. W polu "Transport rozcieńczonych gatunków" dla "Wartości początkowych 1" należy zdefiniować stężenie jako zero.
      UWAGA: "Wartości początkowe 1" są używane dla bariery i domeny akceptora. W następnym kroku domena dawcy zostanie nadpisana.
    8. Dodaj drugą "Wartości początkowe 2" z prawym przyciskiem myszy na "Transport rozcieńczonych gatunków" i wybierz dawcę (3) jako domenę. Ustawić stężenie jako początkowe stężenie substancji donorowej (np. C_fl z tabeli 2).
    9. Dodaj "Symetrię 1" i kliknij prawym przyciskiem myszy na "Transport rozcieńczonych gatunków", dodaj i wybierz wszystkie powierzchnie "Wyboru granic", które odzwierciedlają całą geometrię (w przykładzie geometrii w kroku 3.2 jest to granica numer 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      UWAGA: Ten punkt można pominąć, jeśli cała geometria została ustawiona.
    10. Klikając prawym przyciskiem myszy na "Siatka", dodaj dwa "Wolne czworościany". Wybierz barierę (2) jako domenę (zmień poziom elementu geometrycznego na "Domena"). Dodaj "Rozmiar" klikając prawym przyciskiem myszy na "Wolny czworościan 1" i dla predefiniowanej siatki "Drobniejszy" dla 12-dołkowego systemu wkładek membranowych lub "Extra Fine" dla 96-dołkowego systemu wkładek membranowych.
    11. W drugim "Wolnym czworościanie" wybierz akceptor i donor jako domenę i predefiniowaną siatkę "Normalna" dla 12-dołkowego systemu wkładek membranowych lub "Drobniejsza" dla 96-dołkowego systemu wkładek membranowych (patrz Rysunek 3c i Rysunek 3d).
      UWAGA: Możliwe jest również wybranie grubszej siatki, aby zaoszczędzić czas obliczeń. Może to zmniejszyć dokładność wyników. Kliknij "Zbuduj wszystko" w "Ustawieniach siatki", aby utworzyć siatkę geometrii.
    12. Rozpocznij symulację od polecenia "obliczenia" w "Badaniu 1".
  2. Przykładowa konfiguracja dla geometry
    UWAGA: Poniżej podano przykład, jak ustawić geometrię systemu wkładek membranowych z 96 dołkami (z barierą wklęsłą). Wszystkie kroki są wykonywane w module geometrii programu. Jednostką długości jest metr.
    1. Wygeneruj walec 1 (kliknij prawym przyciskiem myszy "Geometria 1") o promieniu d_w/2 i wysokości h_sp+h_b+h_a.
    2. Wygeneruj walec 2 o promieniu d_tran/2, wysokości h_b+h_a i pozycji z h_sp.
    3. Użyj opcji "Różnica" (kliknij prawym przyciskiem myszy "Geometria 1", znajdź "Booleans and Partition"), aby odjąć cylinder 2 od cylindra 1. Wybierz "cyl1" w "Obiektach do dodania", aktywuj "Obiekt do odjęcia" i wybierz "cyl2". Nowy wolumin to geometria akceptora.
    4. Wygeneruj walec 3 o promieniu d_a/2, wysokości h_b i położeniu z h_sp.
    5. Wygeneruj kulę 1 o promieniu r i położeniu z r_z.
    6. Użyj opcji "Różnica", aby odjąć sferę 1 (sph1) od cylindra 3 (cyl3). Nowy tom nosi nazwę Różnica 2.
    7. Wygeneruj walec 4 o promieniu d_a/2, wysokości h_b+h_a i położeniu z h_sp.
    8. Użyj opcji "Różnica", aby odjąć cylinder 4 (cyl4) od różnicy 2. Nowy wolumin to geometria akceptora.
    9. Powtórz kroki 3.2.4-3.2.6, aby zbudować barierę (żel agarozowy lub model komórkowy w doświadczeniu).
    10. Utwórz unię 1 ze wszystkich elementów geometrii (kliknij prawym przyciskiem myszy "Geometria 1", znajdź "Booleans and Partition").
    11. Wygeneruj blok 1 ze wszystkimi krawędziami ustawionymi na długość d_tran*2, pozycję x z -d_tran i y z d_tran*2.
    12. Wygeneruj blok 2 o całej długości krawędzi d_tran*2, pozycji x z -d_tran*2 i y z -d_tran.
    13. Użyj opcji "Różnica", aby odjąć sumę 1 od bloku 1 i bloku 2.
  3. Dodawanie parametru Optymalizacja do Simulation
    UWAGA: Za pomocą optymalizacji parametrów można dopasować współczynnik dyfuzji do wcześniej wygenerowanych danych eksperymentalnych. Poniższe instrukcje pokazują, jak zintegrować część optymalizacyjną z symulacją dyfuzji. Upewnij się, że symulacja dyfuzji działa przed rozpoczęciem tych kroków.
    1. Dodaj moduł fizyki "Optymalizacja" za pomocą "Dodaj fizykę" (optymalizację można znaleźć w "Matematyce" w kategorii "Optymalizacja i czułość") do symulacji. Kliknij "Dodaj do komponentu".
    2. Dodaj "Zmienne" za pomocą prawego przycisku myszy w sekcji "Definicje" (lokalne w komponencie) i wpisz zmienne z tabeli 3.
      UWAGA: Optymalizacja parametrów wykorzystuje liczby rzeczywiste, tzn. współczynnik 1-10 współczynnika dyfuzji musi być zdefiniowany osobno.
    3. Dodaj "Średnią 1", klikając prawym przyciskiem myszy na "Definicje" w sekcji "Sprzężenie komponentów" i wpisz nazwę operatora "Akceptor".
    4. Wygeneruj osobny dokument tekstowy zawierający dane eksperymentalne.
      UWAGA: Kolumny są oddzielone średnikiem; Wiersze są oddzielone znakiem końca wiersza. Deklaracja czasu jest mierzona w sekundach, stężenie w mol/m3. Usuń pierwszy i drugi punkt danych w fazie opóźnienia (patrz Rysunek 2) eksperymentów, aby uniknąć ewentualnych błędów dopasowania. Oto przykład, jak może wyglądać dokument tekstowy:
      3540; 0.00216
      7140; 0.00724
      12240; 0.01707
      15180; 0.02230
      18660; 0.02697
      21540; 0.02931
      Ten przykład może służyć do testowania symulacji.
    5. Dodaj "Globalny cel najmniejszych kwadratów" klikając prawym przyciskiem myszy na "Optymalizacja", dołącz dokument tekstowy z kroku 3.3.4 do "danych eksperymentalnych" i zdefiniuj pierwszą kolumnę jako "Kolumnę czasu 1" klikając prawym przyciskiem myszy na "Globalny cel najmniejszych kwadratów", a drugą kolumnę jako "Kolumnę wartości 1" z prawym przyciskiem myszy na "Globalny cel najmniejszych kwadratów". W polu "Wyrażenie" w polu "Kolumna wartości" wpisz zmienną "C".
    6. Dodaj "Globalne zmienne sterujące 1" za pomocą prawego przycisku myszy na "Optymalizacja" i zadeklaruj "D_search" jako zmienną o wartości początkowej "1", dolnej granicy "0" i górnej granicy "1000".
    7. Dodaj "Optymalizację" za pomocą prawego przycisku myszy na "Badanie 1" i wybierz "SNOPT" jako metodę rozwiązywania optymalizacji. Ustaw tolerancję optymalności na 1E-9.
      UWAGA: Jeśli symulacja nie jest zbieżna, zwiększ tolerancję optymalności. Należy pamiętać, że symulacja będzie niedokładna, jeśli tolerancja optymalności będzie zbyt duża.
    8. Rozpocznij optymalizację parametrów za pomocą polecenia "obliczenia" w "badaniu". Nie zapomnij ustawić współczynnika dyfuzji na barierze jako "D".

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z przepuszczalnością w 96-dołkowym systemie wkładów membranowych z 2% żelem agarozowym jako barierą zostały przeprowadzone w celu oceny dokładności symulacji. Sól sodowa fluoresceiny (NaFl) i izotiocyjanian fluoresceiny (FD) wykorzystano do sprawdzenia wpływu wielkości cząsteczkowej substancji dyfuzyjnej od 5 x 10-10 m do 45 x 10-10 m promienia Stokesa (376,27-40 000 mol wt). Natywna optymalizacja parametrów symulacji została wykorzystana do dopasowania symulacji do danych eksperymentalnych.

W tym celu porównano nachylenia tylko liniowych części symulowanej przepuszczalności z wynikami eksperymentu. W przypadku małych rozmiarów molekularnych dane symulacyjne i eksperymentalne były zgodne z 99,2% dla NaFl i 80,2% dla FD 4000 (patrz Rysunek 4a i Rysunek 4b). Większy rozmiar cząsteczki generował większe odchylenia, wykazując korelacje wynoszące 50,5% dla FD 10 000, 79,7% dla FD 20 000 i 53,6% dla FD 40 000. Progresja krzywej w symulacjach wykazała opóźnienie na początku i silniejszy wzrost w dalszym przebiegu wykresów (patrz Rysunek 4c-4e).

Współczynniki przepuszczalności i symulowane współczynniki dyfuzji są pokazane w Tabeli 4. Współczynnik przenikania zmniejsza się wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki. Odchylenie standardowe mieściło się w przedziale od 0,08 x 10-8 m/s do 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), co odpowiadało błędowi bezwzględnemu od 4,18% do 46,15%. Eksperymenty z większymi cząsteczkami wykazały większy błąd bezwzględny. Symulowane współczynniki dyfuzji zachowywały się bardzo podobnie do eksperymentalnych współczynników przepuszczalności. Substancje o większych promieniach Stokesa wykazywały malejące współczynniki dyfuzji, a błąd bezwzględny mieścił się w przedziale od 9,09% do 18,46% (N = 3).

W dodatkowych eksperymentach z przenikaniem, cztery różne typy modeli komórek kolagenu zostały użyte jako bariery w 12-dołkowym systemie wstawiania membran. Modele te składają się z modelu bezkomórkowego i modelu komórkowego z różnymi kombinacjami pierwotnych fibroblastów w żelu kolagenowym i HaCaT na powierzchni. Zastosowano następujące kombinacje: Kolagen (Col.) jako model bezkomórkowy, Kolagen + Fibroblasty (Col.+F.), Kolagen + HaCaT (Col.+H.) oraz Kolagen + Fibroblasty + HaCaT (Col.+F.+H.). Jako substancję donorową zastosowano sól sodową fluoresceiny z DMEM + 10% FCS. Do analizy obrazowej modelu komórki kolagenu zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). To barwienie zostało wykonane przy użyciu protokołu producenta. W Rysunek 5, pokazana jest taka plama z reprezentatywnym modelem Col.+F.+H. HE nieznacznie zabarwia strukturę tkankową macierzy kolagenowej. Fibroblasty znajdują się w macierzy, a jądra fibroblastów i komórek HaCaT są zabarwione na ciemnofioletowy kolor. Na wierzchu macierzy kolagenowej znajduje się warstwa zawierająca wiele jąder, które powinny być jądrami HaCaT, budując warstwę otaczającą na górze modelu.

W Tabeli 5 podano eksperymentalne współczynniki przenikania i symulowane współczynniki dyfuzji. Trend można zaobserwować w przypadku większości modeli z HaCaT, które mają niższe współczynniki przenikania/dyfuzji w porównaniu z modelami bez HaCaT. Błąd bezwzględny współczynników przenikania wynosi 10,9-24,4%, a dla współczynników dyfuzji 5,2%-12,9%.

figure-results-1
Rysunek 1: Widok z boku eksperymentu przepuszczalności w systemie wkładów membranowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykładowy wykres eksperymentu z przepuszczalnością. Stężenie akceptora jest wykreślane w czasie. Dwie linie przerywane znajdują się w nawiasach kwadratowych w prawie liniowej części wykresu. Nachylenie części liniowej służy do określenia współczynnika przepuszczalności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Geometria i siatka systemu wkładów membranowych w symulacji. a) Geometria systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. b) Geometria 12-dołkowego systemu wkładek membranowych. c) Siatka systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. d) Siatka 12-dołkowego systemu wkładek membranowych. e) Przekrój i parametry systemu wkładów membranowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie danych eksperymentalnych z eksperymentu przenikania ze zoptymalizowaną symulacją. (a) sól sodowa fluoresceiny, (b) izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran 4 000 mol wag., (c) 10 000 mol wag., (d) 20 000 mol wag., i (e) 40 000 mol wt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywne barwienie HE modelu komórki kolagenowej (kolagen + fibroblasty + HaCaT). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Współczynnik przepuszczalności w funkcji promienia 1/Stokesa przy użyciu soli sodowej fluoresceiny i izotiocyjanianu fluoresceiny w 96-dołkowym systemie wkładek membranowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

nazwaDoświadczenie dla systemu 96-dołkowego w mmEkspersja dla systemu 12-dołkowego w mmopis
d_tran5.65 [mm]14.7 [mm]Średnica studni
d_a4.26 [mm]12.1 [mm]Średnica membrany
d_w8.79 [mm]21.97 [mm]Średnica akceptora
h_b2 [mm]2 [mm]Wysokość bariery
h_sp1 [mm]1 [mm]Odległość między studnią a dnem
h_a4.73 [mm]5.24 [mm]Wysoki poziom akceptora
bh_b/2-Głębokość zanurzenia
r((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)-Promień Piłki Zanurzeniowej+
r_zr+h_b-Pozycja Z kuli zanurzeniowej+

Tabela 1: Parametry geometrii dla symulacji "Transportu Gatunków Chemicznych". +Do stosowania wyłącznie do symulacji żelu agarozowego w 96-dołkowym systemie wkładek membranowych.

nazwawyrażeniewartośćopis
C_fl0,1 [mg/ml]/376,28 [g/mol]0,26576 mol/m2Stężenie Fl.So.
C_42 [mg/ml]/4000 [g/mol]0,5 mol/m2Stężenie FD 4.000
C_102 [mg/ml]/10000 [g/mol]0,2 mol/m2Stężenie FD 10.000
C_202 [mg/ml]/20000 [g/mol]0,1 mol/m2Stężenie FD 20.000
C_402 [mg/ml]/40000 [g/mol]0,05 mol/m2Stężenie FD 40.000
Dif_w1e-9 [m^2/s]1E-9m2/sWspółczynnik dyfuzji wody zarobowej

Tabela 2: Parametry fizyczne dla symulacji "Transportu Gatunków Chemicznych".

nazwawyrażenieopis
ZAkceptant(c)Definicja stężenia akceptora
DD_search*1e-10Zmiana współczynnika dla D

Tabela 3: Parametry symulacji "Optymalizacji".

przenikaćWspółczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10Promień Stokesa permeatu (m)x10-10
Fl.So.4,79 ± 0,201,94 ± 0,345
FD 4,0002,37 ± 0,310,65 ± 0,1214
FD10 0001,67 ± 0,470,22 ± 0,0223
FD 20 0000,65 ± 0,300,29 ± 0,0433 Rozdział 33
FD 40 0000,27 ± 0,080,14 ± 0,02Rozdział 45

Tabela 4: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji substancji o różnym promieniu Stokesa przez 2% żel agarozowy + membrana w 96-dołkowym systemie wkładek membranowych. (sól sodowa fluoresceiny = Fl. So., dekstran fitc = FD).

modelWspółczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10
Col.2,18 ± 0,291,22 ± 0,06
Kol.+F.1,77 ± 0,380,93 ± 0,12
Kol.+H.1,64 ± 0,400,96 ± 0,05
Kol.+F.+H.1,65 ± 0,180,88 ± 0,11

Tabela 5: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji soli sodowej fluoresceiny przez model komórki kolagenowej w 12-dołkowym systemie wstawiania membrany (Col. = Collagen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to dokumentuje metodę opracowaną w celu ilościowego określenia przenikania przez konstrukt tkankowy skonstruowany na membranie. Najpierw zbadano przenikanie substancji o różnych rozmiarach molekularnych przez żel agarozowy w celu przetestowania i walidacji metody oraz odpowiedniej symulacji. Powszechnie wiadomo, że mniejsze cząsteczki przenikają szybciej przez siatkę matrycy (z wyjątkiem efektu filtracji żelowej za pomocą chromatografii przepuszczalności). Podobne obserwacje poczyniono w eksperymentach z wykluczeniem wielkości substancji przez twardówkę26, ludzką błonę naskórkową27, ludzką skórę17 i skórę szczura28. Wykazano odwrotną korelację między współczynnikami przepuszczalności a odpowiadającym im promieniem Stokesa (promień twardej kuli, która porusza się z taką samą szybkością dyfuzji jak opisywane cząsteczki, zwykle mniejszą niż efektywny promień cząsteczki) wykazano26,28, a podobną zależność zaobserwowano w eksperymentach z substancjami o różnych rozmiarach cząsteczek. Wykreślając współczynniki przepuszczalności w promieniu 1/Stokesa, stwierdzono korelację liniową między czterema grupami o najmniejszym rozmiarze cząsteczki (R2 = 0,93) (ryc. 6). Oznacza to, że symulowane współczynniki przepuszczalności przy sugerowanej metodzie mieszczą się w realistycznym zakresie.

Błąd wynoszący 46,15% w eksperymentach jest nieco większy niż podany w eksperymentach z przepuszczalnością z systemem komórek dyfuzyjnychFranza 10. Jednym z możliwych wyjaśnień może być rozkład wielkości fluoresceiny-izotiocyjanianu-dekstranu, który zostanie omówiony później.

Opisana metoda ma istotne zalety w porównaniu z metodami wykorzystującymi system komórek dyfuzyjnych Franza. Po pierwsze, konfiguracja jest bardziej kompaktowa; Eksperymenty są wykonywane bezpośrednio w systemie wkładek membranowych, który ma skalę komercyjnej płytki studziennej (∼ 13 cm x 8,5 cm). Umożliwia to jednoczesne badanie wielu próbek, podczas gdy do każdej próbki potrzebna jest oddzielna komórka dyfuzyjna Franza. Po drugie, przepuszczalność modelu skóry można zmierzyć bezpośrednio we wkładzie membranowym, w którym odbywa się uprawa. W przypadku komór dyfuzyjnych Franza próbki muszą być wyjmowane i montowane w systemie, co jest bardziej kłopotliwe w przypadku małych próbek, a także bardziej czasochłonne.

Eksperymenty z przenikaniem matryc komórek kolagenowych wykazały, że metoda ta może być z powodzeniem stosowana w systemach komórkowych. Prezentowany tutaj model został zweryfikowany pod kątem modeli skóry; Metodę tę można jednak zastosować do innych rodzajów organicznych hodowli komórkowych, np. nerek lub wątroby.

W tym badaniu wykorzystano model komórki kolagenowej, w którym komórki HaCaT całkowicie pokryły powierzchnię modelu (patrz ryc. 5). Doprowadziło to do obniżenia współczynnika przepuszczalności, co pokazuje, że metoda jest wystarczająco czuła, aby rozróżnić współczynnik przepuszczalności między modelem kolagenowo-komórkowym z warstwą HaCaT i bez niej. Idealnie byłoby, gdyby model skóry budował barierę, która zbliża się do naskórka prawdziwej skóry29, dlatego ważne jest, aby zweryfikować jakość (np. budowę skóry właściwej, naskórek) modelu skóry przed faktycznym użyciem. Rozwój modelu skóry można zwizualizować za pomocą technik barwienia i określić ilościowo na podstawie wykrycia białka skóry i kolagenu 30,31,32. Współczynnik przepuszczalności może być również ważnym czynnikiem oceny rozwoju modelu skóry, ale potrzebne są dalsze eksperymenty, aby to potwierdzić. Jak wcześniej wspomniano, metoda ta umożliwia równoległe uruchamianie wielu próbek. Możliwe jest również pobranie próbek podczas uprawy w celu zmierzenia przepuszczalności, a tym samym obserwowanie rozwoju tego parametru modelu skóry.

Należy zauważyć, że przepuszczalność jest mierzona jednocześnie za pomocą modelu żelowo-kolagenowo-komórkowego i membrany. Wykryty współczynnik przepuszczalności jest specyficzny dla systemu, przy czym wyniki różnych modeli skóry można porównać tylko w przypadku stosowania tej samej wkładki membranowej. Ponadto model skóry musi pokrywać cały obszar uprawy, aby zapewnić, że substancja badana będzie przenikać tylko przez model, a nie w jego sąsiedztwie, co spowodowałoby błędy w mierzonej przepuszczalności. Kolejnym aspektem, który powinien być brany pod uwagę w przyszłych eksperymentach, jest naturalne środowisko otaczające skórę. Zwykle temperatura powierzchni skóry jest niższa w porównaniu z obszarem wewnętrznym, co może wpływać na warunki przenikania.

W celu dopasowania eksperymentów laboratoryjnych do symulacji komputerowych zaprezentowano metodę umożliwiającą optymalizację parametrów dla symulacji stosowanej. Stwierdzono, że symulacje są dobrze zbieżne z danymi eksperymentalnymi dotyczącymi substancji o małych rozmiarach cząsteczkowych. Zaobserwowano jednak rozbieżności między danymi symulacyjnymi a eksperymentalnymi w przypadku substancji o większych rozmiarach cząsteczkowych. Duże cząsteczki polisacharydów mogą zwiększać tarcie i spowalniać proces dyfuzji w żelu. Efekt ten powoduje nieprawidłową dyfuzję, która jest możliwą przyczyną odchylenia między wartościami eksperymentalnymi i symulacyjnymi33,34. Innym wyjaśnieniem może być obecność mniejszych lub większych cząstek w dekstranie fluoresceiny-izotiocyjanianu. Producent określa masę cząsteczkową substancji jako średnią wielkość o danym zakresie, co pozwala na obecność mniejszych i większych cząstek. Nie jest również jasne, jak rozproszone są te substancje, ponieważ mniejsze cząsteczki szybciej przenikają przez żel i kanał płynu. Możliwe jest rozszerzenie symulacji w celu uwzględnienia tych efektów dyfuzji i tarcia.

Eksperyment i symulacja przepuszczalności zostały opracowane do użytku w 2-OC. Za pomocą symulacji tę eksperymentalną metodę można bezpośrednio przenieść do bardziej wyrafinowanych konfiguracji eksperymentalnych. Na przykład, symulację systemu wkładek membranowych można łatwo przenieść na geometrię 2-OC lub do innych systemów o podobnych konfiguracjach. Ta opcja modulacji symulacji może być wykorzystana do wsparcia projektowania przyszłych eksperymentów. Ponadto efekty uboczne, takie jak parowanie, nieprawidłowa dyfuzja i efekty membranowe, można zintegrować w celu ulepszenia symulacji, poprawiając w ten sposób dokładność. Program symulacyjny daje możliwość zmiany lub ulepszenia równania symulacyjnego, a także zintegrowania innych modułów fizycznych w celu zbadania innych aspektów rozwoju modelu skóry. Jednym z przykładów jest symulacja zużycia glukozy i produkcji mleczanu w modelu komórki kolagenowej.

Szczególnie interesującym aspektem w testowaniu substancji medycznych jest sposób, w jaki substancje te są rozprowadzane w systemie narządów na chipie. Parametr symulacji i przepuszczalności pomaga odpowiedzieć na pytania, takie jak szybkość przenikania substancji do układu, a także jakie stężenie będzie dostępne dla innych tkanek w wielonarządowym chipie. Metoda ta może wspierać i usprawniać rozwój i testowanie takich systemów typu organ-on-chip.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwe Marx jest dyrektorem generalnym i udziałowcem, a Gerd Lindner jest udziałowcem TissUse GmbH, firmy produkującej i komercjalizującej technologię MOC. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została stworzona dzięki wsparciu finansowemu Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantu nr. PO413/12-1 oraz LA 1028/7-1.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarozaCarl RothK297.2Kolagen w proszku o wysokiej rozdzielczości
Serva47256.01Roztwór kolagenu R 0,4
DMEMLonza (Biozym Scientific GmbH)880010-12Wysoka glukoza z L-glutaminą
FCSBiochrom GmbHS0615 0114FSurowica cielęca płodu
Sól sodowa fluoresceinySigma-Aldrich46960-25G-F
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-Aldrich46944-500MG4000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD10S-250MG10 000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD20S-250MG20 000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD40S-250MG40 000 g/mol
HBSSThermoFisher Scientific14170120bez wapnia, bez magnezu, z czerwienią fenolową
NaOHMerck1.06467.9010granulowany
PBSGibco18912-014tabletki
Transwell Cell Culture InsertsCorning339196 studzienka, 0,4 i mikro; m wielkość
porów Wkładki do hodowli komórkowych TranswellCorning (VWR)734-156312 dołków, 0,4 i mikro; m wielkość porów
TrypsynaBiochrom GmbHL2143z EDTA
%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).">Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).">Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).">Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).">Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).">Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).">Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).">Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).">Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).">Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).">Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).">Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).">Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).">Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).">Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).">Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).">Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).">Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).">Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).">Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).">Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).">Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).">Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).
  23. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).">Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).">Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).">Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).
  26. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).">Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).">Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).">Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).">Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).">Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).">Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).">Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).">Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).">Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Permeability DeterminationDiffusion Coefficient3D Tissue ModelMembrane Insert SystemMulti well PlatesAgarose GelCollagen GelCollagen Cell ModelFluorescence MeasurementSimulation Optimization

Related Articles