Artykuł metodologiczny

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

28.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56412

⸱

23 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono metodę określania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych oraz optymalizacji parametrów in silico do obliczania współczynników dyfuzji za pomocą symulacji.

Streszczenie

Modele skóry hodowane in vitro stają się coraz bardziej przydatne w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych, a także są wykorzystywane do opracowywania leków, jak również do testowania substancji. Modele te są najczęściej uprawiane w systemach membranowo-wkładowych, a ich przepuszczalność dla różnych substancji jest istotnym czynnikiem. Zazwyczaj stosowane metody oznaczania tych parametrów wymagają zwykle dużych rozmiarów próbek (np. komórka dyfuzyjna Franza) lub pracochłonnego sprzętu (np. odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)). W pracy przedstawiono metodę wyznaczania współczynników przepuszczalności bezpośrednio w systemach membranowo-wsadowych o średnicach 4,26 mm i 12,2 mm (powierzchnia uprawy). Metodę zwalidowano za pomocą agarozy i żeli kolagenowych, a także modelu komórki kolagenowej reprezentującego modele skóry. Dokładnie opisano procesy przenikania substancji o różnych rozmiarach molekularnych i przenikania przez różne modele komórkowe (składające się z żelu kolagenowego, fibroblastów i HaCaT).

Ponadto, aby wesprzeć powyższą metodę eksperymentalną, stworzono symulację. Symulacja dobrze pasuje do danych eksperymentalnych dla substancji o małych rozmiarach molekularnych, do 14 x 10-10 m promienia Stokesa (4000 MW), a zatem jest obiecującym narzędziem do opisania systemu. Co więcej, symulacja może znacznie zmniejszyć wysiłek związany z eksperymentami i jest wystarczająco solidna, aby można ją było rozszerzyć lub dostosować do bardziej złożonych konfiguracji.

Wprowadzenie

Organiczne kultury 3D stały się potężnymi narzędziami do opracowywania leków i testowania substancji1. Pod tym względem modele ludzkiej skóry cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na wymogi regulacyjne, takie jak te w przemyśle kosmetycznym. Doprowadziły one następnie do opracowania licznych modeli skóry 3D, które można stosować samodzielnie jako hodowle jednonarządowe na płytkach wielodołkowych lub w chipach wielonarządowych w połączeniu z dodatkowymi modelami narządów, np. liver2.

Jeśli chodzi o uprawę odpowiednika skóry, interfejs powietrze-ciecz (ALI) jest niezbędnym elementem dla prawidłowego różnicowania naskórka3. Wkładki do hodowli komórkowych składające się z naczynia z membraną przepuszczalną dla cieczy na dnie są zwykle używane do wytworzenia ALI. ALI są szeroko stosowane w dostępnych na rynku modelach skóry, takich jak EpiDerm4, Phenion5 i Episkin6, do hodowli modeli skóry o rozmiarach od 96-dołkowych (4,26 mm średnicy) do 12-dołkowych (12,2 mm średnicy). Opisana tutaj metoda określa przenikanie substancji w systemie wkładu membranowego.

Współczynnik przepuszczalności jest istotnym parametrem do oceny jakości każdego modelu skóry z hodowlą w porównaniu do rodzimej skóry5, i jest używany do oceny, jak szybko substancje aktywne migrują przez skórę. Zwłaszcza jeśli na skórę trzeba nakładać leki lub produkty kosmetyczne, parametr ten jest niezbędny, aby zrozumieć, kiedy dokładnie przechodzą przez nią substancje czynne. Symulacja może dodatkowo pomóc w przewidywaniu zachowania systemu, a następnie w zmniejszeniu niezbędnego czasochłonnego wysiłku eksperymentalnego, zwłaszcza gdy w grę wchodzi duży zestaw substancji.

Komórka dyfuzyjna Franza jest najnowocześniejsza do eksperymentów z przenikaniem skóry i modeli skóry5,6,7,8,9. Urządzenie to składa się z dwóch komór, pomiędzy którymi znajduje się nieruchoma próbka (bariera dyfuzyjna). Substancję, która ma być poddana badaniu, nakłada się bezpośrednio na górną część próbki (przedział dawcy), a stężenie przenikającego związku można wykryć w przeciwległym (akceptorowym) komorze. Po stronie akceptora stała temperatura i jednorodne stężenie substancji są zapewnione przez komorę temperaturową i mieszadło magnetyczne. Próbki można pobierać z ramienia do pobierania próbek po stronie akceptora komórki Franza. Z zakresem wysokości od 19 cm do 179 cm, system ten jest stosunkowo duży10,11. Inną metodą oznaczania współczynników dyfuzji w substancjach żelopodobnych i tkankach jest FRAP. Technika ta wykorzystuje zasadę wybielania fluorescencyjnie znakowanych cząstek w żelu, a następnie określania czasu regeneracji bielonego obszaru w celu obliczenia współczynnika dyfuzji12,13,14.

Ponadto, spektroskopia FTIR z transformacją Fouriera może być używana do wykrywania ruchu cząstek za pomocą absorpcji światła podczerwonego w celu określenia procesu przenikania substancji w skórze15,16. Jednak te lub inne metody obrazowania (np. spektroskopia korelacji fluorescencji dwufotonowej17) wymagają kosztownych instrumentów.

W tym artykule przedstawiono metodę bezpośredniego pomiaru przepuszczalności bariery w systemie wkładów membranowych, gdzie można hodować model skóry. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z przepuszczalnością na dużej liczbie małych próbek (o wielkości studni do 4,26 mm) w kompaktowym systemie. Jest to przeciwieństwo celi dyfuzyjnej Franza, gdzie do każdej sondy potrzebne jest osobne urządzenie, które musi być zamontowane na urządzeniu i jest trudne do zrealizowania dla małych próbek (rozmiar 4,26 mm). Ponadto, ponieważ metoda ta nie wymaga dużego oprzyrządowania (np. mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego), uzyskuje się redukcję zarówno czasu, jak i kosztów.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w mikroporowatych systemach wkładek membranowych z próbką (barierą) składającą się z żelu agarozowego lub modelu komórki kolagenowej umieszczonej na membranie. Substancje fluorescencyjne (donor) o różnych rozmiarach molekularnych zostały naniesione na wierzch próbki, a stężenie przenikanej substancji wykryto na dole (akceptorze) za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz Rysunek 1). W celu walidacji metody i przetestowania dokładności tej symulacji wyprodukowano żele agarozowe, które zastosowano jako barierę. Hydrożele są powszechnie używane do badania procesów dyfuzji i przenikania w porowatym ośrodku w naukach biologicznych13. Metoda została następnie przetestowana w systemie komórkowym składającym się z macierzy kolagenowej pierwotnych fibroblastów i komórek ludzkich dorosłych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury (HaCaT) (model macierzy komórkowej), który jest uproszczonym modelem skóry18,19.

Dodatkowo, proces przenikania był symulowany za pomocą symulacji przepływu z obliczeniową dynamiką płynów. Stwierdzono, że za pomocą optymalizacji parametrów można obliczyć współczynnik dyfuzji na podstawie danych doświadczalnych. Ogólnie rzecz biorąc, ta symulacja oferuje różne zastosowania; Na przykład możliwe jest przewidzenie procesu przenikania na podstawie krótkich eksperymentów, a symulacja może znacznie zmniejszyć liczbę eksperymentów.

Eksperymentalna metoda i symulacja zostały zaprojektowane do zastosowania w systemie organ-on-a-chip1,20,21, w szczególności 2-organ-chip (2-OC) opracowany komercyjnie1,22,23,24,25. W zasadzie w ten sposób można opisać proces przenikania dowolnego modelu narządu opartego na systemach wkładów błonowych.

Protokół

1. Przygotowanie próbki do badań przepuszczalności

UWAGA: W celu weryfikacji pomiarów i symulacji przenikania wykorzystano próbkę składającą się z żelu agarozowego lub model macierzy komórkowej oparty na hodowli modelu skóry.

  1. Żel agarozowy
    1. Rozpuścić 0,2 g proszku agarozy o wysokiej rozdzielczości w 10 mL H2O (wody dwukrotnie destylowanej).
    2. Wymieszać roztwór i podgrzać go do 80 °C. Utrzymywać tę temperaturę przez 8 min.
    3. Nanieść 28,6 µL żelu agarozowego na membranę systemu wkładów membranowych z 96 dołkami (średnica 4,26 mm) lub użyć 226 µL dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami (średnica 12 mm) (np. system Transwell).
    4. Odczekać 10 min do momentu zestalenia żelu.
  2. Żel kolagenowy
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych, a roztwory są przechowywane w lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    1. Wymieszać 125 µL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) z 1 mL 0,4% roztworu kolagenu R (kolagen z ogona szczura).
    2. Tytrować roztwór 1 M NaOH (wodorotlenkiem sodu) (~6 µL), aż kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    3. Dodać 125 µL modyfikowanej pożywki Eagle'a (DMEM) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do żelu kolagenowego i ostrożnie wymieszać końcówką pipety.
    4. Nanieść 28,6 µL żelu kolagenowego na membranę systemu wkładów membranowych z 96 dołkami lub 226 µL dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami.
    5. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min.
  3. Kolagenowy model komórkowy z fibroblastami
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych.
    1. Przygotować pierwotne fibroblasty na 5-7 dni przed eksperymentem. Hodować fibroblasty w pożywce DMEM + 10% FCS w kolbach do hodowli komórek (75 cm2) i wymieniać pożywkę co 2-3 dni.
      UWAGA: W zależności od układu eksperymentalnego można użyć większej liczby komórek.
    2. Usunąć pożywkę z kolby do hodowli komórek (przy 80% konfluencji) i przemyć dwukrotnie 10 mL (kolba 75 cm2) solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Dodać 3 mL 0,05% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować przez 3 min w 37 °C.
    3. Delikatnie opukać kolbę hodowlaną, aby odkleić komórki od powierzchni. Przerwać reakcję, dodając 3 mL DMEM + 10% FCS. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
    4. Wirować zawiesinę komórkową przy 120 x g, usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 0,5 mL DMEM + 10% FCS.
    5. Policzyć komórki i dostosować stężenie do 0,5 x 106 komórek/mL.
      UWAGA: Następne kroki są wykonywane w lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    6. Wymieszać 125 µL HBSS z 1 mL 0,4% roztworu kolagenu R.
    7. Tytrować roztwór 1 M NaOH (~ 6 µL), aż kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    8. Dodać 125 µL zawiesiny komórkowej (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 komórek/mL) do żelu kolagenowego i ostrożnie wymieszać pipetą.
    9. Nanieść 28,6 µL żelu kolagenowego na membranę systemu wkładów membranowych z 96 dołkami lub 226 µL dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami.
    10. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min.
    11. Nanieść 75 µL DMEM + 10% FCS na powierzchnię żelu i 300 µL do płytki odbiorczej systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. Dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami użyć objętości 590 µL na powierzchnię i 1 846 µL do płytki odbiorczej.
    12. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu macierzy komórkowej (air lift) i inkubować model macierzy komórkowej przez kolejne 7 dni. Stosować 100 μl pożywki na dnie i wymieniać pożywkę codziennie.
  4. Kolagenowy model komórkowy z linią HaCaT
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych.
    1. Przygotować komórki HaCaT na 5-7 dni przed kolejnymi etapami. Hodować HaCaT w pożywce DMEM + 5% FCS w kolbie do hodowli komórek (75 mm2) i wymieniać pożywkę co 2-3 dni.
      UWAGA: W zależności od układu eksperymentalnego można użyć większej liczby komórek.
    2. Usunąć pożywkę z kolby i przemyć dwukrotnie 10 mL (kolba 75 cm2) PBS. Dodać 3 mL 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować przez 10 min w 37 °C. Przerwać reakcję 3 mL DMEM + 10% FCS. Przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
    3. Wirować zawiesinę komórkową przy 120 x g, usunąć nadsącz i resuspendować komórki w 0,5 mL DMEM + 10% FCS.
    4. Policzyć komórki i dostosować stężenie do 0,5 x 106 komórek/mL.
      UWAGA: Następne kroki są wykonywane w lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego.
    5. Wymieszać 125 µL HBSS z 1 mL 0,4% roztworu kolagenu R.
    6. Tytrować roztwór 1 M NaOH (~ 6 µL), aż kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwony.
    7. Dodać 125 µL DMEM + 10% FCS do żelu kolagenowego i ostrożnie wymieszać pipetą.
    8. Nanieść 28,6 µL zawiesiny komórkowej na membranę systemu wkładów membranowych z 96 dołkami lub 226 µL dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami.
    9. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min.
    10. Nanieść 75 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię żelu i dodać 300 µL DMEM + 10% FCS do płytki odbiorczej systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. Dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami użyć objętości 590 µL zawiesiny komórkowej na powierzchnię i 1 846 µL DMEM + 10% FCS do płytki odbiorczej.
    11. Inkubować model macierzy komórkowej przez 3 dni; wymienić pożywkę po 2 dniach.
    12. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu macierzy komórkowej i inkubować model macierzy komórkowej przez kolejne 7 dni. Stosować 100 µl pożywki na dnie i wymieniać pożywkę codziennie.
  5. Kolagenowy model komórkowy z fibroblastami i HaCaT
    UWAGA: Wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych w lodzie, aby spowolnić polimeryzację żelu kolagenowego. Fibroblasty przygotować zgodnie z opisem w punkcie 1.3 do punktu 1.3.5, a dzień później HaCaT zgodnie z opisem w punkcie 1.4 do punktu 1.4.4.
    1. Wymieszać 125 µL HBSS w 1 mL 0,4% roztworu kolagenu R.
    2. Zneutralizować roztwór 1 M NaOH (~6 µL), aż kolor czerwieni fenolowej zmieni się z żółtego na czerwono-fioletowy.
    3. Dodać 125 µL zawiesiny pierwotnych fibroblastów składającej się z DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 komórek/mL do żelu kolagenowego i ostrożnie wymieszać.
    4. Nanieść 28,6 µL zawiesiny komórkowej na membranę systemu wkładów membranowych z 96 dołkami lub 226 µL dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami.
    5. Pozostawić żel w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 30 min.
    6. Następnie nanieść 75 µL DMEM + 10% FCS na powierzchnię żelu i 300 µL do płytki odbiorczej systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. Dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami stosuje się objętość 590 µL na powierzchnię i 1 846 µL do płytki odbiorczej.
    7. Inkubować przez 1 dzień w 37 °C i 5% CO2.
    8. Usunąć pożywkę z powierzchni i dodać zawiesinę komórek HaCaT o stężeniu 0,5 x 106 komórek/mL. Objętość jest taka sama, jak opisano wcześniej w punkcie 1.5.6.
    9. Inkubować model macierzy komórkowej przez 3 dni; wymienić pożywkę po 2 dniach.
    10. Usunąć pożywkę z powierzchni modelu macierzy komórkowej i inkubować model macierzy komórkowej przez kolejne 7 dni. Stosować 100 µl pożywki na dnie i wymieniać pożywkę codziennie.
      UWAGA: Do tego badania przygotowano 3 próbki modelu żel/komórka dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami. Dla systemu wkładów membranowych z 96 dołkami użyliśmy 6 próbek modelu żel/komórka. W celach statystycznych zazwyczaj stosuje się 3 próbki. Jednak w przypadku eksperymentów w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami z kolagenowym modelem macierzy spodziewaliśmy się niepowodzeń i odchyleń w hodowli komórkowej. Dlatego zdecydowaliśmy się na większą liczbę próbek.

2. Badania przepuszczalności w systemie wkładki membranowej

  1. Substancja donora
    UWAGA: Przygotowuje się dwie soli sodowe fluoresceiny (NaFl).
    1. Rozpuścić NaFl w H2O do stężenia 0,1 mg/mL oraz 0,01 mg/mL. Różne dekstrany z izotiocyjanianem fluoresceiny (FD) o masach cząsteczkowych 4000, 10 000, 20 000 i 40 000 g/mol rozpuścić w H2O do stężenia 2 mg/mL. Roztwory te należy wykorzystać jako substancję donora w eksperymentach z przepuszczalnością (patrz Rysunek 1) z użyciem żelu agarozowego.
    2. W przypadku układu z komórkowym modelem kolagenowym wszystkie roztwory należy przygotować w DMEM + 10% FCS zamiast w wodzie.
      UWAGA: Przygotować roztwory zapasowe (o stężeniu 10-krotnie wyższym) substancji donora. Niewielkie różnice w stężeniu donora mogą wpływać na wyniki eksperymentu z przepuszczalnością.
  2. Metoda eksperymentalna
    UWAGA: Eksperyment z przepuszczalnością przeprowadza się w temperaturze 37 °C i wilgotności > 90%. Parametr ten zapewnia żywotność komórek. Temperatura wpływa na proces dyfuzji, dlatego w eksperymentach z żelem agarozowym, żelem kolagenowym i komórkowym modelem kolagenowym stosuje się te same parametry. Informacje o objętości w nawiasach odnoszą się do systemu wkładów membranowych z 12 dołkami.
    1. Przygotować system wkładów membranowych z 96 (lub 12) dołkami z barierą składającą się z żelu agarozowego (patrz Protokół 1.1) lub modelu komórkowego (patrz Protokół 1.2-1.5) oraz fluorescencyjną substancję donora.
    2. Przygotować rozcieńczenia substancji donora w stosunkach 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 i 1:320 w celu sporządzenia krzywej wzorcowej. Do trzech dołków płytki odbiorczej pipetować 300 µL (1846 µL) każdego rozcieńczenia. W przypadku systemu wkładów membranowych z 12 dołkami należy użyć oddzielnej płytki odbiorczej. Rozcieńczenia szeregowe służą do przeliczenia zmierzonej fluorescencji [RFU] na równoważne stężenie [mg/mL].
    3. Dodać 75 µL (590 µL) substancji donora na górę próbki (żelu agarozowego lub modelu komórkowego) oraz 300 µL (1846 µL) substancji akceptora (H2O lub DMEM + 10% FCS) do płytki odbiorczej (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Należy upewnić się, że poziomy cieczy w systemie wkładów membranowych i w płytce odbiorczej są takie same, aby uniknąć ciśnienia hydrostatycznego.
    4. Przenieść cały układ na wytrząsarkę w inkubatorze. Dostosować wytrząsanie tak, aby uzyskać jednorodne mieszanie (całkowita amplituda ruchu to 1,5 mm, prędkość ustawiona na poziom 3,5, co odpowiada obrotom ~ 480 1/min), aby uniknąć gradientu stężeń, który wpływa na proces dyfuzji.
    5. Oznaczać fluorescencję okresowo co godzinę. Aby zmierzyć fluorescencję, przenieść system wkładów membranowych do pustej płytki i zmierzyć fluorescencję w odbiorniku za pomocą czytnika płytek. Dla fluoresceiny zastosować długość fali wzbudzenia 485 nm i emisji 535 nm.
    6. Prowadzić eksperyment przez 5 h.
      UWAGA: Podczas eksperymentów ciecz odparowuje z całego układu. Parowanie zmienia stężenie w donorze i akceptorze i wpływa na wyniki. Efekt ten jest pomijany w przypadku czasu trwania 5 h, lecz przy dłuższych czasach należy go uwzględnić.
  3. Obliczanie współczynnika przepuszczalności
    1. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej należy nanieść fluorescencję rozcieńczeń szeregowych w funkcji stężenia i przeprowadzić regresję liniową danych.
    2. Wykorzystać nachylenie regresji liniowej do przeliczenia danych fluorescencyjnych z eksperymentu z przenikaniem na stężenie. Na potrzeby symulacji jednostki należy przeliczyć na mol/m3.
    3. Nanieść stężenie jako funkcję czasu i wyznaczyć liniowy odcinek danych (patrz Rysunek 2).
    4. Wyznaczyć nachylenie tej części liniowej i obliczyć współczynnik przepuszczalności zgodnie z poniższym równaniem (patrz przykład na Rysunku 2):
      Równanie różniczkowe szybkości transportu masy, wzór pokazujący przepuszczalność, człony stężenia.
      gdzie dcA/ dt to zmiana stężenia substancji po stronie akceptora w czasie (nachylenie); CD to stężenie po stronie donora; P to współczynnik przepuszczalności; A to powierzchnia przenikania, a VA to objętość akceptora. Równanie to zostało wyprowadzone z pierwszego prawa Ficka i może być stosowane tylko wtedy, gdy CD » CA6,22.
    5. UWAGA: Stężenia w donorze muszą być znacznie wyższe niż stężenie wykryte w akceptorze. Zostało to zweryfikowane w układzie eksperymentalnym.

3. Symulacja

UWAGA: Symulację przeprowadzono przy użyciu oprogramowania COMSOL Multiphysics 5.1. Zakłada się podstawową znajomość tego narzędzia. W przypadku symulacji dyfuzji przyjęto następujące założenia: (a) współczynnik dyfuzji substancji w H2O jest znacznie wyższy w porównaniu do współczynnika w żelu. Aby zrekompensować tę różnicę, w symulacji zastosowano wartość 1 x 10-9 m2/s, która jest od 10 do 100 razy wyższa od współczynnika dyfuzji NaFl przez 2% żel agarozowy. (b) w eksperymencie substancja dyfunduje przez barierę, a następnie przez membranę systemu wkładów membranowych. W przeciwieństwie do układu eksperymentalnego, wirtualny żel agarozowy lub macierz komórkowa oraz membrana są traktowane jako jedna homogeniczna faza. (c) efekty brzegowe na ściankach ustawiono jako „no slip” (brak poślizgu); wszystkie efekty poślizgu na ściankach systemu wkładów membranowych (nie między cieczą a żelem lub cieczą a modelem komórkowym) zostały pominięte i nie są istotne dla procesu dyfuzji.

  1. Konfiguracja symulacji dyfuzji
    UWAGA: Niniejsze kroki przedstawiają konfigurację symulacji eksperymentu przenikalności. Symulacje dla systemów wkładów membranowych z 96 oraz 12 dołkami zostały skonfigurowane oddzielnie. Moduł „Chemical Species Transport” wykorzystuje równanie oparte na drugim prawie dyfuzji Ficka:
    Równanie adwekcji-dyfuzji; wzór na pochodną cząstkową; schemat analizy naukowej.
    gdzie c to stężenie substancji, t to czas, u to prędkość, D to współczynnik dyfuzji, a R to szybkość reakcji. Szybkość reakcji pominięto, ponieważ w procesie dyfuzji nie zachodziła żadna reakcja chemiczna.
    1. Otwórz program i rozpocznij tworzenie nowego modelu. Wybierz „Model Wizard”, zaznacz model 3D, z rozwijanego menu dodaj „Transport of Diluted Species” do interfejsu fizycznego, kliknij „Study”, wybierz badanie „Time Dependent” i kliknij „Done”.
    2. Przejdź do sekcji „Global Definitions” i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać „Parameters”. Wprowadź parametry geometryczne i fizyczne do tabeli (zob. Tabela 1, Tabela 2oraz Rycina 3e).
      UWAGA: Wklęsłą powierzchnię żelu agarozowego w systemie wkładki membranowej z 96 dołkami przybliżono za pomocą kuli zanurzeniowej.
    3. Skonfiguruj geometrię systemu wkładów membranowych zastosowanego w eksperymentach. W kroku 3.2 przedstawiono przykład budowania geometrii systemu wkładów membranowych do płytek 96-dołkowych. Jednostkę długości ustawiono na metr.
      UWAGA: Aby skrócić czas obliczeń, nie należy budować pełnej geometrii. Zamiast tego geometrię można zredukować, stosując linie środkowe dla jednej czwartej modelu (patrz Rycina 3a i Rycina 3b).
    4. Dodaj dwie „Sondy domeny” (Domain Probes) w sekcji „Definicje” (kliknij prawym przyciskiem myszy na „Definicje” i znajdź „Sonda”) oraz wybierz jedną sondę jako domenę akceptora, a drugą jako domenę donora. Dla obu wybierz typ „Średnia” (Average) oraz wyrażenie „c” z jednostką „mol/m³”.3".
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i pokazuje stężenie akceptora oraz donora podczas symulacji.
    5. W sekcji „Transport of Diluted Species” w ustawieniach „Transport Properties 1” ustaw współczynnik dyfuzji (Dc) jako „Dif_w”.
      UWAGA: „Transport Properties 1” jest używane zarówno dla domeny akceptora, jak i donora. W następnym kroku domena bariery zostanie nadpisana.
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Transport of Diluted Species”, dodaj drugi węzeł „Transport Properties 2” i w sekcji „Domain Selection” wybierz barierę (2). W zależności od celu symulacji współczynnik dyfuzji można ustawić jako wartość bariery lub jako zmienną pomocniczą „D”. Dla pierwszego uruchomienia testowego ustaw wartość 2E-10 m2/s.2/s.
      UWAGA: „D” zostanie zdefiniowane później w kroku 3.3.
    7. W sekcji „Transport of Diluted Species” dla „Initial Values 1” zdefiniuj stężenie jako zero.
      UWAGA: Wartości początkowe 1 (Initial Values 1) są stosowane dla domeny bariery i domeny akceptora. W następnym kroku domena donora zostanie nadpisana.
    8. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Transport of Diluted Species” i dodaj drugi element „Initial Values 2”, wybierając jako domenę donor (3). Ustaw stężenie jako stężenie początkowe substancji donora (np., C_fl z Tabeli 2).
    9. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Transport of Diluted Species” i dodaj „Symmetry 1”, a następnie w sekcji „Boundary Selection” dodaj i wybierz wszystkie powierzchnie, które stanowią lustrzane odbicie całej geometrii (dla przykładu geometrii w kroku 3.2 są to granice o numerach 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      UWAGA: Ten punkt można pominąć, jeśli cała geometria została już skonfigurowana.
    10. Klikając prawym przyciskiem myszy na „Mesh”, dodaj dwa elementy „Free Tetrahedral”. Wybierz barierę (2) jako domenę (zmień poziom encji geometrycznej na „Domain”). Klikając prawym przyciskiem myszy na „Free Tetrahedral 1”, dodaj „Size” i wybierz zdefiniowaną wcześniej siatkę „Finer” dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami lub „extra Fine” dla systemu wkładów membranowych z 96 dołkami.
    11. W drugim kroku „Free Tetrahedral” wybierz akceptor i donor jako domenę oraz predefiniowaną siatkę „Normal” dla systemu wkładów membranowych z 12 dołkami lub „Finer” dla systemu wkładów membranowych z 96 dołkami (patrz Rycina 3c i Rysunek 3d).
      UWAGA: W celu skrócenia czasu obliczeń można wybrać rzadszą siatkę. Może to jednak obniżyć dokładność wyników. W sekcji „Mesh Setting” kliknij „Build All”, aby wygenerować siatkę dla geometrii.
    12. Uruchom symulację poleceniem „compute” w „Badaniu 1”.
  2. Przykładowa konfiguracja geometrii
    UWAGA: Poniżej przedstawiono przykład konfiguracji geometrii systemu wkładów membranowych z 96 dołkami (z barierą wklęsłą). Wszystkie kroki są wykonywane w module geometrii programu. Jednostka długości została ustawiona na metr.
    1. Wygeneruj cylinder 1 (klikając prawym przyciskiem myszy na „Geometry 1”) o promieniu d_w/2 i wysokości h_sp+h_b+h_a.
    2. Wygeneruj cylinder 2 o promieniu d_tran/2, wysokości h_b+h_a i pozycji z równej h_sp.
    3. Użyj opcji „Difference” (kliknij prawym przyciskiem myszy na „Geometry 1”, przejdź do „Booleans and Partition”), aby odjąć cylinder 2 od cylindra 1. W sekcji „Objects to add” wybierz „cyl1”, aktywuj opcję „Object to subtract” i wybierz „cyl2”. Nowa objętość stanowi geometrię akceptora.
    4. Wygeneruj cylinder 3 o promieniu d_a/2, wysokości h_b i pozycji z równej h_sp.
    5. Wygeneruj sferę 1 o promieniu r i pozycji z r_z.
    6. Użyj opcji „Difference”, aby odjąć sferę 1 (sph1) od cylindra 3 (cyl3). Nowa bryła otrzyma nazwę Difference 2.
    7. Wygeneruj cylinder 4 o promieniu d_a/2, wysokości h_b+h_a i pozycji z równej h_sp.
    8. Użyj opcji „Difference”, aby odjąć cylinder 4 (cyl4) od Difference 2. Nowa bryła stanowi geometrię akceptora.
    9. Powtórz kroki 3.2.4-3.2.6, aby zbudować barierę (żel agarozowy lub model komórkowy w eksperymencie).
    10. Utwórz sumę (union 1) wszystkich elementów geometrii (kliknij prawym przyciskiem myszy na „Geometry 1”, przejdź do „Booleans and Partition”).
    11. Wygeneruj blok 1 ze wszystkimi krawędziami o długości d_tran*2, pozycją x równą -d_tran oraz pozycją y równą d_tran*2.
    12. Wygeneruj blok 2 o długości wszystkich krawędzi d_tran*2, z pozycją x wynoszącą -d_tran*2 oraz pozycją y wynoszącą -d_tran.
    13. Użyj opcji „Difference”, aby odjąć union 1 od bloku 1 i bloku 2.
  3. Dodanie optymalizacji parametrów do symulacji
    UWAGA: Dzięki optymalizacji parametrów współczynnik dyfuzji można dopasować do wcześniej wygenerowanych danych eksperymentalnych. Poniższe instrukcje opisują sposób zintegrowania etapu optymalizacji z symulacją dyfuzji. Przed rozpoczęciem tych kroków należy upewnić się, że symulacja dyfuzji działa prawidłowo.
    1. Dodaj do symulacji moduł fizyczny „Optimization”, korzystając z opcji „Add Physic” (moduł „Optimization” znajduje się w sekcji „Mathematics” w kategorii „Optimization and Sensitivity”). Kliknij „Add to Component”.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy pod sekcją „Definitions” (lokalnie w Komponencie), dodaj „Variables”, a następnie wpisz zmienne z Tabela 3.
      UWAGA: Optymalizacja parametrów wykorzystuje liczby rzeczywiste, t. j., czynnik 1-10 współczynnik dyfuzji musi zostać zdefiniowany oddzielnie.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Definitions” w sekcji „Component Coupling”, dodaj „Average 1”, a następnie wpisz nazwę operatora „Acceptor”.
    4. Wygeneruj oddzielny dokument tekstowy zawierający dane eksperymentalne.
      UWAGA: Kolumny rozdzielone są średnikiem, a wiersze znakiem nowej linii. Czas podano w sekundach, a stężenie w mol/m³3Usuń pierwszy i drugi punkt danych w fazie lag (patrz Rysunek 2) eksperymentów, aby uniknąć możliwych błędów dopasowania. Poniżej przedstawiono przykład, jak może wyglądać taki dokument tekstowy:
      3540;      0.00216
      7140;      0.00724
      12240;    0.01707
      15180;    0.02230
      18660;    0.02697
      21540;    0.02931
      Niniejszy przykład może zostać wykorzystany do przetestowania symulacji.
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Optimization” i dodaj „Global Least-Squares Objective”, dołącz dokument tekstowy z kroku 3.3.4 do sekcji „experimental data”, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na „Global Least-Squares Objective”, aby zdefiniować pierwszą kolumnę jako „Time Column 1”, a drugą kolumnę jako „Value Column 1”. W polu „Expression” dla „Value Column” wpisz zmienną „C”.
    6. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Optimization”, dodaj „Global Control Variables 1” i zdefiniuj „D_search” jako zmienną z wartością początkową „1”, dolną granicą „0” oraz górną granicą „1000”.
    7. Kliknij prawym przyciskiem myszy na „Study 1”, wybierz „Optimization”, a następnie jako metodę solvera optymalizacji wybierz „SNOPT”. Ustaw tolerancję optymalności na 1E-9.
      UWAGA: Jeśli symulacja nie zbiegła się, należy zwiększyć tolerancję optymalności. Należy pamiętać, że zbyt duża tolerancja optymalności spowoduje niedokładność symulacji.
    8. Rozpocznij optymalizację parametrów za pomocą funkcji „compute” w module „study”. Nie zapomnij ustawić współczynnika dyfuzji na barierze jako „D”.

Wyniki

Eksperymenty nad przepuszczalnością w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami z zastosowaniem 2% żelu agarozy jako bariery przeprowadzono w celu oceny dokładności symulacji. Do weryfikacji wpływu wielkości cząsteczkowej substancji dyfundującej w zakresie promienia Stokesa od 5 x 10-10 m do 45 x 10-10 m (masa molowa 376,27-40 000) wykorzystano sól sodową fluoresceiny (NaFl) oraz dekstrany znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FD). W celu dopasowania symulacji do danych eksperymentalnych zastosowano natywną optymalizację parametrów symulacji.

W tym celu nachylenia wyłącznie liniowych części symulowanej przepuszczalności porównano z wynikami eksperymentalnymi. Dla niewielkich rozmiarów cząsteczek dane z symulacji i eksperymentu były ze sobą zgodne w stopniu 99,2% dla NaFl oraz 80,2% dla FD 4,000 (patrz Rysunek 4a oraz Rysunek 4b). Większe rozmiary cząsteczek spowodowały większe odchylenia, wykazując korelacje na poziomie 50,5% dla FD 10,000, 79,7% dla FD 20,000 oraz 53,6% dla FD 40,000. Przebieg krzywych w symulacjach wykazał opóźnienie na początku oraz gwałtowniejszy wzrost w dalszej części wykresów (patrz Rysunek 4c-4e).

Współczynniki przenikalności oraz symulowane współczynniki dyfuzji przedstawiono w Tabeli 4. Współczynnik przenikania maleje wraz ze wzrostem rozmiaru cząsteczki. Odchylenie standardowe wynosiło od 0,08 x 10-8 m/s do 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), co odpowiadało błędowi bezwzględnemu w zakresie od 4,18% do 46,15%. Eksperymenty z większymi cząsteczkami wykazały większy błąd bezwzględny. Symulowane współczynniki dyfuzji zachowywały się bardzo podobnie do eksperymentalnych współczynników przenikalności. Substancje o większych promieniach Stokesa wykazały malejące współczynniki dyfuzji, a błąd bezwzględny mieścił się w granicach od 9,09% do 18,46% (N = 3).

W dodatkowych eksperymentach z przenikania, jako bariery w 12-dołkowym systemie wkładów membranowych, wykorzystano cztery różne typy kolagenowych modeli komórkowych. Modele te obejmują model bezkomórkowy oraz modele komórkowe z różnymi kombinacjami pierwotnych fibroblastów w żelu kolagenowym i komórek HaCaT na powierzchni. Zastosowano następujące kombinacje: kolagen (Col.) jako model bezkomórkowy, kolagen + fibroblasty (Col.+F.), kolagen + HaCaT (Col.+H.) oraz kolagen + fibroblasty + HaCaT (Col.+F.+H.). Jako substancję donora wykorzystano sól sodową fluoresceiny w DMEM + 10% FCS. Do analizy obrazu kolagenowego modelu komórkowego zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Barwienie przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Na Rysunku 5 przedstawiono takie barwienie na reprezentatywnym modelu Col.+F.+H. Barwienie HE lekko barwi strukturę tkankową macierzy kolagenowej. Fibroblasty znajdują się w macierzy, a jądra komórkowe fibroblastów i komórek HaCaT są zabarwione na ciemnofioletowo. Na szczycie macierzy kolagenowej znajduje się warstwa zawierająca wiele jąder, które powinny być jądrami komórek HaCaT, tworzącymi warstwę zamykającą na górze modelu.

W Tabeli 5 przedstawiono eksperymentalne współczynniki przenikania oraz symulowane współczynniki dyfuzji. W większości modeli z HaCaT widoczny jest trend w postaci niższych współczynników przenikania/dyfuzji w porównaniu do modeli bez HaCaT. Błąd bezwzględny współczynników przenikania wynosi 10,9-24,4%, a dla współczynników dyfuzji 5,2%-12,9%.

Schemat przenikania: układ wkładu membranowego z etykietami donora, akceptora, bariery i płytki odbiorczej.
Rysunek 1: Widok z boku eksperymentu przenikalności w systemie wkładu membranowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna, wykres stężenia w funkcji czasu, stan stacjonarny, czas opóźnienia, zmiana szybkości dcA/dt, analiza.
Rycina 2: Przykładowy wykres z eksperymentu nad przepuszczalnością. Przedstawiono zmianę stężenia akceptora w czasie. Dwie linie przerywane wyznaczają prawie liniową część wykresu. Nachylenie tej części liniowej służy do wyznaczenia współczynnika przepuszczalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagramy równowagi statycznej ze strukturami 3D, układ bariery donor-akceptor, modelowanie naukowe.
Rysunek 3: Geometria i siatka systemu wkładów membranowych w symulacji. (a) Geometria systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. (b) Geometria systemu wkładów membranowych z 12 dołkami. (c) Siatka systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. (d) Siatka systemu wkładów membranowych z 12 dołkami. (e) Przekrój poprzeczny i parametry systemu wkładów membranowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres porównujący dane eksperymentalne i symulacyjne stężenia w funkcji czasu, prezentujący wyniki.
Rycina 4: Porównanie danych eksperymentalnych z badania permeacji z zoptymalizowaną symulacją. (a) sól sodowa fluoresceiny, (b) izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran o masie cząsteczkowej 4 000 mol, (c) 10 000 mol, (d) 20 000 mol oraz (e) 40 000 mol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Macierz kolagenowa z fibroblastami i warstwą HaCaT, obraz mikroskopowy do badań nad inżynierią tkankową.
Rycina 5: Reprezentatywne barwienie HE modelu komórkowego w kolagenie (kolagen + fibroblasty + HaCaT). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres współczynnika przepuszczalności w funkcji 1/promienia Stokesa, regresja liniowa, wykres analizy danych.
Rycina 6: Współczynnik przepuszczalności w funkcji 1/promienia Stokesa przy użyciu soli sodowej fluoresceiny i dekstranu z izotiocyjanianem fluoresceiny w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

NazwaWymiary dla systemu 96-dołkowego w mmWymiary systemu 12-dołkowego w mmOpis
Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.5,65 [mm]14,7 [mm]Średnica dołka
d_a4,26 [mm]12,1 [mm]Średnica membrany
d_w8,79 [mm]21,97 [mm]Średnica akceptora
h_b2 [mm]2 [mm]Wysokość bariery
h_sp1 [mm]1 [mm]Odległość między dołkiem a dnem
h_a4,73 [mm]5,24 [mm]Wysokość akceptora
bh_b/2-Głębokość zanurzenia
Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)-Promień kuli zanurzeniowej+
r_zr+h_b-Pozycja z kuli imersyjnej+

Tabela 1: Parametry geometryczne dla symulacji „Chemical Species Transport”.+Wyłącznie do symulacji żelu agarozy w systemie insertów membranowych z 96 dołkami.

NazwaEkspresjaWartośćOpis
C_fl0,1 [mg/ml]/376,28 [g/mol]0,26576 mol/m2Stężenie Fl.So.
C_42 [mg/ml]/4000 [g/mol]0,5 mol/m2Stężenie FD 4,000
C_102 [mg/ml]/10000 [g/mol]0,2 mol/m2Stężenie FD 10.000
C_202 [mg/ml]/20000 [g/mol]0,1 mol/m2Stężenie FD 20.000
C_402 [mg/ml]/40000 [g/mol]0,05 mol/m2Stężenie FD 40.000
Dif_w1e-9 [m^2/s]1E-9m2/sWspółczynnik dyfuzji podczas mieszania wody

Tabela 2: Parametry fizyczne dla symulacji „Transportu gatunków chemicznych”.

NazwaWyrażenieOpis
CAcceptor(c)Definicja stężenia akceptora
DD_search*1e-10Współczynnik zmiany dla D

Tabela 3: Parametry symulacji „Optymalizacja”.

PermeatWspółczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10Promień Stokesa permeatu (m)x10-10
Fl.So.4.79 ± 0.201.94 ± 0.345
FD 4,0002.37 ± 0.310.65 ± 0.1214
FD10,0001.67 ± 0.470.22 ± 0.0223
FD 20 0000.65 ± 0.300.29 ± 0.0433
FD 40 0000.27 ± 0.080.14 ± 0.0245

Tabela 4: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji substancji o różnym promieniu Stokesa przez żel agarozowy 2% + membranę w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami. (fluorescein sodium salt = Fl. So., fitc dextran = FD).

ModelWspółczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10
Kol.2.18 ± 0.291.22 ± 0.06
Col.+F.1.77 ± 0.380.93 ± 0.12
Col.+H.1.64 ± 0.400.96 ± 0.05
Kol.+F.+H.1.65 ± 0.180.88 ± 0.11

Tabela 5: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji soli sodowej fluoresceiny przez kolagenowy model komórkowy w 12-dołkowym systemie wkładów membranowych (Col. = kolagen, F. = fibroblast, H. = HaCaT).

Dyskusja

Badanie to dokumentuje metodę opracowaną w celu ilościowego określenia przenikania przez konstrukt tkankowy skonstruowany na membranie. Najpierw zbadano przenikanie substancji o różnych rozmiarach molekularnych przez żel agarozowy w celu przetestowania i walidacji metody oraz odpowiedniej symulacji. Powszechnie wiadomo, że mniejsze cząsteczki przenikają szybciej przez siatkę matrycy (z wyjątkiem efektu filtracji żelowej za pomocą chromatografii przepuszczalności). Podobne obserwacje poczyniono w eksperymentach z wykluczeniem wielkości substancji przez twardówkę26, ludzką błonę naskórkową27, ludzką skórę17 i skórę szczura28. Wykazano odwrotną korelację między współczynnikami przepuszczalności a odpowiadającym im promieniem Stokesa (promień twardej kuli, która porusza się z taką samą szybkością dyfuzji jak opisywane cząsteczki, zwykle mniejszą niż efektywny promień cząsteczki) wykazano26,28, a podobną zależność zaobserwowano w eksperymentach z substancjami o różnych rozmiarach cząsteczek. Wykreślając współczynniki przepuszczalności w promieniu 1/Stokesa, stwierdzono korelację liniową między czterema grupami o najmniejszym rozmiarze cząsteczki (R2 = 0,93) (ryc. 6). Oznacza to, że symulowane współczynniki przepuszczalności przy sugerowanej metodzie mieszczą się w realistycznym zakresie.

Błąd wynoszący 46,15% w eksperymentach jest nieco większy niż podany w eksperymentach z przepuszczalnością z systemem komórek dyfuzyjnychFranza 10. Jednym z możliwych wyjaśnień może być rozkład wielkości fluoresceiny-izotiocyjanianu-dekstranu, który zostanie omówiony później.

Opisana metoda ma istotne zalety w porównaniu z metodami wykorzystującymi system komórek dyfuzyjnych Franza. Po pierwsze, konfiguracja jest bardziej kompaktowa; Eksperymenty są wykonywane bezpośrednio w systemie wkładek membranowych, który ma skalę komercyjnej płytki studziennej (∼ 13 cm x 8,5 cm). Umożliwia to jednoczesne badanie wielu próbek, podczas gdy do każdej próbki potrzebna jest oddzielna komórka dyfuzyjna Franza. Po drugie, przepuszczalność modelu skóry można zmierzyć bezpośrednio we wkładzie membranowym, w którym odbywa się uprawa. W przypadku komór dyfuzyjnych Franza próbki muszą być wyjmowane i montowane w systemie, co jest bardziej kłopotliwe w przypadku małych próbek, a także bardziej czasochłonne.

Eksperymenty z przenikaniem matryc komórek kolagenowych wykazały, że metoda ta może być z powodzeniem stosowana w systemach komórkowych. Prezentowany tutaj model został zweryfikowany pod kątem modeli skóry; Metodę tę można jednak zastosować do innych rodzajów organicznych hodowli komórkowych, np. nerek lub wątroby.

W tym badaniu wykorzystano model komórki kolagenowej, w którym komórki HaCaT całkowicie pokryły powierzchnię modelu (patrz ryc. 5). Doprowadziło to do obniżenia współczynnika przepuszczalności, co pokazuje, że metoda jest wystarczająco czuła, aby rozróżnić współczynnik przepuszczalności między modelem kolagenowo-komórkowym z warstwą HaCaT i bez niej. Idealnie byłoby, gdyby model skóry budował barierę, która zbliża się do naskórka prawdziwej skóry29, dlatego ważne jest, aby zweryfikować jakość (np. budowę skóry właściwej, naskórek) modelu skóry przed faktycznym użyciem. Rozwój modelu skóry można zwizualizować za pomocą technik barwienia i określić ilościowo na podstawie wykrycia białka skóry i kolagenu 30,31,32. Współczynnik przepuszczalności może być również ważnym czynnikiem oceny rozwoju modelu skóry, ale potrzebne są dalsze eksperymenty, aby to potwierdzić. Jak wcześniej wspomniano, metoda ta umożliwia równoległe uruchamianie wielu próbek. Możliwe jest również pobranie próbek podczas uprawy w celu zmierzenia przepuszczalności, a tym samym obserwowanie rozwoju tego parametru modelu skóry.

Należy zauważyć, że przepuszczalność jest mierzona jednocześnie za pomocą modelu żelowo-kolagenowo-komórkowego i membrany. Wykryty współczynnik przepuszczalności jest specyficzny dla systemu, przy czym wyniki różnych modeli skóry można porównać tylko w przypadku stosowania tej samej wkładki membranowej. Ponadto model skóry musi pokrywać cały obszar uprawy, aby zapewnić, że substancja badana będzie przenikać tylko przez model, a nie w jego sąsiedztwie, co spowodowałoby błędy w mierzonej przepuszczalności. Kolejnym aspektem, który powinien być brany pod uwagę w przyszłych eksperymentach, jest naturalne środowisko otaczające skórę. Zwykle temperatura powierzchni skóry jest niższa w porównaniu z obszarem wewnętrznym, co może wpływać na warunki przenikania.

W celu dopasowania eksperymentów laboratoryjnych do symulacji komputerowych zaprezentowano metodę umożliwiającą optymalizację parametrów dla symulacji stosowanej. Stwierdzono, że symulacje są dobrze zbieżne z danymi eksperymentalnymi dotyczącymi substancji o małych rozmiarach cząsteczkowych. Zaobserwowano jednak rozbieżności między danymi symulacyjnymi a eksperymentalnymi w przypadku substancji o większych rozmiarach cząsteczkowych. Duże cząsteczki polisacharydów mogą zwiększać tarcie i spowalniać proces dyfuzji w żelu. Efekt ten powoduje nieprawidłową dyfuzję, która jest możliwą przyczyną odchylenia między wartościami eksperymentalnymi i symulacyjnymi33,34. Innym wyjaśnieniem może być obecność mniejszych lub większych cząstek w dekstranie fluoresceiny-izotiocyjanianu. Producent określa masę cząsteczkową substancji jako średnią wielkość o danym zakresie, co pozwala na obecność mniejszych i większych cząstek. Nie jest również jasne, jak rozproszone są te substancje, ponieważ mniejsze cząsteczki szybciej przenikają przez żel i kanał płynu. Możliwe jest rozszerzenie symulacji w celu uwzględnienia tych efektów dyfuzji i tarcia.

Eksperyment i symulacja przepuszczalności zostały opracowane do użytku w 2-OC. Za pomocą symulacji tę eksperymentalną metodę można bezpośrednio przenieść do bardziej wyrafinowanych konfiguracji eksperymentalnych. Na przykład, symulację systemu wkładek membranowych można łatwo przenieść na geometrię 2-OC lub do innych systemów o podobnych konfiguracjach. Ta opcja modulacji symulacji może być wykorzystana do wsparcia projektowania przyszłych eksperymentów. Ponadto efekty uboczne, takie jak parowanie, nieprawidłowa dyfuzja i efekty membranowe, można zintegrować w celu ulepszenia symulacji, poprawiając w ten sposób dokładność. Program symulacyjny daje możliwość zmiany lub ulepszenia równania symulacyjnego, a także zintegrowania innych modułów fizycznych w celu zbadania innych aspektów rozwoju modelu skóry. Jednym z przykładów jest symulacja zużycia glukozy i produkcji mleczanu w modelu komórki kolagenowej.

Szczególnie interesującym aspektem w testowaniu substancji medycznych jest sposób, w jaki substancje te są rozprowadzane w systemie narządów na chipie. Parametr symulacji i przepuszczalności pomaga odpowiedzieć na pytania, takie jak szybkość przenikania substancji do układu, a także jakie stężenie będzie dostępne dla innych tkanek w wielonarządowym chipie. Metoda ta może wspierać i usprawniać rozwój i testowanie takich systemów typu organ-on-chip.

Oświadczenia

Uwe Marx jest dyrektorem generalnym i udziałowcem, a Gerd Lindner jest udziałowcem TissUse GmbH, firmy produkującej i komercjalizującej technologię MOC. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Podziękowania

Ta praca została stworzona dzięki wsparciu finansowemu Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantu nr. PO413/12-1 oraz LA 1028/7-1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaCarl RothK297.2Kolagen w proszku o wysokiej rozdzielczości
Serva47256.01Roztwór kolagenu R 0,4
DMEMLonza (Biozym Scientific GmbH)880010-12Wysoka glukoza z L-glutaminą
FCSBiochrom GmbHS0615 0114FSurowica cielęca płodu
Sól sodowa fluoresceinySigma-Aldrich46960-25G-F
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-Aldrich46944-500MG4000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD10S-250MG10 000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD20S-250MG20 000 g/mol
Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstranSigma-AldrichFD40S-250MG40 000 g/mol
HBSSThermoFisher Scientific14170120bez wapnia, bez magnezu, z czerwienią fenolową
NaOHMerck1.06467.9010granulowany
PBSGibco18912-014tabletki
Transwell Cell Culture InsertsCorning339196 studzienka, 0,4 i mikro; m wielkość
porów Wkładki do hodowli komórkowych TranswellCorning (VWR)734-156312 dołków, 0,4 i mikro; m wielkość porów
TrypsynaBiochrom GmbHL2143z EDTA
%

Bibliografia

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie przepuszczalnościwspółczynnik dyfuzjitrójwymiarowy model tkankowyżel agarozowyżel kolagenowykomórkowy model kolagenowypomiar fluorescencjioptymalizacja symulacji
Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.