Artykuł metodologiczny

Nowatorskie podejście do przezwyciężania artefaktów ruchowych przy użyciu laserowego systemu obrazowania z kontrastem plamkowym do zmiany prędkości mikrokrążenia krwi

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56415

⸱

30 sierpnia 2017

 ,  , 
1Orthopaedic Research Institute, Bournemouth University

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie wprowadza nowatorską technikę pomiaru i analizy zmiennych prędkości mikrokrążenia krwi w jednym eksperymencie przy użyciu laserowego obrazowania kontrastowego plamek.

Streszczenie

Laserowy obrazowanie kontrastu plamek (LSCI) dostarcza potężnej, ale prostej techniki pomiaru przepływu krwi w mikrokrążeniu. Idealny do dynamicznych reakcji krwi, LSCI jest używany w taki sam sposób, jak konwencjonalny laserowy obrazowanie dopplerowskie (LDI). Jednak przy maksymalnej głębokości skóry wynoszącej około 1 mm, LSCI został zaprojektowany tak, aby koncentrować się głównie na powierzchownym przepływie krwi. Służy do pomiaru powierzchni skóry o wymiarach do 15 cm x 20 cm. Nowa technika przedstawiona w tym artykule uwzględnia zmienne prędkości mikrokrążenia; tj. pomiar strumienia przepływu zarówno wolnego, jak i szybkiego za pomocą LSCI. Nowatorska technika przezwycięża również największą wadę LSCI, jaką jest wysoka wrażliwość na ruch artefaktów. W celu zadowalającego zapisu przepływu krwi w mikrokrążeniu wprowadza się adhezyjny nieprzezroczysty plaster (AOP) poprzez odjęcie sygnału LSCI od AOP od sygnału laserowej plamki skórnej. Optymalne ustawienie jest również określone, ponieważ LSCI jest najsilniejszy, gdy zmiany strumienia są mierzone w stosunku do referencyjnej linii podstawowej, przy czym strumień mikrokrążenia krwi jest wyrażony jako procentowa zmiana w stosunku do linii podstawowej. Zmiany te mogą być wykorzystane do analizy stanu układu przepływu krwi.

Wprowadzenie

Laserowe obrazowanie kontrastowe (LSCI) to sprawdzona, bezkontaktowa metoda monitorowania w czasie rzeczywistym do analizy mikrokrążenia przepływu krwi1,2,3,4,5,6,7. LSCI użyty w tym artykule to moorFLPI Full Field. Pomiar perfuzji przepływu krwi na dużych obszarach w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej za pomocą zjawiska zwanego "plamką laserową" jest jedną z głównych zalet tego urządzenia6. Ocena mikrokrążenia w czasie rzeczywistym odbywa się za pomocą zarejestrowanych wzorców za pomocą kamery przy użyciu rozproszonych wzorów plamek. Biorąc pod uwagę, że moorFLPI LSCI jest przeznaczony do badań klinicznych i fizjologicznych, oprogramowanie do przetwarzania obrazu działa w oparciu o fakt, że wysoka perfuzja powoduje szybką zmianę wzoru plamek lasera, który jest następnie integrowany przez urządzenie sprzężone z ładunkiem (CCD) w celu wytworzenia obszaru o niskim kontraście8. Kontrast jest określany ilościowo, a wynikowy strumień jest kodowany kolorami w celu uzyskania obrazu perfuzyjnego8.

Niestety, LSCI jest bardzo wrażliwy na wibracje otoczenia, artefakty i ruchy obszaru tematycznego9. Do tej pory stanowiło to wyzwanie podczas badania zmiennych stanów przepływu. Ten artykuł wyjaśnia szczegóły jawnej techniki opisanej w niedawnym badaniu10, w którym zastosowano urządzenie do elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej do pomiaru mikrokrążenia krwi podczas ruchu badanej kończyny.

Protokół

Opisana metoda została wykorzystana w badaniu, które otrzymało etyczną zgodę Komitetu Etyki Badań Uniwersytetu w Bournemouth 9 lutego 2016 r. (Nr ref. 10571).

1. Konfiguracja LSCI

  1. Podłącz tylny panel moorFLPI LSCI do jego trzech gniazd (zasilacz, uniwersalna magistrala szeregowa (USB) i IEEE1394), aby system działał.
  2. Zamontuj ramię podporowe pulpitu za pomocą 4 z moorFLPI LSCI odwróconym do góry nogami i przymocowanym do ramienia nośnego.
  3. Obróć wspornik montażowy, aby obrazować w dół po zamocowaniu.
    UWAGA: LSCI ma trzy elementy sterujące: (1) regulator powiększenia – gdy imager jest ustawiony w pozycji, mniejsze powiększenie można dostosować do maksymalnych i minimalnych ustawień odpowiednio dla małych i większych pól widzenia. Aby zapewnić powtarzalność, dostarczana jest etykieta z pierścieniem indeksującym; (2) Regulator ostrości – zależy to od odległości pomiaru i należy go wyregulować po ustawieniu pozycji obrazu. Aby zapewnić powtarzalność, dostarczana jest etykieta z pierścieniem indeksującym; oraz (3) polaryzator - dostępny jest liniowy filtr polaryzacyjny, aby zminimalizować odbicia zwierciadlane od odsłoniętych narządów - obrotowy uchwyt można obracać o 360°.
  4. Zainstaluj oprogramowanie, aby sterować kamerą. Oprogramowanie jest podzielone na dwa moduły zapewniające funkcję pomiaru i przeglądu.

2. Przygotowanie uczestników

  1. Upewnij się, że ocena jest przeprowadzana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 ± 1 °C) i że uczestnicy siedzą przez 10 minut przed badaniem, aby dostosować się do temperatury pokojowej.
  2. Unikaj silnego źródła sztucznego światła i światła słonecznego padającego na uczestnika lub LSCI, ponieważ światło otoczenia może wpływać na źródło lasera w bliskiej podczerwieni moorFLPI działające przy 785 nm.
    UWAGA: Prostym testem potwierdzającym, czy poziom światła otoczenia jest dopuszczalny, jest otwarcie okna ustawień obrazowania i zablokowanie lasera. Jeśli obraz jest prawie całkowicie, nie są wymagane żadne dalsze kroki; Jeśli nadal jest zbyt dużo światła otoczenia, konieczne są dalsze działania.
  3. Upewnij się, że uczestnicy są zrelaksowani przez cały czas trwania oceny, ze stopami płasko na ziemi, jeśli siedzą, i unikaj rozmów.
  4. Umieść 8cm2 nieprzezroczystego plastra samoprzylepnego (AOP) (np. Leukotape) na obszarze skóry, aby zamaskować przepływ krwi. Ma to na celu uwzględnienie wady LSCI pod względem wysokiej wrażliwości na ruch artefaktów, a rozproszenie zwrotne sygnału zostanie wykorzystane do pomiaru mikrokrążącego przepływu krwi.

3. Pomiar obrazu mikrokrążenia

  1. Wybierz opcję "Przetwarzanie przestrzenne" dla przechwytywania 25 klatek na sekundę w rozdzielczości 152 x 113 pikseli.
  2. Wybierz "Pomiar obrazu na żywo" i dostosuj pozycję kamery w odległości 20 cm od uczestnika, a następnie dostosuj zoom, ostrość i polaryzator, aby zminimalizować odbicia lustrzane. Obraz powinien wydawać się dość "płaski" i pozbawiony funkcji.
  3. Ustaw czas naświetlania 20 ms, aby uzyskać wysoką czułość na małe zmiany i niski strumień.
  4. Użyj częstotliwości wyświetlania 25 Hz i stałej czasowej 0,3 s, aby uwzględnić szybkie zmiany przepływu krwi i uzyskać optymalny kontrast poprzez redukcję szumów obrazu.
  5. Utwórz dwa obszary zainteresowania (ROI) o równym rozmiarze (2 cm2) o nazwach ROI 1 i ROI 2. Wyrównaj ROI 2 tak, aby mieścił się w AOP 8 cm2. Uważaj, aby ROI nie były wymienne, ale utrzymywane blisko w odległości 2-4 cm, aby zmniejszyć potrzebę ponownego centrowania, jeśli jakikolwiek ruch mechaniczny spowoduje, że ROI 2 nie będzie już w obszarze AO.
    UWAGA: Pomiar przepływu krwi będzie mniej dokładny w obszarach o niskiej i wysokiej intensywności, dlatego ważne jest, aby mieć optymalne ustawienie wzmocnienia. Wartość wzmocnienia mieści się w zakresie od 0 do 200. Optymalna wartość ustawienia wzmocnienia jest osiągana w zakresie 70 - 80.
  6. Wykonaj pomiary strumienia w stosunku do referencyjnej linii bazowej. W przypadku tej metodyki należy wprowadzić etap "reszty" jako punkt odniesienia. Dlatego wyraź "szybki" i "wolny" przepływ krwi jako procentową zmianę w stosunku do wyjściowego etapu "spoczynku".
  7. Nagrywaj pomiar przepływu krwi w formacie wideo i zapisuj do analizy offline za pomocą modułu przeglądu obrazu.

4. Analiza offline

UWAGA: Oprogramowanie moorFLPI Image Review pozwala na otwarcie filmu w celu przeprowadzenia analizy.

  1. Oblicz średni strumień w ROI po serii zapisów średniego przepływu krwi. ROI 1 to rzeczywisty pomiar przepływu krwi w skórze, a ROI 2 to wstecznie rozproszony sygnał laserowy plamki skóry z AOP.
  2. Oblicz średni przepływ krwi, odejmując ROI 2 od ROI 1 (przepływ krwi w skórze).
    ROI 1 - ROI 2 = średni przepływ krwi

Wyniki

Układ eksperymentalny LSCI przedstawiono na Rysunku 1 wraz z opisem funkcjonalnych narzędzi. Zilustrowano typowe przygotowanie uczestnika do pomiaru przepływu krwi w obszarze przedniej części uda. Regulowany uchwyt montażowy umożliwia rotację urządzenia LSCI w celu pomiaru przepływu krwi w mikro naczyniach dowolnego, wybranego obszaru skóry. Rysunek 2 przedstawia przykład typowego surowego obrazu plamek (speckle image) oraz przetworzonego obrazu plamek z zastosowaniem niestandardowych ustawień opisanych w protokole pomiaru mikrokrążenia krwi.

Rysunek 3 przedstawia przykład obszaru skóry i rozmieszczenia AOP (krok 3.1), konfigurację obrazowania surowego LSCI (krok 3.2), obraz na żywo dla powolnego przepływu krwi (krok 3.3) oraz obraz na żywo dla szybkiego przepływu krwi (krok 3.4), uzyskane podczas ciągłego zapisu danych zmiennego strumienia przy użyciu moorFLPI LSCI. Ustawienie kodowania kolorami palety pozwala na rozróżnienie poziomów strumienia. Przy standardowej palecie 16 kolorów niski strumień jest widoczny jako niebieski, średnie wartości strumienia jako zielone, a wysokie wartości strumienia jako pomarańczowe i czerwone.

Przepływ krwi przez skórę jest wyrażony w jednostkach perfuzji laserowego obrazowania przepływu (LSPU). Rysunek 4 przedstawia graficzną reprezentację ROI 1, ROI 2 oraz AOP na obszarze skóry. Średni przepływ krwi jest obliczany podczas analizy offline z wykorzystaniem danych z ROI 1 i ROI 2 oraz równania (1).

Konfiguracja LSCI do obrazowania przepływu krwi w skórze z wykorzystaniem laptopa, kamery, polaryzatora i regulowanego uchwytu.
Rysunek 1: Układ eksperymentalny LSCI z wykorzystaniem moorFLPI. Ramię wspierające do ustawienia na biurku, wyjścia dla kabli, pokrętła regulacyjne (regulacja zoomu, regulacja ostrości i polaryzator), AOP oraz laptop do konfiguracji ustawień obrazu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie fluorescencyjne absorpcji z plastra transdermalnego przez skórę; metoda analizy optycznej.
Rysunek 2: Surowy obraz plamek przed rejestracją danych. 2.1 – 2.2) Obrazy strumienia i surowego ziarna przy błędnej konfiguracji ustawień, skutkujące wysokim wzmocnieniem i słabą widocznością, co prowadzi do mniej dokładnego pomiaru przepływu krwi. 2.3 – 2.4) System skonfigurowany zgodnie z protokołem, co zapewnia prawidłowe wzmocnienie i maksymalną widoczność, umożliwiając uzyskanie wiarygodnego wyniku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obrazowanie hiperspektralne skóry z plastrem do analizy chemicznej, przedstawiające mapy spektralne i surowe dane.
Rysunek 3: Przegląd konfiguracji i pomiaru zapisu z wykorzystaniem moorFLPI LSCI. 3.1. Obszar skóry (udo) o wielkości 2 cm2 AOP w celu uwzględnienia ruchu artefaktów. 3.2) Surowy obraz „płaski i bezcechowy” z plamkami (speckle), wskazujący na dobrą intensywność światła rozproszonego przy optymalnych ustawieniach. 3.3) Nagranie obrazu na żywo z wolnego przepływu krwi. 3.4) Nagranie obrazu na żywo z szybkiego przepływu krwi. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Analiza fluorescencji, schemat ROI, układ spektroskopowy, badanie wzbudzenia i emisji optycznej.
Rysunek 4: Graficzne przedstawienie rozmieszczenia ROI 1, ROI 2 oraz AOP na obszarze skóry. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Spoczynek (Referencja Bazowa) (LSPU)Wolny przepływ krwi (LSPU)Umiarkowany przepływ krwi (LSPU)Szybki przepływ krwi (LSPU)
Średni strumień - ROI 1Średni strumień - ROI 2Średni przepływ krwiŚredni strumień - ROI 1Średni strumień - ROI 2Średni przepływ krwi% wzrostu przepływu krwi względem bazyŚredni strumień - ROI 1Średni strumień - ROI 2Średni przepływ krwi% wzrostu przepływu krwi względem bazyŚredni strumień - ROI 1Średni strumień - ROI 2Średni przepływ krwi% wzrostu przepływu krwi względem bazy
157.935.112.8178.541.6136.910.9216.94.6172.33.5418.97.5341.494.2

Tabela 1: Średni strumień w LSPU dla ROI 1 i ROI 2 w stanie wyjściowym oraz przy wolnym, umiarkowanym i szybkim przepływie krwi.Wzrost przepływu krwi wyrażono jako procentową zmianę względem etapu wyjściowego.

Analiza strumienia, kolorystyczna mapa ciepła i zdjęcie w skali szarości; wizualizacja danych, obrazowanie eksperymentalne.
Rysunek 5: Przykład rozmieszczenia ROI 1 i ROI 2 na obszarze powierzchni skóry (udo). 16-kolorowa paleta opisuje warstwy perfuzji. Dane dla obszaru ROI 1 i ROI 2 są rejestrowane w jednostkach perfuzji i odejmowane zgodnie z równaniem 1 w celu pomiaru mikrokrążenia krwi. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Celem pracy było wprowadzenie nowatorskiej techniki pomiaru i analizy zmiennych prędkości mikrokrążenia krwi w pojedynczym eksperymencie z wykorzystaniem LSCI. Na pomiary może mieć wpływ światło otoczenia, wibracje i ruchy uczestników, w tym oddychanie i drgawki. Wszystkie kroki opisane w protokole zostały zaprojektowane w celu zminimalizowania tych skutków i uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych pomiarów mikrokrążenia krwi.

Podkreśla się, że każdy krok w ramach protokołu ma kluczowe znaczenie dla dokładnego pomiaru mikrokrążenia krwi, wprowadzona technika została odkryta po sekwencyjnych testach wszystkich możliwych opcji ustawień i dostępnych kombinacji, w tym: stałej czasowej, ustawienia zoomu, czasu ekspozycji, szybkości wyświetlania, wzmocnienia i palety strumienia obrazu. Wyniki zostały przeanalizowane i powtórzone przy użyciu wyświetlania wideo na żywo i analizy offline, aby znaleźć optymalną konfigurację obrazowania. Było to niezbędne, ponieważ oprogramowanie do przetwarzania obrazu wykorzystuje fakt, że wysoka perfuzja powoduje szybką zmianę wzoru plamek laserowych, w wyniku czego na obrazie wideo powstaje obszar o niskim kontraście i dobrze zdefiniowanej plamce. Następnie tworzony jest obraz perfuzji w postaci oznaczonej kolorami mapy perfuzji mikrokrążenia.

Stwierdzono, że niezbędne jest przygotowanie obszaru doświadczalnego i uczestnictwa, które można kontrolować, unikając pracy w pobliżu źródeł światła dziennego (okna) lub silnych źródeł sztucznego światła, ponieważ mogą one zakłócać działanie wrzosowiska FLPI w pobliżu źródła lasera w podczerwieni. W protokole wprowadzono również AOP, ponieważ uznano, że wibracje otoczenia i ruch uczestnika generują sygnały, które są nie do odróżnienia od przepływu krwi. AOP okazał się prostym, ale skutecznym wyborem, oferując cienką, ale nieprzezroczystą, lekką i dostępną opcję, która miała mikroskopijnie szorstką powierzchnię, aby uniknąć znacznego odbicia zwierciadlanego. Wstępne badania przeprowadzone przez Omarjee i wsp.11 zwraca uwagę na potencjalne ograniczenie, dzięki któremu Leukotape wytwarza sygnał odbicia o innej amplitudzie niż amplituda skóry i różni się znacznie w zależności od osoby; jednak Mahe i wsp.1 nie znalazł drastycznej różnicy między uczestnikami. Chociaż taśma Leukotape jest bardziej dostępna niż inne dwuwarstwowe plastry samoprzylepne, dokładność pomiaru w równaniu (1) można zwiększyć, stosując alternatywny AOP.

W sekcji analizy offline podkreślono znaczenie wielkości ROI i ich lokalizacji w obszarze zainteresowania. Początkowo próbowano większego ROI 1, około 8 cm2, który nałożył się na ROI 2. Ta metodologia wkrótce stała się zawodna ze względu na ruch artefaktów, który powodował ruch ROI 2 i eksperyment na żywo musiał zostać zatrzymany w celu ponownego wyśrodkowania ROI 2. Kolejnym niedociągnięciem było to, że ze względu na nakładanie się ROI 1 na AOP, średni strumień nie uwzględniał już obszaru objętego AOP, ponieważ nie było już sygnału rozproszonego wstecznie. Oznaczało to, że duża część mikrokrążenia krwi była pomijana, a zatem uzyskane dane dotyczące strumienia nie były prawidłowe. Dlatego metodologia, w której dwa ROI wynoszą 2 cm2, z AOP 8 cm2 i brakiem interakcji między ROI 1 i ROI 2 (ale utrzymywane w odległości 2-4 cm od siebie), zapewnia wiarygodną i powtarzalną technikę analizy do pomiaru mikrokrążenia krwi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
moorFLPI LSCIMoor InstrumentsNiedostępne - Link online Podany w opisiemoorFLPI to instrument przeznaczony do pomiaru przepływu krwi w mikrokrążeniu za pomocą analizy kontrastu plamek lasera podczerwonego.  https://gb.moor.co.uk/
moorFLPI Moduł przeglądu obrazówInstrumenty Moornie są dostępne - Link online dostarczonyUżywany z moorFLPI, użytkownik może rejestrować i mierzyć zmiany w przepływie krwi, zmieniając kolorową mapę perfuzji tkanek.  https://gb.moor.co.uk/
LeukotapeBSN Medical72978-10Taśma medyczna z mikroporowatą powierzchnią. http://www.bsnmedical.co.uk/fileadmin/z-countries/United_Kingdom/PDF/L/Leukotape_K_A46PP_low_res_11112013.pdf

Bibliografia

  1. Mahe, G., Rousseau, P., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Laser speckle contract imaging accurately measures blood flow over moving skin surfaces. Microvas Res. 81 (2), 183-188 (2010).
  2. Rousseau, P., et al. Increasing the "region of interest" and "time of interest", both reduce the variability of blood flow measurements using laser speckle contrast imaging. Microvas Res. 82, 88-91 (2011).
  3. Hecht, N., Woitzik, J., Dreier, J., Vajkoczy, P. Intraoperative monitoring of cerebral blood flow by laser speckle contrast analysis. Neurosurg Focus. 27 (4), 1-6 (2009).
  4. Mahe, G., Durand, S., Humeau-Heurtier, A., Leftheriotis, G., Abrham, P. Impact of experimental conditions on noncontact laser recordings in microvascular studies. Microcirculation. 19 (8), 669-675 (2012).
  5. Cheng, H., Duong, T. Q. Simplified laser-speckle-imaging analysis method and its application to retinal blood flow imaging. Opt Lett. 32 (15), 2188-2190 (2007).
  6. Doherty, J., McNamara, P., Clancy, N. T., Enfield, J. G., Leahy, M. J. Comparison of instruments for investigation of microcirculatory blood flow and red blood cell concentration. J Biomed Opt. 14 (3), 034025(2009).
  7. Briers, D. J. Laser speckle contrast imaging for measuring blood flow. Opt Appl. 37 (1), 139-152 (2007).
  8. moorFLPI User Manual. (8), Moor Instrument Limited. Devon, UK. (2012).
  9. Mahe, G., Durand, S., Humeau-Heurtier, A., Abraham, P. Impact of Experimental Conditions on Noncontact Laser Recordings in Microvascular Studies. Microcirculation. 19, 669-675 (2012).
  10. Bahadori, S., Immins, T., Wainwright, T. The effect of calf neuromuscular electrical stimulation and intermittent pneumatic compression on thigh microcirculation. Micro Res. 111, 37-41 (2017).
  11. Omarjee, L., et al. Optimisation of movement detection and artifact removal during laser speckle contrast imaging. Miscrovas Res. 97 (1), 75-80 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Korekcja artefakt w ruchowychpomiar mikrokr enia krwinieprzezroczysty plaster przylepnyanaliza bazowa przep ywusystem MoorFLPI LSCIzmienne pr dko ci przep ywumonitorowanie przep ywu krwi w sk rzeodejmowanie sygna u z ROImetoda referencyjnej linii bazowej

Powiązane artykuły