Artykuł metodologiczny

Synteza nanokryształów konwersji w górę domieszkowanych lantanowców w otoczce do zastosowań komórkowych

DOI:

10.3791/56416

⸱

10 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical & Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 2Institute of Materials Research & Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół syntezy nanokryształów (UCN) domieszkowanych lantanowców w skorupie rdzenia i ich komórkowych zastosowań do regulacji białek kanałowych przy oświetleniu światłem bliskiej podczerwieni (NIR).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanokryształy (UCN) domieszkowane lantanowców przyciągnęły wiele uwagi w ostatnich latach ze względu na ich obiecujące i kontrolowane właściwości optyczne, które pozwalają na absorpcję światła bliskiej podczerwieni (NIR) i mogą następnie przekształcić je w multipleksowane emisje, które obejmują szeroki zakres obszarów od UV do widzialnego do NIR. W artykule przedstawiono szczegółowe procedury eksperymentalne wysokotemperaturowej syntezy współstrącania UCN typu core-shell, które wprowadzają różne jony lantanowców do nanokryształów w celu efektywnego przekształcania wzbudzenia NIR przenikającego głęboko w tkanki (808 nm) w silną emisję niebieską przy 480 nm. Kontrolując modyfikację powierzchni za pomocą biokompatybilnego polimeru (kwas poliakrylowy, PAA), tak przygotowane UCN uzyskuje doskonałą rozpuszczalność w roztworach buforowych. Hydrofilowe nanokryształy są dalej funkcjonalizowane specyficznymi ligandami (dibenzylcyklooktyn, DBCO) w celu lokalizacji na błonie komórkowej. Po napromieniowaniu światłem NIR (808 nm) emisja niebieskiego w górę może skutecznie aktywować białko kanału bramkowanego światłem na błonie komórkowej i specyficznie regulować napływ kationów (np. Ca2 +) do cytoplazmy. Protokół ten zapewnia wykonalną metodologię syntezy UCN domieszkowanych lantanowców typu core-shell, a następnie biokompatybilnej modyfikacji powierzchni do dalszych zastosowań komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach, nanokryształy domieszkowane lantanowców (UCNs) były szeroko stosowane jako alternatywa dla konwencjonalnych barwników organicznych i kropek kwantowych w zastosowaniach biomedycznych, które opierają się głównie na ich wyjątkowych właściwościach chemicznych i optycznych, w tym doskonałej biokompatybilności, wysokiej odporności na fotowybielanie i emisji o wąskim paśmie1,2,3. Co ważniejsze, mogą służyć jako obiecujący nanoprzetwornik o doskonałej głębokości penetracji tkanek in vivo, aby przekształcić wzbudzenie w bliskiej podczerwieni (NIR) w szeroki zakres emisji z obszarów UV, widzialnych i NIR w procesie konwersji wielu fotonów w górę4,5. Te unikalne właściwości sprawiają, że UCN domieszkowane lantanowcami służą jako szczególnie obiecujący wektor dla wykrywania biologicznego, obrazowania biomedycznego i chorób teranostyka6,7,8.

Ogólne składniki UCN są głównie oparte na domieszkowanych jonach lantanowców w izolującej matrycy gospodarza, zawierających uczulacz (np. Yb3+, Nd3+) i aktywator (np. Tm3+, Er3+, Ho3+) w krysztale jednorodnie9. Różna emisja optyczna z nanokryształów jest przypisywana zlokalizowanemu przejściu elektronowemu w obrębie 4 orbitalif domieszek lantanowców ze względu na ich drabinkowato ułożony poziom energii10. Dlatego tak ważne jest precyzyjne kontrolowanie wielkości i morfologii syntetyzowanych UCN z wieloskładnikowymi domieszkami lantanowców. Słusznie, pewne obiecujące metody przygotowania UCN domieszkowanych lantanowców zostały dobrze ugruntowane, w tym rozkład termiczny, współstrącanie w wysokiej temperaturze, synteza hydrotermalna, przetwarzanie zol-żel itp.11,12,13 Wśród tych podejść, metoda współstrącania w wysokiej temperaturze jest jedną z najpopularniejszych i najwygodniejszych strategii syntezy UCNs, która może być ściśle Kontrolowane w celu uzyskania pożądanych wysokiej jakości nanokryształów o jednolitym kształcie i rozkładzie wielkości w stosunkowo krótkim czasie reakcji i niskim koszcie14. Jednak większość nanostruktur syntetyzowanych tą metodą jest głównie pokryta hydrofobowymi ligandami, takimi jak kwas oleinowy i oleiloamina, które generalnie utrudniają ich dalszą bioaplikację ze względu na ograniczoną rozpuszczalność hydrofobowych ligandów w roztworze wodnym15. W związku z tym konieczne jest wykonanie odpowiednich technik modyfikacji powierzchni w celu przygotowania biokompatybilnych UCN w zastosowaniach biologicznych in vitro i in vivo.

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę eksperymentalną syntezy nanostruktur UCN typu core-shell za pomocą metody współstrącania w wysokiej temperaturze oraz wykonalną technikę modyfikacji w celu funkcjonalizacji biokompatybilnego polimeru na powierzchni UCN do dalszych zastosowań komórkowych. Ta nanoplatforma UCNs zawiera trzy jony lantanowców (Yb3+, Nd3+ i Tm3+) do nanokryształów, aby uzyskać silną niebieską emisję (~ 480 nm) po wzbudzeniu światłem NIR przy 808 nm, co ma większą głębokość penetracji w żywej tkance. Powszechnie wiadomo, że UCN domieszkowane Nd3+ wykazują zminimalizowane efekty absorpcji wody i przegrzania w tym oknie widmowym (808 nm) w porównaniu z konwencjonalnymi UCN po napromieniowaniu 980 nm16,17,18. Ponadto, aby wykorzystać UCN w systemach biologicznych, hydrofobowe ligandy (kwas oleinowy) na powierzchni UCN są najpierw usuwane przez sonikację w roztworze kwasu19. Następnie UCN wolne od ligandów są dalej modyfikowane biokompatybilnym polimerem (kwas poliakrylowy, PAA), aby uzyskać doskonałą rozpuszczalność w roztworach wodnych20. Ponadto, jako dowód słuszności koncepcji w zastosowaniach komórkowych, hydrofilowe UCN są dalej funkcjonalizowane ligandami molekularnymi (dibenzylo cyklooktyn, DBCO) w celu specyficznej lokalizacji na błonie komórkowej znakowanej N3. Po napromieniowaniu światłem NIR (808 nm), emisja niebieskiego w górę przy 480 nm może skutecznie aktywować białko kanałowe bramkowane światłem, rodopsyny kanałowe-2 (ChR2), na powierzchni komórki, a tym samym ułatwić napływ kationów (np. jonu Ca2 +) przez błonę żywych komórek.

Ten protokół wideo dostarcza realnej metodologii syntezy UCN domieszkowanych lantanowcami, biokompatybilnej modyfikacji powierzchni i bioaplikacji UCN w żywych komórkach. Wszelkie różnice w technikach syntezy i odczynnikach chemicznych stosowanych we wzroście nanokryształów będą miały wpływ na rozkład wielkości, morfologię i widma luminescencji konwersji w górę (UCL) końcowych nanostruktur UCN stosowanych w eksperymentach komórkowych. Ten szczegółowy protokół wideo został przygotowany, aby pomóc nowym badaczom w tej dziedzinie poprawić odtwarzalność UCN za pomocą metody współstrącania w wysokiej temperaturze i uniknąć najczęstszych błędów w biokompatybilnej modyfikacji powierzchni UCN do dalszych zastosowań komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Podczas przeprowadzania syntezy UCN w wysokiej temperaturze (~290 °C) należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli inżynieryjnych (okap wyciągowy) i środków ochrony osobistej (np. okularów ochronnych, rękawic, fartucha laboratoryjnego, spodni o pełnej długości i butów z zakrytymi palcami).

1. Synteza NaYF4:Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)@NaYF4:Nd(20%) nanokryształy rdzenia-powłoki

  1. Synteza nanostruktury rdzeniowejNaYF 4:Yb/Tm/Nd(30/0,5/1%)
    1. Przygotowanie roztworu podstawowego metanolu RE(CH3CO2)3, NaOH, NH4F
      UWAGA: Jony lantanowców ziem rzadkich (RE) obejmują itr (Y), iterb (Yb), tul (Tm) i neodym (Nd).
      1. Rozpuścić 500 mg wodzianu octanu itru(III) w 5 ml metanolu (100 mg/ml), 250 mg wodzianu octanu iterbu (III) w 5 ml metanolu (50 mg/ml), 10 mg octanu tlenu (III) w 1 ml metanolu (10 mg/ml) i 10 mg octanu neodymu(III) w 1 ml metanolu (10 mg/ml) w szklanych fiolkach z kąpielą ultradźwiękową przez 2 minuty.
      2. Połączyć 400 mg NaOH w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 20 ml metanolu z ultradźwiękową kąpielą czyszczącą, aby przygotować roztwór podstawowy NaOH (20 mg/ml).
      3. Połączyć 600 mg NH4F w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z 30 ml metanolu z ultradźwiękową kąpielą czyszczącą, aby przygotować roztwór podstawowy NH4F (20 mg/ml).
        UWAGA: Umieścić roztwór podstawowy kompleksów lantanowców, NaOH i NH4F w szklanych fiolkach, uszczelnić parafilmem i przechowywać w lodówce w temperaturze ~4 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Przygotowane roztwory podstawowe metanolu wymienia się raz na 2 tygodnie.
    2. Przygotowanie nanostruktury rdzenia NaYF4:Yb/Tm/Nd
      1. Pobrać pipetą 3 ml kwasu oleinowego i 7 ml 1-oktadecenu do kolby z trzema szyjkami o pojemności 50 ml.
      2. Połączyć 1,089 ml roztworu podstawowego Y(CH3CO2)3, 0,608 ml roztworu podstawowego Yb(CH3CO2)3, 83,6 μl roztworu podstawowego Tm(CH3CO2)3 i 128,5 μl roztworu podstawowego Nd(CH3CO2)3 do kolby.
      3. Umieścić termometr (zakres 0 - 360 °C) w kolbie i pozwolić, aby jego końcówka dotknęła roztworu. Umieścić kolbę w szklanym pojemniku z olejem fenylometylosilikonowym.
      4. Podgrzać roztwór do temperatury 100 °C za pomocą płyty grzejnej, aby odparować metanol. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka z podwójnym kolektorem próżniowo-gazowym w celu usunięcia pozostałości metanolu i utrzymywać mieszaninę reakcyjną w próżni przez 2 - 3 minuty, mieszając.
      5. Zwiększyć temperaturę do 150 °C i utrzymywać tę temperaturę przez 60 minut. Podczas syntezy utrzymać prędkość mieszania 700 obr./min.
        UWAGA: Ustaw umiarkowaną prędkość mieszania, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu.
      6. Zatrzymać płytę grzejną i utrzymywać kolbę w temperaturze pokojowej, aby roztwór powoli ostygł.
        UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
      7. Połączyć 2 ml roztworu podstawowego Metanolu NaOH i 2,965 ml roztworu podstawowego NH4F-metanolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dokręć probówkę nakrętką i mieszaj roztwór przez silne wirowanie przez 5 sekund.
      8. Mieszaninę NaOH-NH4F dodawać powoli do kolby szklaną pipetą przez 5 minut.
      9. Zwiększyć temperaturę mieszaniny do 50 °C i utrzymywać tę temperaturę przez 30 min.
        UWAGA: Ustaw temperaturę na nie więcej niż 50 °C, ponieważ wysoka temperatura będzie sprzyjać zarodkowaniu i wzrostowi kryształów.
      10. Zwiększyć temperaturę (~100 °C) w celu odparowania metanolu i podłączyć kolbę do przewodu Schlenka z podwójnym kolektorem próżniowo-gazowym w celu usunięcia pozostałości metanolu i utrzymania mieszaniny reakcyjnej w próżni przez 2 - 3 minuty.
      11. Zmienić położenie kranu, aby napełnić kolbę azotem.
      12. Zwiększyć temperaturę do 290 °C przy szybkości ogrzewania ~5 °C/min. Mieszaninę reakcyjną utrzymywać w temperaturze 290 °C przez 1,5 godziny.
      13. Zatrzymać płytę grzejną i wyjąć kolbę, aby mieszanina reakcyjna powoli ostygła w temperaturze pokojowej, mieszając.
        UWAGA: Uważaj na płytę grzejną o wysokiej temperaturze (>400 °C), aby uniknąć poważnych oparzeń w kontakcie ze skórą.
      14. Przenieść mieszaninę z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę 30 ml etanolu i przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
      15. Odwirować produkt w temperaturze 4 000 × g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
      16. Dodać 10 ml heksanu do probówki wirówkowej i ponownie zdyspergować produkt za pomocą sonikacji (60 kHz, 240 W) przez 2 minuty.
      17. Dodaj 30 ml etanolu do probówki. Odwirowywać produkt w temperaturze 4 000 × g przez 8 minut, a następnie wyrzucić supernatant.
      18. Ponownie rozproszyć produkty stałe na dnie probówki wirówkowej za pomocą 5 ml heksanu. Roztwór należy przechowywać w lodówce w temperaturze ~4 °C do następnego etapu.
        UWAGA: Emisja UCN z konwersją w górę rdzenia i powłoki jest testowana poprzez naświetlanie roztworów laserem o długości fali 808 nm (2 W).
  2. Przygotowanie nanokryształów rdzeniaNaYF 4:Yb/Tm/Nd(30/0,5/1%)@NaYF4:Nd (20%)
    1. Połączyć 3 ml kwasu oleinowego i 7 ml 1-oktadecenu w kolbie z trzema szyjkami o pojemności 50 ml. Dodać 1,082 ml roztworu podstawowego Y(CH3CO2)3 i 2,87 ml roztworu podstawowego Nd(CH3CO2)3 do kolby.
    2. Dodać otrzymaną nanostrukturę rdzeniową (80 mg w 5 ml heksanu z kroku 1.1.2.18) do kolby, mieszając.
    3. Umieścić termometr (zakres 0 - 360 °C) w kolbie i pozwolić, aby jego końcówka dotykała mieszanki. Umieścić kolbę w szklanym pojemniku z olejem fenylometylosilikonowym.
    4. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 100 °C na górze płyty grzejnej, aby odparować metanol i heksan. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka z podwójnym kolektorem próżniowo-gazowym w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika i utrzymywać mieszaninę reakcyjną w próżni przez 2 - 3 minuty, mieszając.
    5. Zwiększyć temperaturę do 150 °C i utrzymywać ją przez 60 minut. Utrzymać prędkość mieszania w syntezie na poziomie 700 obr./min.
      UWAGA: Ustaw umiarkowaną prędkość mieszania, aby uniknąć rozpryskiwania roztworu.
    6. Zatrzymać płytę grzejną i wyjąć kolbę, aby roztwór powoli ostygł w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    7. Odpipetować 2 ml roztworu podstawowego NaOH-metanolu i 2,965 ml roztworu podstawowego NH4F-metanolu do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dokręć probówkę nakrętką i mieszaj roztwór przez silne wirowanie przez 5 sekund.
    8. Dodawać mieszaninę do kolby za pomocą szklanej pipety powoli przez 5 minut.
    9. Zwiększyć temperaturę mieszaniny do 50 °C i utrzymywać ją na poziomie 50 °C przez 30 min.
      UWAGA: Ustaw temperaturę nie wyższą niż 50 °C, ponieważ wysoka temperatura będzie sprzyjać zarodkowaniu i wzrostowi kryształów.
    10. Zwiększyć temperaturę (~100 °C) w celu odparowania metanolu i podłączyć kolbę do przewodu Schlenka z podwójnym kolektorem próżniowo-gazowym w celu usunięcia pozostałości metanolu, utrzymując mieszaninę reakcyjną w próżni przez 2 - 3 minuty.
    11. Zmienić położenie kranu, aby napełnić kolbę azotem.
    12. Zwiększyć temperaturę do 290 °C przy szybkości ogrzewania ~5 °C/min. Mieszaninę reakcyjną utrzymywać w temperaturze 290 °C przez 1,5 godziny.
    13. Zatrzymać płytę grzejną i wyjąć kolbę, aby mieszanina reakcyjna powoli ostygła w temperaturze pokojowej, mieszając.
      UWAGA: Uważaj na płytę grzejną o wysokiej temperaturze (>400 °C), aby uniknąć poważnych oparzeń w kontakcie ze skórą.
    14. Przenieść mieszaninę z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę 30 ml etanolu i przenieść roztwór do probówki wirówkowej.
    15. Odwirować produkt w temperaturze 4 000 × g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
    16. Dodać 10 ml heksanu do probówki wirówkowej i ponownie zdyspergować produkt za pomocą sonikacji (60 kHz, 240 W) przez 2 minuty.
    17. Dodaj 30 ml etanolu do probówki. Odwirowywać produkt w temperaturze 4 000 × g przez 8 minut, a następnie wyrzucić supernatant.
    18. Ponownie rozproszyć produkty stałe na dnie probówki wirówkowej za pomocą 5 ml heksanu. Roztwór przechowywać w lodówce w temperaturze ~4 °C do momentu, gdy będzie potrzebny.
      UWAGA: Emisja UCN z konwersją w górę rdzenia i powłoki jest testowana poprzez naświetlanie roztworów laserem o długości fali 808 nm (2 W).

2. Synteza biokompatybilnych nanostruktur UCN

  1. Otrzymywanie nanocząstek UCN wolnych od ligandów
    1. Połączyć 30 ml etanolu z przygotowanym roztworem UCNs z oleinianem (krok 1.2.18) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować mieszaninę o stężeniu 4 000 × g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
    2. Połączyć 10 ml kwaśnego roztworu wodnego (pH = 4) wyregulowanego HCl (0,1 M) z osadem w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i rozpuścić osad przez sonikację (60 kHz, 240 W) przez 30 minut.
    3. Przenieść roztwór do szklanej fiolki, energicznie mieszając przez 2 godziny.
    4. Ekstrahować roztwór wodny 30 ml eteru dietylowego w celu usunięcia kwasu oleinowego, powtórzyć trzy razy.
    5. Dodaj 10 ml wody do połączonych warstw eteru, delikatnie wstrząsając.
    6. Zebrać razem fazę wodną (20 ml) i dodać 20 ml acetonu z wirowaniem przez 5 sekund.
    7. Odwirowywać produkt w temperaturze 35 000 × g przez 10 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Rozpuść osad w 2 ml wody.
  2. Przygotowanie UCN modyfikowanych polimerami (PAA-UCNs)
    1. Połączyć 200 mg kwasu poliakrylowego (PAA, Mw = 1,800) z 20 ml wody metodą sonikacji (60 kHz, 240 W) przez 20 minut. Dodać wyżej wymienione UCN wolne od ligandów do roztworu PAA, energicznie mieszając.
    2. Doprowadzić wartość pH do 7,4 za pomocą roztworu NaOH (1 M) z sonikacją (60 kHz, 240 W) przez 30 minut. Przechowywać mieszaninę przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, mieszając.
    3. Zebrać osad przez odwirowanie w ilości 35 000 × g przez 10 minut. Ponownie zawiesić produkt w 10 ml wody metodą sonikacji (60 kHz, 240 W) na 5 minut i ponownie odwirować przy 35 000 × g przez 10 minut. Powtórz ten krok trzy razy.
    4. Ponownie rozproszyć produkt w 8 ml wody metodą sonikacji (60 kHz, 240 W) przez 5 minut. Roztwór przechowywać w lodówce w temperaturze ~4 °C, aż będzie potrzebny.
  3. Otrzymywanie funkcjonalnych nanocząstek DBCO-UCN
    1. Odwirować tak przygotowany PAA@UCNs (1 mg) przez odwirowanie przy 35 000 × g przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 1 ml suchego DMF metodą sonikacji (60 kHz, 240 W) na 1 minutę i ponownie odwirować przy 35 000 × g przez 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    2. Rozpuścić osad w 200 μl suchego DMF w szklanej fiolce. Dodać HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH2 (5 mg) i DIPEA (16 μL) do fiolki, mieszając magnetycznie przez 24 godziny.
    3. Zebrać produkt przez odwirowanie w stężeniu 35 000 × g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml DMSO i ponownie odwirować przy 35 000 × g przez 10 minut. Powtórz ten krok trzy razy.
    4. Produkt rozpuścić w 0,2 ml DMSO i przechowywać w lodówce w temperaturze ~ 4 °C przed użyciem.

3. Biozastosowania DBCO-UCN w regulacji kanałów błonowych w żywych komórkach

  1. Hodować komórki HEK293 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i utrzymywać w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wysiew 1×10 5 komórek w 1 ml DMEM/studzienkę na 12-dołkowej płytce i przechowywać w inkubatorze przez 24 godziny.
  2. Połączyć plazmid (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 μg) z odczynnikiem do transfekcji P3000 (2 μL) w pożywce Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (100 μL) w probówce do mikrowirówki A i dodać odczynnik do transfekcji (1,5 μL) w MEM (100 μL) w probówce B.
  3. Mieszaninę roztworów inkubować w probówkach A i B przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Połączyć roztwór w probówce A i B z 400 μl MEM. Dwukrotnie umyj komórki 1 ml DMEM bez surowicy.
  5. Dodać 600 μl mieszaniny transfekcji do każdego dołka na 12-dołkowej płytce i inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Usunąć pożywkę i przemyć dwukrotnie 1 ml DMEM.
  6. Dodać 1 ml DMEM zawierający 1 μL Ac4ManNAz (50 mM w DMSO) do studzienki i przechowywać w inkubatorze przez 2 dni.
  7. Usuń pożywkę i przemyj raz 1 ml PBS. Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do każdego dołka płytki 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą (~2 min). Ponownie hodować komórki w naczyniu konfokalnym w 1×105 komórek/dołku w 1 ml DMEM przez noc.
  8. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml świeżego DMEM z 2 μl DBCO-UCN (50 mg/ml) do naczynia na 2 godziny w temperaturze 37 °C. W przypadku obrazowania konfokalnego należy dwukrotnie przemyć komórki DMEM i dodać 1 μl Rhod-N3 (10 mM) przez 30 minut.
  9. W celu wewnątrzkomórkowej analizy wapnia inkubować komórki z mieszaniną 1 μl Rhod-3 AM (10 mM), 10 μl probenecydu (250 mM) i 10 μl buforu ładującego (poliole wieloczynne Pluronic, 0,1% w/v)) w 1 ml pożywki DMEM przez 30 minut w ciemności.
  10. Przemyj komórki DMEM bez surowicy i naświetlaj światłem NIR o długości fali 808 nm w dawce 0,8 W/cm2 przez 20 min (5 min przerwy po 5 minutach oświetlenia).
  11. Zapisz wyniki obrazowania pod mikroskopem konfokalnym (źródło lasera: laser 561 nm; zasięg detektora: 610/75 nm; obiektyw: olej 100x 1,4 NA, czas naświetlania: 100 ms). Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się odłączą (~2 min). Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS do analizy za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) (np. 561 nm, Em: 582/15 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny proces syntezy UCN domieszkowanych lantanowców w powłokach rdzeniowych są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2. Zebrano odpowiednio obrazy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości (HRTEM) nanostruktur UCN rdzenia i rdzenia-powłoki (Rysunek 1). UCN wolne od ligandów są otrzymywane przez usunięcie hydrofobowego kwasu oleinowego z pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metodę syntezy nanokryształów konwersji w górę domieszkowanych lantanowców (UCN) i modyfikacji ich powierzchni za pomocą funkcjonalnych ugrupowań do zastosowań komórkowych. Ten nowatorski nanomateriał ma wyjątkowe właściwości optyczne, które mogą emitować promieniowanie UV i światło widzialne po wzbudzeniu światła NIR w procesie konwersji wielu fotonów. W tym protokole nanostruktury UCN typu core-shell (NaYF4:Yb/Tm/Nd (30/0,5/1%)@NaYF4:Nd (20%)) są przygotowywane metodą wspó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) i (RG 35/15) przyznane na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang w Singapurze oraz Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (NSFC) (nr 51628201).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-oktadecenowySigma AldrichO806Techniczny
kwas oleinowySigma Aldrich364525Klasa techniczna
MetanolFisher ScientificA412Klasa techniczna
Etanol Fisher ScientificA405Klasa techniczna
AcetonFisher ScientificA18Klasa techniczna
HeksanSigma AldrichH292Techniczny
hydrat octanu tulu (III) (Tm(CH3CO2)3)Sigma Aldrich36770299,9% na bazie metali śladowych
Hydrat octanu neodymu (III) (Nd(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32580599,9% metali śladowych
Podstawa Octan iterbu (III) hydrat (Yb(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32601199,9% meta śladowa na bazie
octanu itru(III) hydrat (Y(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32604699,9% na bazie metali śladowych
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma AldrichS5881odczynnik Fluorek
amonu (NH4F)Odczynnik Sigma Aldrich338869ACS
Chlorowodór (HCl)Odczynnik Fisher ScientificA144
kwas poliakrylowy (PAA)Sigma Aldrich323667średnia Mw 1800
Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT)Sigma Aldrich54802Odczynnik ACS
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)Sigma AldrichE7750handlowy
Dibenzocyklooktynoamina (DBCO-NH2)Odczynnik ACS Sigma Aldrich761540
N,N-diizopropyloetyloamina (DIPEA)Sigma AldrichD125806odczynnik ACS
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificBP231Techniczna
linia komórkowa HEK293ATCCCRL-1573ludzka embrionalna nerka
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma AldrichF1051Odczynnik ACS
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher1514012210 000 U / ml
plazmid (pCAGGS-ChR2-Venus)Addgene15753Plazmid wysyłany jako bakterie w agarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11965092
Opti-Modified Eagle Medium (MEM)Thermo Fisher51985034Reduced Serum
Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo FisherL3000015Transfekcja na bazie lipidów
N-azydoacetylomannosamina, acetylowana (Ac4ManNAz)Sigma AldrichA7605Odczynnik ACS
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo Fisher25200056Czerwień fenolowa
Zestaw do obrazowania wapnia Rhod-3 AMThermo FisherR10145Barwnik fluorescencyjny
5-karboksytetrametylodamino-azydek (Rhod-N3)Sigma Aldrich760757Azide-fluor 545
Naczynie konfekcyjneibidi GmbH81158Szklane dno, 35 mm
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 mlGreiner Bio-One227261Polipropylen
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 mlGreiner Bio-One188271Polipropylenowe
1,5 ml stożkowe probówki wirówkoweGreiner Bio-One616201Olej polipropylenowo-fenylometylosilikonowy
Clearco Products63148-52-7Mniej niż 320 stopni Celsjusza
Termometr szklanyGH ZealL0111/10Od -10 do 360 stopni Celsjusza
Płytka 12-dołkowaSigma AldrichZ707775Polistyren
Media

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).
  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
  4. Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
  5. Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136 (6), 2248-2251 (2014).
  6. Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  7. Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44 (6), 1416-1448 (2015).
  8. Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3 (5), 317-330 (2013).
  9. Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51 (25), 6121-6125 (2012).
  10. Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
  11. Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6 (8), 560-564 (2012).
  12. Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22 (30), 3266-3271 (2010).
  13. Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4 (1), 129-154 (2014).
  14. Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44 (6), 1346-1378 (2015).
  15. Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25 (28), 3758-3779 (2013).
  16. Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1608-1634 (2015).
  17. Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
  18. Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54 (27), 7915-7919 (2015).
  19. Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11 (2), 835-840 (2011).
  20. Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44 (6), 1379-1415 (2015).
  21. Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44 (6), 1318-1330 (2015).
  22. Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9 (7), 1634-1644 (2014).
  23. Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1680-1713 (2015).
  24. Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51 (13), 3125-3129 (2012).
  25. Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1526-1560 (2015).
  26. Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45 (36), 14101-14108 (2016).
  27. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  28. Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56 (11), 3031-3035 (2017).
  29. Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5173-5178 (2016).
  30. Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47 (10), 3052-3060 (2014).
  31. Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9 (11), 3698-3718 (2017).
  32. Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6 (13), 2439-2457 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Core shell Nanocrystal SynthesisHigh temperature Co precipitationBiocompatible Surface ModificationPolyacrylic Acid FunctionalizationDBCO Ligand ConjugationNear infrared Light ActivationCalcium Ion Influx RegulationConfocal Microscopy ImagingFlow Cytometry Analysis

Powiązane artykuły