Method Article

Stereotaktycznie sterowana ablacja kory słuchowej szczura i lokalizacja zmiany w mózgu

DOI:

10.3791/56429

⸱

October 11th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Eaton-Peabody Laboratory, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Department of Otolaryngology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę stereotaktycznego lokalizowania, ekspozycji i ablacji kory słuchowej u szczurów. Lokalizacja ablacji jest oceniana za pomocą mapy współrzędnych sporządzonej post mortem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora słuchowa szczura (AC) staje się popularna wśród badaczy neuronauki słuchowej, którzy są zainteresowani plastycznością zależną od doświadczenia, procesami percepcji słuchowej i korową kontrolą przetwarzania dźwięku w podkorowych jądrach słuchowych. Aby sprostać nowym wyzwaniom, procedura dokładnego zlokalizowania i chirurgicznego odsłonięcia kory słuchowej przyspieszyłaby te wysiłki badawcze. Neurochirurgia stereotaktyczna jest rutynowo stosowana w badaniach przedklinicznych na modelach zwierzęcych w celu wszczepienia igły lub elektrody w określonym miejscu w korze słuchowej. W poniższym protokole używamy metod stereotaktycznych w nowatorski sposób. Identyfikujemy cztery punkty współrzędnych nad powierzchnią kości skroniowej szczura, aby zdefiniować okno, które po otwarciu dokładnie odsłania zarówno pierwotną (A1), jak i wtórną (grzbietową i brzuszną) korę AC. Za pomocą tej metody wykonujemy następnie chirurgiczną ablację AC. Po wykonaniu takiej manipulacji konieczna jest ocena lokalizacji, wielkości i rozciągnięcia zmian powstałych w korze. W związku z tym opisujemy również metodę łatwego zlokalizowania pośmiertnej ablacji AC za pomocą mapy współrzędnych skonstruowanej przez przeniesienie granic cytoarchitektonicznych AC na powierzchnię mózgu. Połączenie stereotaktycznej lokalizacji i ablacji AC z lokalizacją uszkodzonego obszaru na mapie współrzędnych post mortem ułatwia walidację informacji uzyskanych od zwierzęcia i prowadzi do lepszej analizy i zrozumienia danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczur jest jednym z najczęściej używanych modeli zwierzęcych w neuronauce słuchowej. Solidność jego zachowania sprawia, że jest w stanie pracować przez setki prób dziennie. Jego czułość i ostrość spektralna dla słuchu1,2, oraz anatomiczna i funkcjonalna organizacja jego systemu centralnego, porównywalna z innymi ssakami3, sprawiają, że szczur jest odpowiednim modelem zwierzęcym do analizy szerokiego zakresu tematów badawczych w neuronauce słuchowej. W szczególności kora słuchowa szczura (AC) była przedmiotem kilku badań anatomicznych i fizjologicznych, które próbowały zrozumieć jej strukturę, organizację i rolę w przetwarzaniu dźwięku3. Obecnie AC stał się popularny wśród neurobiologów zainteresowanych plastycznością zależną od doświadczenia, percepcją słuchową, synaptycznymi podstawami organizacji pola recepcyjnego oraz korową kontrolą przetwarzania dźwięku w podkorowych jądrach słuchowych 4,5,6,7,8,9. Aby sprostać wyzwaniom, jakie stwarzają te nowe podejścia, procedury, które mogą dokładnie zlokalizować i chirurgicznie odsłonić AC, przyspieszą wysiłki badawcze. Techniki stereotaktyczne ułatwiają lokalizację określonych obszarów w mózgu bez konieczności przeprowadzania testów fizjologicznych. Chociaż rozmiar mózgu różni się nieznacznie u poszczególnych zwierząt, lokalizację dowolnego obszaru mózgu można określić za pomocą współrzędnych stereotaktycznych ustawionych na podstawie punktów orientacyjnych na czaszce mózgu szczura.

Ograniczona ablacja AC to chirurgiczne usunięcie obszaru czuciowego kory mózgowej najbardziej bezpośrednio związanego ze słuchem. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do blokowania aktywności AC, takich jak chłodzenie lub miejscowe wstrzyknięcia lidokainy10,11,12, chirurgiczna ablacja AC powoduje przewlekłą utratę funkcji. W związku z tym ablacje AC są bardziej odpowiednie do badania długoterminowych skutków deprywacji kory mózgowej, a także późniejszych zjawisk plastyczności zmian. Połączenie metod stereotaktycznych z chirurgicznymi ablacjami AC zostało z powodzeniem wykorzystane do badania fizjologicznych, behawioralnych i molekularnych skutków deprywacji kontroli korowej13,14,15,16,17,18,19. Na przykład model szczura z obustronnymi ablacjami AC został wykorzystany do zbadania wpływu ablacji kory mózgowej na odruch słuchowego przerażenia i słuchowe reakcje pnia mózgu (ABR)16. Ostatnio porównaliśmy efekty, jakie wywołują jednostronne i dwustronne ablacje AC szczura w progach, amplitudach i opóźnieniach ABR w różnych punktach czasowych po urazie18. Ponadto szczurzy model restrykcyjnej ablacji AC został również wykorzystany do zbadania wpływu zwyrodnienia szlaku korowo-ofugalnego w dolnej części collicus13,14,15 i uchu wewnętrznym17,19. Po wykonaniu takiej manipulacji w mózgu konieczna jest ocena lokalizacji, wielkości i rozciągłości zmian powstałych w korze mózgowej. Chociaż jest to bardzo przydatne, głównym ograniczeniem map tonotopowych opartych na odpowiedziach neuronalnych20,21 są techniki elektrofizjologiczne wymagane do zlokalizowania pól słuchowych w mózgu szczura. Ponieważ nie wszystkie laboratoria dysponują niezbędnym sprzętem i/lub wiedzą specjalistyczną do wykonywania takich nagrań, skonstruowaliśmy mapę współrzędnych w oparciu o przeniesienie granic cytoarchitektury prądu przemiennego na obraz powierzchni mózgu18. Ta mapa może być bardzo przydatna do zlokalizowania AC bez testów fizjologicznych.

Obecny protokół opisuje metodę stereotaktycznego prowadzenia, chirurgicznego narażenia i ablacji AC u szczurów. Opisano również, jak korzystać z naszej mapy współrzędnych18, aby łatwo zlokalizować rozszerzenie zmiany na obrazie powierzchni mózgu poddanego ablacji.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności zarówno z hiszpańskimi przepisami (Dekret Królewski 53/2013 - Ustawa 32/2007), jak i wytycznymi Unii Europejskiej (Dyrektywa 2010/63/UE) w sprawie opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach biomedycznych.

1 . Przygotowanie szczura

UWAGA: Przeprowadziliśmy eksperymenty na samcach szczurów, aby uniknąć jakichkolwiek zmian hormonalnych.

  1. Znieczulić zwierzę za pomocą mieszaniny chlorowodorku ketaminy (30 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (5 mg/kg) wstrzykiwanego domięśniowo; przy tej dawce szczur powinien być głęboko znieczulony przez około 1 godzinę.
  2. Uszczypnij szczura w palec u nogi; brak odruchu wycofania wskazuje, że zwierzę jest całkowicie nieprzytomne. Jeśli szczur zareaguje na uszczypnięcie, należy podać dodatkowe znieczulenie w jednej trzeciej początkowej dawki.
  3. Ogolić skórę głowy i zdezynfekować obszar operacyjny jodonem powidonu.
  4. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę 38 °C i ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie za pomocą dwóch nauszników i pręta do gryzienia. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć przekłuwania błony bębenkowej nausznikami.
  5. Chroń oczy, nakładając kroplę żelu okulistycznego lub serum soli fizjologicznej na każde oko.

2. Lokalizacja AC w kości skroniowej szczura

  1. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć okostną pokrywającą powierzchnię czaszki.
  2. Użyj sterylnej bawełnianej końcówki, aby delikatnie usunąć krew pokrywającą powierzchnię czaszki, aby uwidocznić bregmę, lambdę i międzyuszne 0 zgodnie z atlasem Paxinosa i Watsona szczura brain22.
  3. Wykonaj nacięcie w mięśniu skroniowym w pobliżu jego przyczepu grzbietowego na czaszce za pomocą skalpela. Wyciągnij mięsień za pomocą igły i materiału do szycia, a następnie przymocuj materiał szwu do ramy stereotaktycznej; Spowoduje to odsłonięcie kości skroniowej. Jeśli wystąpi krwawienie, spłucz zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
  4. Umieść sterylną prostą igłę w stereotaktycznym mikromanipulatorze, upewniając się, że jest w pełni zabezpieczona.
  5. Powoli opuść igłę, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią czaszki, tak aby końcówka igły była ustawiona na 0 międzyuszne. Ustaw ten punkt jako zero i określ współrzędne od tego punktu.
  6. W zależności od obszaru zainteresowania mózgu zmieniaj współrzędne stereotaktyczne. Określ te współrzędne, korzystając z atlasu Paxinos i Watson szczura brain22. Po ustaleniu współrzędnych przesuń igłę, aby dopasować te współrzędne.
  7. Skieruj się na AC, używając współrzędnych następujących czterech punktów: A: A/P = -5,8 mm, M/L = +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L= +/- 8,67 mm. Opuść igłę tuż nad kością skroniową, aby uwidocznić każdy z tych czterech punktów. Za pomocą markera zaznacz punkty na kości skroniowej i połącz je, aby narysować prostokąt; prostokąt posłuży jako przewodnik do otwarcia okna w kości (Rysunek 1).

3. Chirurgiczne odsłonięcie AC

  1. Otwórz okno za pomocą wiertarki elektrycznej i małego wiertła (Ø 0,6 mm). Wywierć obwód prostokąta z prędkością 8,000 obr./min, aż kość się podda. Schłodzić powierzchnię wiercenia, spłukując zimną sterylną solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniu struktur podkorowych. Kiedy kość ustępuje, można wykryć spadek oporu. Uważaj, aby nie wiercić mózgu.
  2. Gdy brzegi są luźne, podciągnij kość pokrywającą za pomocą cienkich kleszczy i przechowuj ją w zimnym sterylnym roztworze soli fizjologicznej.

4. Ablacja AC

  1. Za pomocą mikroskopu chirurgicznego (10X) delikatnie odetnij opony mózgowe nożem mikrochirurgicznym i usuń je za pomocą dwóch drobno zakończonych kleszczy. Jeśli wystąpi krwawienie, spłucz zimnym sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
  2. Delikatnie zassać klimatyzator za pomocą ssącego urządzenia chirurgicznego (ciśnienie -0,24 bara) połączonego ze sterylną igłą o końcówce 20 G. Ten punkt jest krytyczny i należy go wykonać bardzo ostrożnie: odessać tylko sześć warstw korowych, a nie leżącą pod spodem istotę białą.
  3. Zasysać, aż perforujące tętnice przestaną krwawić.
  4. Po zakończeniu aspiracji przykryj uszkodzony obszar pobraną kością i przyłóż wchłanialną gazę hemostatyczną.
  5. Pozwól, aby mięsień skroniowy odzyskał swoją pierwotną pozycję, a następnie zszyj skórę za pomocą klipsów do ran (9 mm). Zastosuj maść z antybiotykiem (patrz tabela materiałów). Kontynuuj nakładanie maści na ranę dwa razy dziennie przez trzy dni.
    UWAGA: Każda aplikacja składa się z cienkiej warstwy nakładanej na ranę.
  6. Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w grzbiet szczura (0,05 mg/kg) jako środek przeciwbólowy 1 godzinę po zabiegu, a następnie co 8 godzin przez 72 godziny.
  7. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej, dopóki się nie obudzi, i włóż je z powrotem do klatki w pomieszczeniu, aby mogło dojść do siebie.
  8. Trzymaj zwierzęta indywidualnie, aby zapobiec dotykaniu przez kolegów z klatki zszytego obszaru i zapewnić pewne elementy wzbogacające. Zmieniaj trociny codziennie, aby zapobiec infekcji i dokładnie sprawdzaj, czy zwierzę prawidłowo wraca do zdrowia i nie wykazuje żadnych oznak dyskomfortu.

5. Pobieranie tkanek

Uwaga: Podczas obchodzenia się z paraformaldehydem (PFA), zarówno stałym, jak i wodnym, należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) i używać szafy bezpieczeństwa.

UWAGA: Przygotuj 750 ml roztworu formaldehydu, rozpuszczając 4% (w/v) PFA w 1x roztworze buforowanym fosforanem (PBS) za pomocą ciepła (55 °C). Przefiltruj roztwór formaldehydu za pomocą bibuły filtracyjnej. Przygotuj roztwór Ringera, rozpuszczając 8,5 g NaCl, 0,25 g KCl i 0,2 g NaHCO3w 1,000 ml wody (pH roztworu = 6,9).

  1. Pozwól zwierzęciu przeżyć tak długo, jak jest to potrzebne do badania. Po zakończeniu badań przeprowadzonych na szczurze poddanym ablacji AC, należy go znieczulić końcowo przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 ml pentobarbitalu sodu (60 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i brak odruchu wycofania.
  2. Gdy zwierzę jest głęboko znieczulone, wykonaj perfuzję wewnątrzsercową23 ze 125 ml roztworu Ringera, a następnie 750 ml roztworu formaldehydu za pomocą igłomierza o średnicy wewnętrznej 1,8 mm.
  3. Po zakończeniu perfuzji odetnij głowę szczura przy pierwszym kręgu szyjnym.
  4. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę i mięśnie z głowy i odsłonić czaszkę. Użyj nożyczek, aby przeciąć i otworzyć otwór wielki i usunąć tył czaszki.
  5. Wykonaj poprzeczne cięcie w kości oczodołu za pomocą nożyczek Spencera i użyj rongeurs do przecięcia wzdłuż górnych krawędzi czaszki, aby odsłonić mózg. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu.
  6. Po odsłonięciu mózgu ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą cienkich kleszczy. Użyj palca, aby delikatnie zgarnąć i podnieść mózg. Podnieś mózg i przetnij nerwy, aż będzie wolny. Zanurzyć mózg w roztworze formaldehydu i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.

6. Lokalizacja zmian AC

  1. Po utrwaleniu ostrożnie umieść mózg w strzałkowej matrycy mózgu szczura, odsłaniając boczną powierzchnię mózgu.
  2. Umieść aparat 21 cm nad powierzchnią kory mózgowej za pomocą uchwytu aparatu, wybierz tryb "super makro fotografowania" i zrób zdjęcie powierzchni mózgu.
  3. Umieść mózg w koronalnej matrycy mózgu szczura, odsłaniając grzbietową powierzchnię mózgu i zrób kolejne zdjęcie.
  4. Korzystając z programu do edycji obrazów, otwórz obrazy i przeskaluj je w dół o 50%, aby ułatwić pracę z nimi. Zidentyfikuj odniesienia bregma, lambda i międzyuszne 0 na obrazie zgodnie ze współrzędnymi Paxinos i Watson19 i zaznacz ich pozycję na obrazach (Rysunek 2). Narysuj kontur ablacji na bocznym obrazie mózgu. Oblicz obwód.
  5. Zaimportuj mapę współrzędnych, na której znajdują się główne (A1) i drugorzędne regiony (Kora grzbietowa i brzuszna) AC 18 do pliku edytora, w którym pracujesz ze zdjęciami. Kliknij na mapę i przeciągnij ją, aby nałożyć ją na boczne zdjęcie mózgu poddanego ablacji.
    1. Spraw, aby odniesienia bregma i lambda mapy współrzędnych pokrywały się z odniesieniami bregma i lambda zidentyfikowanymi na obrazie bocznego mózgu.
    2. Użyj szczeliny nosa jako odniesienia, aby dostosować obraz mózgu do mapy i sprawić, by pokrywały się (Rysunek 2B).
  6. Obliczyć procent zmiany w stosunku do obszaru zajmowanego przez AC.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy stereotaktyczną lokalizację, chirurgiczne narażenie i jednostronną ablację AC u trzech szczurów rasy Wistar. Lokalizacja zmiany potwierdziła, że ablacje przeprowadzone u trzech szczurów wkroczyły w główne podpodziały AC (kora pierwotna, grzbietowa i brzuszna) i obejmowały zakres od 80 do 100% całkowitego obszaru AC (Ryc. 2B).

Opisany tutaj protokół wykonywania restrykcyjnych ablacji AC był wcześniej używany w naszym laboratorium do badania długoterminowych skutków deprywacji kontroli korowej w podkorowych jądrach słuchowych, jak również późniejszych zjawisk plastyczności. W tych badaniach protokół ablacji AC został zwalidowany poprzez zastosowanie fizjologicznych (ABR), behawioralnych (reakcje na zaskoczenie, hamowanie przedimpulsowe; PPI) oraz metody molekularne (mikromacierze DNA, qPCR i Western Blot)13,14,15,16,17,18,19. Tutaj, aby zademonstrować skuteczność naszego protokołu, pozwoliliśmy trzem szczurom poddanym ablacji AC przeżyć przez tydzień i pobraliśmy ślimaki podczas etapu pobierania tkanki, aby zbadać zmiany w ekspresji najistotniejszych podjednostek AMPA obecnych w ślimaku dorosłego, GluA2 i GluA3, metodą qPCR. Porównanie transkryptów od szczurów z ablacją AC i pozorowanych zwierząt kontrolnych, u których przeprowadzono cały proces chirurgiczny, ale nie przeprowadzono ablacji kory mózgowej, wykazało regulację w dół dla GluA2 i regulację w górę dla GluA3 w obu ślimakach (Rysunek 3), co jest zgodne z naszym poprzednim badaniem19.

figure-results-1
Rycina 1: Obrazy kości skroniowej szczura w trzech różnych etapach chirurgicznych. (A) Przeniesienie współrzędnych stereotaktycznych prądu przemiennego do kości skroniowej. Współrzędne czterech punktów to: A: A/P= -5,8 mm, M/L= +/- 6,4 mm; B: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 6,4 mm; C: A/P= -2,7 mm, M/L= +/- 8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = +/- 8,67 mm. (B) Współrzędne są używane jako odniesienie do narysowania prostokąta na powierzchni kości skroniowej, który pokieruje otwarciem okna. (C) Pokazuje okno otwarte w kości po wierceniu. Opony mózgowe z naczyniami krwionośnymi można zaobserwować na powierzchni mózgu. R: rostralny, D: grzbietowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Procedura lokalizacji zmian w mózgu szczura. (A) Fotografia grzbietowej powierzchni mózgu poddanego ablacji prądem przemiennym za pomocą stereotaktycznie wszczepionych igieł w Lambda i Bregma (zgodnie z współrzędnymi Paxinosa i Watsona19). Linie przerywane oznaczają pozycję Bregmy i Interaural 0 w siatce 9 cm x 9 cm, a także na grzbietowej powierzchni mózgu. (B) Fotografia bocznej powierzchni mózgu poddanego ablacji nałożona na mapę współrzędnych prądu przemiennego. Obwód zmiany jest oznaczony na rysunku kolorem czerwonym. Obwód obszaru AC jest oznaczony na mapie kolorem czarnym. W tym przykładzie procent ablacji AC w stosunku do całkowitej powierzchni zajmowanej przez AC wynosi 84,79%. AC: kora słuchowa, IA: międzyuszna, FR: szczelina nosa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Zmiany poziomów mRNA podjednostek receptora AMPA GluA2 i GluA3 po jednostronnych ablacjach AC 7 dni po zmianie. Wyniki są prezentowane jako średnia ± odchylenie standardowe zmiany zagięcia. Zmiany w transkryptach GluA2 są przedstawione na niebiesko. Zmiany dla transkryptów GluA3 są przedstawione w kolorze czerwonym. Znaczny spadek GluA2 i wzrost GluA3 obserwuje się zarówno w ślimakach (ipsi- i przeciwlegle do ablacji) w porównaniu z kontrolami pozorowanymi bez ablacji korowej po 7 dniach od operacji; Jest to zgodne z naszymi poprzednimi wynikami19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana operacja mózgu zależy od dwóch czynników: utrzymania zwierzęcia przy życiu w trakcie i po zabiegu oraz dokładnego zlokalizowania obszaru zainteresowania. Upewnienie się, że szczur jest głęboko znieczulony podczas operacji (badanie odruchu odstawienia) i otrzymuje odpowiednie leki przeciwbólowe i nieototoksyczne antybiotyki, powinno pomóc w przeżyciu. Dodatkowo szczur powinien być trzymany na poduszce grzewczej, dopóki nie obudzi się ze znieczulenia, aby uniknąć hipotermii. Szycie zmniejszy podatność na infekcje, a właściwa technika jest niezbędna: zwierzęta będą dłubać w klipsach do ran, dlatego należy je wszczepić wystarczająco mocno, aby zapobiec usunięciu bez wywierania zbyt dużego nacisku na ranę.

Aby dokładnie zlokalizować AC (lub jakikolwiek inny obszar kory), ważne jest, aby określić pozycję bregmy, lambdy i międzyusznego 0, aby użyć ich jako odniesień do obliczenia granic docelowego regionu. Każdy błąd w obliczeniach współrzędnych spowoduje częściową ablację prądu przemiennego lub niepożądane aspiracje innych otaczających obszarów. W związku z tym końcówka igły powinna dotykać kości tylko w punkcie międzyusznym 0, a następnie przesunąć współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne zgodnie z tym, co opisano w tym protokole.

W tym manuskrypcie opisaliśmy również, jak chirurgicznie odsłonić i dokonać ablacji AC. Istnieją trzy kluczowe etapy: proces wiercenia, otwieranie i usuwanie opon mózgowych oraz ablacja przez aspirację. Wiercenie powinno być wykonywane z małą prędkością przy minimalnym ciśnieniu, ponieważ duża prędkość wiercenia generuje ciepło, które może wpływać na pobliskie struktury podkorowe. Jednak utrzymywanie niskiej prędkości i chłodzenie obszaru wiercenia zimną sterylną solą fizjologiczną powinno zapobiec uszkodzeniom. Ponadto minimalne ciśnienie jest niezbędne, aby uniknąć nagłego pęknięcia czaszki i późniejszego uszkodzenia kory mózgowej. Otwieranie i usuwanie opon mózgowych pokrywających klimatyzację należy wykonywać ostrożnie, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych. Jeśli dojdzie do krwawienia, wczesne i późne rokowanie jest na ogół niekorzystne i wątpliwe jest, czy takie zwierzę spełnia kryteria włączenia do wiarygodnego badania. W takim przypadku zalecamy eutanazję. Wreszcie aspiracja (prawdopodobnie najtrudniejszy aspekt w wykonaniu skutecznej zmiany) musi być ograniczona do istoty szarej. Istnieją dwa wskaźniki, które mogą pomóc w wykryciu obecności istoty białej: (1) zmiana kontrastu kolorów, ponieważ istota biała jest jaśniejsza niż istota szara; oraz (2) zaprzestanie krwawienia z tętnic perforujących.

Po każdej manipulacji wykonanej w mózgu konieczna jest ocena lokalizacji, wielkości i rozszerzenia procedury wykonanej w korze mózgowej w celu późniejszej analizy i walidacji danych uzyskanych od zwierzęcia. W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy, jak zlokalizować ablację wykonaną w korze mózgowej za pomocą mapy współrzędnych opisanej wcześniej przez naszą grupę18. Mapa ta została skonstruowana na podstawie odniesień anatomicznych uzyskanych z seryjnych rekonstrukcji odcinków histologicznych, skorelowanych z atlasem mózgu szczura Paxinosa i Watsona22. W związku z tym mapa rozróżnia korę pierwotną (A1) i wtórną (grzbietową i brzuszną) AC. Główną zaletą tej mapy współrzędnych jest to, że umożliwia szybką lokalizację zmiany poprzez nałożenie obrazu wykonanego z bocznej powierzchni mózgu umieszczonego w strzałkowej macierzy mózgu. Kolejną zaletą jest to, że laboratoria z mniejszym doświadczeniem w anatomii mogą korzystać z mapy, dostosowując ją do swoich modeli zwierzęcych. Konieczne jest jedynie ustawienie odległości między odniesieniami bregma, lambda i międzyusznymi 0 w mózgu z perfuzją kontrolną i odpowiednie przeskalowanie mapy w górę lub w dół. Użyj szczeliny nosa jako odniesienia, aby dostosować obraz mózgu do mapy. Głębokość ablacji nie może być określona na tej mapie współrzędnych, dlatego należy ją określić w przekrojach histologicznych mózgu.

Połączenie metod stereotaktycznych z chirurgicznym naświetleniem AC to podstawowe metody, które mogą być łatwo dostosowane przez każdego badacza, który chce celować w AC u szczura. Może to dotyczyć ostrego eksperymentu lub takiego, który wymaga wszczepienia stałych urządzeń. Co więcej, chirurgiczna ablacja AC była wcześniej wykorzystywana jako model do badania skutków przewlekłej deprywacji korowej w słuchu. Ablacje AC mogą być również wykorzystywane do badania efektów, jakie jednostronne ablacje AC wywierają na inne obszary kory mózgowej lub służyć jako model udaru. W związku z tym opisane tutaj projekty eksperymentalne są użytecznymi metodami, które mogą być stosowane indywidualnie lub w połączeniu z szerokim zakresem projektów eksperymentalnych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wsparte grantem z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności (MINECO) Rządu Hiszpanii, SAF2016-78898-C2-2-R.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rama stereotaktycznaDavid Kopf Ins.900
Mikroskop chirurgicznyWILD M650 Heerbrugg
Poduszka grzewczaDAGA
Mikrosilnik dentystycznyW& H elco5118
Frez diamentowyB BraunGD021R0,6 mm
Chirurgiczne urządzenie ssąceAtmosAtmoforte E2
KetaminaMerial30 mg/kg
KsylazynaBayer5 mg/kg
MikromanipulatorNarishigeSM-11
Skalpel Lawton
Powidon jodMedaBetadine
sterylna surowica soli fizjologicznejB.Braun
20G sterylna igłaTerumo Neolus
Bawełniane końcówki
Materiał szwuB.Braun
Maść antybiotykowaQuadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough
Kleszczedimeda10.331.12
Igły chirurgiczneWorld Precision Instruments501940
BuprenorphineIndivior UKBuprex0,05 mg/kg
Nożyczkidimeda08.120.15
Nożyczki Spencerdimeda08.804.14
RongeursLawton
Nóż mikrochirurgicznyMSP7503
Wchłanialna gaza hemostatycznaSurgicel
Saggital szczur Brain MatrixActivational systems Inc.RBM-1000DV / RBM 4000C
Pentobarbital soduVetoquinol60 mg / kg
Aparatfotograficzny Olympus 5,1 MPC-5060 szerokokątny obiektyw zmiennoogniskowyF2,8-4,8
Klipsy do ranReflex 99 mm
Płótno 12ACD Systems
średnica1,8 mm
Lejek separacyjnylabbox11409500 ml
Starter GluA2 ForwardGeneBankNM_017261CGGCAGCTCAGCTAAAAACT
Starter GluA2 ReverseGeneBankNM_017261TTGTAGCTGGTGTGTTGA
Starter GluA3 ForwardGeneBankNM_032990ATTGCTGATGGTGCAATGAC
Starter GluA3 ReverseGeneBankNM_032990TTTGCATTGTCCAAAGTCTCTC
igły

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auditory frequency discrimination in the white rat. Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).">Talwar, S. K., Gerstein, G. L. Auditory frequency discrimination in the white rat. Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).
  2. Audiogram of the hooded Norway rat. Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).">Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. Audiogram of the hooded Norway rat. Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).
  3. The Rat Nervous System. , Academic Press. San Diego. 995-1080 (2004).">Malmierca, M. S., Merchán, M. A. Auditory System. The Rat Nervous System. , Academic Press. San Diego. 995-1080 (2004).
  4. Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea. Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).">Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea. Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).
  5. Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.". J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).">Dinse, H. R. Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.". J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).
  6. Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).">Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).
  7. Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex. J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).">Kaur, S. Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex. J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).
  8. Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties. J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).">Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties. J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).
  9. Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons. Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).">Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons. Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).
  10. Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas. PLOS ONE. 7 (4), e36203(2012).">León, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamamé, C. M., Delano, P. H. Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas. PLOS ONE. 7 (4), e36203(2012).
  11. Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils. Hear Res. 332, 61-72 (2016).">Jager, K., Kossl, M. Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils. Hear Res. 332, 61-72 (2016).
  12. The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation. J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).">Dragicevic, C. D., et al. The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation. J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).
  13. Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis. Front Neural Circuits. 6, 86(2012).">Clarkson, C., Herrero-Turrión, M. J., Merchán, M. A. Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis. Front Neural Circuits. 6, 86(2012).
  14. Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation. J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).">Clarkson, C., Juíz, J. M., Merch́an, M. A. Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation. J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).
  15. Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex. Front Neuroanat. 4, 141(2010).">Clarkson, C., Juíz, J. M., Merchán, M. A. Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex. Front Neuroanat. 4, 141(2010).
  16. Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response. Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).">Hunter, K. P., Willott, J. F. Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response. Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).
  17. Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics. Front Syst Neurosci. 8, 253(2014).">Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merchán, M. A. Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics. Front Syst Neurosci. 8, 253(2014).
  18. Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex. PLOS ONE. 8 (9), e73585(2013).">Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merchán, M. A. Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex. PLOS ONE. 8 (9), e73585(2013).
  19. Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea. Hear Res. 346, 71-80 (2017).">Lamas, V., Juiz, J. M., Merchán, M. A. Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea. Hear Res. 346, 71-80 (2017).
  20. Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field. J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).">Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field. J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).
  21. Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat. J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).">Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a, Merzenich, M. M. Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat. J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).
  22. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (2005).">Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (2005).
  23. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Auditory Cortex AblationStereotactic NeurosurgeryRat Brain LesionCoordinate Map LocalizationTemporal Bone WindowSurgical Aspiration TechniquePostmortem Brain AnalysisBregma Lambda ReferencesRhinal Fissure AlignmentAuditory Cortex Mapping

Related Articles