Opisujemy metodę laminotomii u świń, która zapewnia dostęp do zwojów korzenia grzbietowego lędźwiowego (DRG) do iniekcji wewnątrzzwojowej. Postęp iniekcji jest monitorowany śródoperacyjnie i potwierdzany histologicznie do 21 dni po zabiegu. Protokół ten może być wykorzystany w przyszłych badaniach przedklinicznych obejmujących wstrzyknięcie DRG.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Laminotomia w celu uzyskania dostępu do ganglionu korzenia grzbietowego lędźwiowego i wstrzyknięcia u świń
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) są anatomicznie dobrze zdefiniowanymi strukturami, które zawierają wszystkie pierwotne neurony czuciowe poniżej głowy. Fakt ten sprawia, że DRG jest atrakcyjnym celem do wstrzykiwania nowatorskich leków mających na celu leczenie przewlekłego bólu. W małych modelach zwierzęcych laminektomia była stosowana w celu ułatwienia wstrzyknięcia DRG, ponieważ polega na chirurgicznym usunięciu kości kręgowej otaczającej każdy DRG. Demonstrujemy technikę dozwojowego wstrzykiwania DRG w odcinku lędźwiowym u dużego gatunku zwierząt, a mianowicie trzody chlewnej. Laminotomia jest wykonywana w celu umożliwienia bezpośredniego dostępu do DRG przy użyciu standardowych technik, narzędzi i materiałów neurochirurgicznych. W porównaniu z bardziej rozległym usuwaniem kości za pomocą laminektomii, wdrażamy laminotomię w celu zachowania anatomii kręgosłupa przy jednoczesnym osiągnięciu wystarczającego dostępu DRG. Śródoperacyjny postęp iniekcji DRG jest monitorowany za pomocą nietoksycznego barwnika. Po eutanazji w 21. dniu po operacji, powodzenie wstrzyknięcia określa się na podstawie histologii dystrybucji wewnątrzzwojowej 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Wstrzykujemy biologicznie nieaktywny roztwór, aby zademonstrować protokół. Metoda ta może zostać zastosowana w przyszłych badaniach przedklinicznych w celu ukierunkowania rozwiązań terapeutycznych na DRG. Nasza metodologia powinna ułatwić testowanie translatowalności wewnątrzzwojowych paradygmatów małych zwierząt u dużych gatunków zwierząt. Dodatkowo, protokół ten może służyć jako kluczowe źródło informacji dla osób planujących badania przedkliniczne wstrzyknięcia DRG u świń.
Wprowadzenie
Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) są anatomicznie odrębnymi, neuronalnymi zbiorami zlokalizowanymi wzdłuż kręgosłupa. Każdy DRG zawiera pierwotne neurony czuciowe, które kodują i przekazują bodźce obwodowe do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) z określonych obszarów ciała. Na przykład ból związany z chorobą zwyrodnieniową stawów zaczyna się, gdy receptory bólu zlokalizowane wokół stawu odbierają szkodliwe bodźce. Proces ten nazywany jest nocycepcją. Długotrwała świadomość szkodliwych bodźców prowadzi do przewlekłego bólu 1.
Przewlekły ból jest częstym przedmiotem badań przedklinicznych 2, gdzie jednym z celów jest opracowanie użytecznych metod celowego dostarczania leków przeciwbólowych do DRG, takich jak iniekcja dozwojowa 3. Jednak DRG są trudno dostępne, ponieważ znajdują się w kościstych granicach otworów międzykręgowych 4. Kilka grup z powodzeniem pokonało tę przeszkodę dzięki zastosowaniu chirurgii kręgosłupa u gryzoni 5,6,7,8,9,10.
W klinice laminektomia jest powszechną operacją kręgosłupa i odnosi się do chirurgicznego usunięcia blaszki kręgowej, tym samym odsłaniając kanał kręgowy 11. Włączenie technik chirurgicznych w celu zapewnienia bezpośredniego dostępu do DRG odniosło sukces u gryzoni 5,12, jednak tłumaczenie może być nierealistyczne, biorąc pod uwagę różnice w wielkości odpowiednich struktur i to, jak wpływa to na farmakokinetykę lub wykonalność techniczną 13,14. Na przykład w jednym z badań określono poprzeczną średnicę rdzenia kręgowego w T10 na 3,0, 7,0 i 8,2 mm odpowiednio dla szczura, świni i człowieka 15. W ten sposób duże modele zwierzęce lepiej przybliżają ludzkie wymiary struktur nerwowych.
U świń, Raore i wsp. zastosowali wielopoziomową laminektomię, aby uzyskać dostęp do rdzenia kręgowego szyjnego w celu wielokrotnych wstrzyknięć dordzeniowych 16. Procedura była dobrze tolerowana i doprowadziła do badania klinicznego fazy I, w którym udokumentowano porównywalne wyniki chirurgiczne 17. Wyniki te zachęcają do dalszego wykorzystywania przedklinicznych dużych modeli zwierzęcych jako predyktorów technicznej wykonalności i bezpieczeństwa u ludzi.
Do tej pory nie istnieje szczegółowa metodologia chirurgicznego dostępu i wstrzykiwania DRG u dużych gatunków zwierząt. Aby zawęzić tę lukę translacyjną, przedstawiamy protokół ekspozycji na DRG i wstrzyknięcia przez laminotomię u świń. Zastosowano standardowe techniki, instrumenty i materiały neurochirurgiczne, a metoda została zaprojektowana tak, aby naśladować nowoczesną praktykę chirurgiczną. Pokazujemy wstrzyknięcie dozwojowe przy użyciu roztworu wodnego do DRG odcinka lędźwiowego i potwierdzamy pomyślny poród za pomocą histologii po 21 dniu pooperacyjnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kliniki Mayo.
1. Warunki wstępne rygoru i powtarzalności
- Aby zapewnić rygor projektowania, należy zawsze przestrzegać krajowych standardów dobrej praktyki laboratoryjnej i uzyskać wewnętrzną zgodę IACUC (lub podobnego komitetu) przed jakimkolwiek udziałem zwierząt w eksperymentach.
UWAGA: Ten protokół został opracowany w celu utrzymania klinicznie wiernego podejścia. W związku z tym materiały, instrumenty i techniki są opisane w sposób identyczny z najwyższymi standardami klinicznymi u ludzi. Na przykład przestrzegana jest ścisła technika sterylna i nigdy nie należy używać przeterminowanych materiałów. - Aby ułatwić odtwarzalność tej metodologii w warunkach eksperymentalnych, należy opracować wewnętrzne standardowe procedury operacyjne i kontrolę zmienności rasy, wagi, płci i wieku świń między oddzielnymi kohortami.
UWAGA: Konstrukcja tego protokołu opierała się na wykorzystaniu trzody chlewnej o wadze 38 - 53 kg.
2. Przedoperacyjna opieka nad zwierzętami
- Profilaktycznie podawać ceftiofur domięśniowo (IM), podawany w dawce 5 mg/kg, na 1 dzień przed zabiegiem.
- Zwierzęta powinny spożywać pokarmy stałe oraz ograniczać zwierzętom wykonywanie zabiegów kosmetycznych, tj. kąpieli olejowych, na 12 godzin przed zabiegiem.
- W ciągu 1 godziny od zabiegu należy wywołać znieczulenie ogólne za pomocą domięśniowo tiletaminy i zolazepamu, podawanych w postaci telazolu w dawce 5 mg/kg mc. oraz domięśniowo ksylazyny, podawanych w dawce 2 mg/kg.
- Po wywołaniu należy podawać podskórnie (SC) buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (SR), podawaną w dawce 0,18 mg/kg.
- Umieść cewnik dożylny usznego i wykonaj szybką sekwencję intubacji w celu umieszczenia rurki dotchawiczej.
- Przymocuj pulsoksymetr z funkcją monitorowania tętna do języka, aby monitorować natlenienie i tętno.
- Ułóż zwierzę w pozycji leżącej i przypnij skórę nad grzbietem za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Przytnij włosy na dużym, obustronnym obszarze rozciągającym się od płaszczyzny strzałkowej linii środkowej do płaszczyzny czołowej linii środkowej i podłużnie od wierzchołka kości krzyżowej do kolców łopatki. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć włosy i swobodnie unoszącą się skórę.
- Wyszoruj przycięty obszar do 3 razy ciepłą wodą z mydłem i osusz skórę niestrzępiącym się ręcznikiem.
- Oznacz obustronne anatomiczne punkty orientacyjne za pomocą pisaka chirurgicznego. Zaznacz ostatnie żebra, grzebienie biodrowe, wyrostki kolczyste i wyrostki poprzeczne.
UWAGA: Zaznaczając ostatnie żebra, grzebienie biodrowe i wyrostki poprzeczne, kręgosłup lędźwiowy jest wyznaczany wzdłuż jego górnej, dolnej i bocznej granicy, odpowiednio. Protokół ten został opracowany w celu ułatwienia dostępu i wstrzyknięcia dowolnego badanego DRG odcinka lędźwiowego. Dla porównania, górne grzebienie biodrowe są wyrównane z poziomem kręgów L3 lub L4. - Przykryj zwierzę ciepłym kocem na czas transportu na salę operacyjną.
3. Pozycjonowanie w sali operacyjnej
- Delikatnie podnieś i umieść zwierzę leżące w pozycji leżącej w zmodyfikowanym dużym humanitarnym nosidle dla zwierząt z wyściełanym otworem brzusznym.
UWAGA: Otwór brzuszny pozwala na zmniejszenie ciśnienia w jamie brzusznej podobnie jak rama Wilsona stosowana podczas operacji kręgosłupa u ludzi. To z kolei zmniejsza śródoperacyjne krwawienie z naczyń krwionośnych kręgosłupa. Chusta jest korzystna, ponieważ nogi mogą swobodnie zwisać przez wyściełane otwory, które chronią zwierzę przed uderzeniem w nerwy obwodowe. Ponieważ jednak rama zawiesia jest wykonana z metalu, powinna być wyściełana izolacją, aby uniknąć zwarcia elektrycznego i niezamierzonego poparzenia zwierzęcia. Można umieścić rolkę koca, aby ustawić głowę i szyję w wygodnej pozycji, w zależności od wielkości zwierzęcia. - Utrzymuj znieczulenie ogólne za pomocą 1 - 3% wziewnego (IH) izofluranu, miareczkowanego do uzyskania efektu. Zwilż oczy maścią okulistyczną i delikatnie zaklej je taśmą.
- Umieść linie do monitorowania parametrów życiowych, aby udokumentować temperaturę, ciśnienie krwi, tętno i natlenienie. Monitoruj wentylację za pomocą kapnografii.
- Umieść samoprzylepną, jednorazową elektrochirurgiczną elektrodę dyspersyjną na lewej lub prawej łopatce.
- Podawać podgrzane Lactated Ringer jako płyny podtrzymujące przez cewnik do żył usznych. Podawać płyny w ilości 5 - 10 ml/kg/h.
- Umieść urządzenie grzewcze z wymuszonym obiegiem powietrza na odcinku piersiowym i szyjnym i unikaj zakrywania ostatnich żeber.
4. Sterylne przygotowanie pola operacyjnego do wstrzyknięcia lewostronnego
UWAGA: Od tego momentu postępuj w ściśle sterylny sposób.
- Przygotować skórę przylegającą do odcinka lędźwiowego kręgosłupa, zaczynając od szerokiej aplikacji 0,7% jodu, povacrylexu i 74% alkoholu izopropylowego zgodnie z zaleceniami producenta. Aby upewnić się, że igła prowadząca może być później umieszczona w sterylny sposób, należy lateralizować aplikację na bok planowanego wstrzyknięcia, rozciągając antyseptykę w kierunku płaszczyzny środkowej korony poza zaznaczone wyrostki poprzeczne.
- Umieść jednorazowe ręczniki chirurgiczne w prostokątny sposób, aby obrysować planowane miejsce nacięcia, które znajduje się nad linią środkową wzdłuż zaznaczonych wyrostków kolczystych lędźwiowych.
- Nałóż samoprzylepną obsuwę antybakteryjną na ręczniki operacyjne i odsłoniętą skórę. Zaciśnij zasłony na miejscu i wysuń krawędź draperii poza pole operacyjne.
- Przymocuj pionową zasłonę do słupów u wezgłowia zawiesia między polem operacyjnym a technikiem monitorującym.
- Zabezpiecz linie do ssania i elektrochirurgii w polu operacyjnym, zaciskając się na sterylnych serwetach. Przełóż wolne końce rurek i drutów poza sterylne pole.
5. Nacięcie skóry i rozwarstwienie podokostnowe
- Zbadaj palpacyjnie wyrostki kolczyste lędźwiowe wzdłuż linii środkowej i zidentyfikuj 3 kolejne poziomy kręgów.
- Użyj skalpela #15, aby otworzyć strzałkowe nacięcie o długości 8 - 12 cm w linii środkowej przez naciętą zasłonę bezpośrednio za wyrostkami kolczystymi. Utrzymuj hemostazę za pomocą tamponady z gazy i elektrochirurgii monopolarnej.
UWAGA: Należy uważać, aby nie odchylać się od linii środkowej, ponieważ nacięcie jest postępowe w kierunku przednim, ponieważ ogranicza to krwawienie z mięśni przykręgosłupowych. Okresowe badanie palpacyjne wyrostków kolczystych ułatwia postęp. Samozabezpieczające się retraktory Weitlanera, Meyerdinga lub Gelpiego można umieszczać i przestawiać w razie potrzeby, aby ułatwić preparację. Ssanie służy do utrzymania widoczności. - Wypreparuj tkankę podskórną i tłuszcz za pomocą elektrochirurgii monopolarnej, aż do osiągnięcia powięzi piersiowo-lędźwiowej. Zbadaj palpacyjnie wyrostki kolczyste głęboko do powięzi piersiowo-lędźwiowej i przetnij powięź wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić więzadło nadkolcowe rozciągające się między wyrostkami kolczystymi.
UWAGA: Powięź piersiowo-lędźwiowa jest identyfikowana jako zorganizowana, rozcięgnowa osłonka z ziarnem tkanki łącznej, które przeplata się w kierunku ukośnym, bocznym do przyśrodkowego. W tym momencie nacięcie można wydłużyć w kierunku górnym lub dolnym, aby zapewnić, że 3 wyrostki kolczyste są w pełni widoczne, a najbardziej środkowy wyrostek kolczysty jest wyrównany w środku pola rozwarstwienia. - Użyj ostrza #15, aby umieścić głębokie nacięcie przystrzałkowe o głębokości 2 mm przez więzadło nadkolcowe za każdym wyrostkiem kolczystym. Umieść każde nacięcie wzdłuż lewej jednej trzeciej tylnej powierzchni wyrostka kolczystego.
- Delikatnie zwolnij więzadło nadkolcowe na każdym poziomie wzdłuż każdego nacięcia za pomocą 5-milimetrowego podnośnika Freer.
- Zidentyfikuj płaszczyznę podokostnową i przeprowadź sekcję w tej płaszczyźnie wzdłuż bocznej powierzchni każdego wyrostka kolczystego.
- Wykonaj rozwarstwienie podokostnowe w każdym wyrostku kolczystym w sposób równoległy, aby zapewnić uzyskanie delikatnego, równomiernego rozwarstwienia.
- Naciąć przyczep mięśnia przykręgosłupowego wzdłuż przestrzeni międzykolcowych za pomocą elektrochirurgii monopolarnej w połączeniu z rozwarstwieniem podokostnowym.
- Zidentyfikuj blaszkę na każdym poziomie i kontynuuj boczną sekcję podokostnową, aby dotrzeć do bocznej granicy 2 stawów zygapophyseal, które łączą 3 odsłonięte kręgi i dotrzeć do bocznej krawędzi blaszki między stawami, zwanej pars interarticularis.
UWAGA: Pars interarticularis to tylna granica otworu międzykręgowego, w którym znajduje się DRG. Czasami mała żyła powstaje z otworu znajdującego się na tylnej powierzchni blaszki. Żyły te mają tendencję do pękania podczas rozwarstwienia podokostnowego. Hemostazę można łatwo osiągnąć, stosując kombinację elektrochirurgii bipolarnej i wosku kostnego nałożonego na otwór.
6. Laminotomia jednopoziomowa
- Zidentyfikuj cel laminotomii jako najbardziej środkową blaszkę znajdującą się między i przyśrodkowo do 2 stawów zygapophyseal.
- Prześledź blaszkę do jej dolnej krawędzi, do punktu tuż przyśrodkowego do przyległego dolnego wyrostka stawowego ogonowego stawu zygapophyseal .
- Użyj 5-milimetrowego elewatora Freer lub kirety, aby dotknąć przejścia między krawędzią blaszki ogonowej a kanałem centralnym.
UWAGA: Należy uważać, aby nie wciskać narzędzia palpacyjnego do przodu, ponieważ spowoduje to kontakt z workiem oponowym i rdzeniem kręgowym. Zauważ, że rdzeń kręgowy u świń rozciąga się poza odcinek lędźwiowy kręgosłupa 18. Krążek międzykręgowy może być użyty do usunięcia dodatkowej tkanki miękkiej pokrywającej ten obszar, aby ułatwić badanie palpacyjne. - Użyj 2-milimetrowego, kątowego kąta gryzienia Kerrison pod kątem 45 stopni, aby wydobyć kość w kawałkach. Usuń kość wzdłuż podstawy wyrostka kolczystego wyżej do poziomu tuż doogonowego do ogonowej powierzchni szypułki i na boki do pełnego zakresu.
- Użyj kątowych rongeurów kostnych, aby pomóc w usuwaniu kości. Pozostaw dolny wyrostek stawowy, który był połączony z blaszką, na miejscu, aż laminotomia zostanie w dużej mierze zakończona.
- Upewnij się, że dolny wyrostek stawowy jest swobodnie ruchomy i przyczepiony tylko przez torebkę stawową zygapophyseal. Naciąć kapsułkę za pomocą ostrza #15 lub #11.
- Usunąć dolny wyrostek stawowy w sposób kawałkowy, ale pozostawić przylegający górny wyrostek stawowy nienaruszony.
UWAGA: Po zakończeniu laminotomii wykonuje się hemostazę za pomocą elektrochirurgii bipolarnej. Elektrochirurgia monopolarna nie jest stosowana ze względu na bliskość struktur nerwowych. Wosk kostny można umieścić wzdłuż miejsc krwawienia z odsłoniętej kości, a wchłanialne gąbki żelatynowe można użyć do uzyskania hemostazy w pobliżu tkanek miękkich. Bawełna jest pomocnym narzędziem do odprowadzania płynu surowiczego i krwi z sekcji.
7. Analiza DRG
- Ewakuuj tłuszcz zewnątrzoponowy w sposób kawałkowy od powierzchownego do głębokiego, zaczynając przyśrodkowo i postępując bocznie. Usuń tłuszcz przez delikatne rozwarstwienie za pomocą dwubiegunowych kleszczy i odsysanie za pomocą 6 - 10 francuskich końcówek ssących Frazier.
UWAGA: Lupa powiększająca lub użycie mikroskopu preparacyjnego jest pomocne w zapewnieniu poziomu szczegółowości potrzebnego do bezpiecznego usunięcia tłuszczu zewnątrzoponowego i uzyskania skrupulatnej hemostazy splotu żylnego zewnątrzoponowego za pomocą elektrochirurgii bipolarnej. - Zidentyfikuj worek oponowy wzdłuż linii środkowej biegnącej w kierunku superoinferior, równolegle do osi nacięcia skóry. Usuń tłuszcz zewnątrzoponowy wzdłuż worka oponowego, aż worek oponowy będzie widoczny, aby spowodować powstanie rękawa korzenia nerwu opony twardej.
- Śledź rękaw opony twardej bocznie i dolnie przez zewnątrzoponowe odprowadzanie tłuszczu, aż do momentu, gdy zobaczysz, że powiększa się wokół DRG.
UWAGA: Zidentyfikuj DRG ze względu na jego owalny kształt i kolor od żółtego do pomarańczowego. W środkowej części odcinka lędźwiowego kręgosłupa DRG ma zwykle rozmiar 4 - 6 mm, jest najdłuższy w kierunku przyśrodkowym do bocznego i znajduje się bezpośrednio poniżej lub 2 - 3 mm przyśrodkowo do odpowiedniej szypułki. , prostokątny haczyk nerwowy może być użyty do delikatnego badania palpacyjnego szypułki. - Ewakuuj tłuszcz zewnątrzoponowy z boku, za DRG, aż do wyświetlenia sąsiedniego nerwu rdzeniowego.
UWAGA: Jeśli dojdzie do durotomii, napraw ją wodoszczelnym zamknięciem za pomocą nylonowego szwu 6-0 i gładkiego mikrowkrętaka igłowego w prostym ściegu do biegania.
8. Wstrzyknięcie DRG
- Użyj igły rdzeniowej o rozmiarze 22, aby poprowadzić trajektorię igły o zwiększonym poborze konwekcyjnym (CED) o rozmiarze 32. Przebij igłę prowadzącą o rozmiarze 22 przez skórę i mięśnie przykręgosłupowe.
UWAGA: Igła CED jest przeznaczona do osiągania konwekcji płynu w tkance, znanej również jako przepływ objętościowy, ze względu na gradienty ciśnienia 19,20. - Skieruj igłę prowadzącą wzdłuż trajektorii, która jest zbliżona do osi podłużnej DRG i powoduje, że końcówka igły wyłania się z bocznej ściany przykręgosłupowej pola rozwarstwienia.
- Dostosuj ścieżkę igły, aż prześwit igły zrówna się ze środkiem DRG.
UWAGA: Igła prowadząca nigdy nie powinna stykać się z DRG. - Pobrać jałowy wstrzykiwacz do jałowej strzykawki i podłączyć strzykawkę do jałowego przewodu infuzyjnego.
- Przymocować rurkę do igły CED i wyjąć strzykawkę z pola sterylnego. Podłączyć strzykawkę do programowalnej pompy strzykawkowej.
UWAGA: Rurki są przygotowane na długość 5 stóp, aby zapewnić zachowanie sterylności i mobilności. Niezwykle ważne jest również, aby do roztworu nie wprowadzano pęcherzyków powietrza. - Wstrzykiwać tak długo, aż na końcu igły CED będzie widoczne odrys.
- Umieść igłę CED w świetle igły prowadzącej i powoli przesuwaj igłę CED, aż wysunie się z końcówki igły prowadzącej. Upewnij się, że DRG nie jest przebity podczas ustawiania igły.
- Dokładnie dostosuj położenie igły prowadzącej wzdłuż długiej osi jej trajektorii, aby określić ostateczne położenie końcówki CED.
- Zabezpiecz igłę prowadzącą i igłę CED razem za pomocą blokujących się piast igieł po osiągnięciu głębokości i wyrównania prowadnicy i igieł CED.
- Upewnij się, że wszystkie połączenia aparatu iniekcyjnego są w pełni zabezpieczone, w tym igła prowadząca, igła CED i podłączony przewód obciążony wstrzykiwaczem.
- Przesuń igłę prowadzącą wzdłuż jej długiej osi, aby zbliżyć się do końcówki igły CED i DRG.
- Nakłuć DRG końcówką igły do pomiaru siły roboczej.
- Zanurzyć końcówkę igły CED w trójwymiarowym środku DRG.
UWAGA: Ponieważ DRG jest trójwymiarową strukturą o zmiennym rozmiarze i kształcie, ekspozycja DRG musi być pełna, aby dokładnie umieścić końcówkę igły CED w prawdziwym środku DRG. Prawdziwe centrum DRG znajduje się na przecięciu jego trzech osi anatomicznych, a mianowicie osi przedniej do tylnej, bocznej do środkowej i górnej do dolnej. - Dostarczyć 100 μl iniekcji metodą CED z podziałką i objętością w 3 krokach.
- W pierwszym etapie dostarczyć 4 μl przy 2 μl/min. Dostarczyć 8 μl przy 4 μl/min w drugim etapie. Dostarczyć 88 μl przy 8 μl/min dla trzeciego i ostatniego kroku.
UWAGA: Pozostaw 3-minutową przerwę między krokami i po ostatnim kroku, aby umożliwić zrównoważenie ciśnienia. - Wyjąć aparat iniekcyjny po ostatnim etapie iniekcji i zrobić 3-minutową przerwę wzdłuż jego długiej osi płynnym, delikatnym ruchem.
UWAGA: W przypadku wstrzykiwanych roztworów, które są bezbarwne, w roztworze znajduje się kolorowy barwnik o stężeniu 0,1% wagowo-objętościowym, aby pomóc w wizualnej ocenie dystrybucji wstrzykniętego 12. Również barwnik życiowy 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) jest zawarty w roztworze w stężeniu 0,25 μg/μL, gdy projekt badania wymaga oceny histologicznej rozkładu iniekcji 5.
9. Zamknięcie
- Zastosuj 3 rundy ciepłego irygacji solą fizjologiczną na miejsce operacji przed zamknięciem, aby zmobilizować i przepłukać miejsce z gruzu, tj. fragmentów kości. Użyj ssania, aby odzyskać sól fizjologiczną i zanieczyszczenia.
UWAGA: Skrupulatna hemostaza jest zapewniona, gdy nawadnianie pozostaje czyste. W tym czasie usuwa się środki hemostatyczne (gąbka żelatynowa) i bawełniany. Upewnij się, że wszystkie materiały i narzędzia zostały usunięte z miejsca nacięcia przed zamknięciem. - Do zamknięcia użyj techniki 3-warstwowej.
- Zszyj powięź piersiowo-lędźwiową za pomocą szwu 0 w prosty, przerywany, nieodwrócony sposób. Umieść ścieg co 5 - 8 mm, aby uzyskać wodoszczelne zamknięcie.
- Zszyj tkankę podskórną za pomocą szwu 2-0 w prosty, przerywany, odwrócony sposób za pomocą szwu umieszczonego co 5 do 8 mm, aby uzyskać odpowiednią wytrzymałość.
- Zamknij skórę za pomocą szwu 0 w sposób prosty, ciągły lub przerywany.
- Użyj licznika igieł, aby upewnić się, że żadne ostre narzędzia nie zostały pominięte.
- Przepłukać skórę solą fizjologiczną, osuszyć skórę i umieścić samoprzylepne paski bandaża prostopadle do nacięcia.
- Umieść gazę na paskach bandaża i przymocuj ostatnią samoprzylepną zasłonę do nacinania antybakteryjnego.
10. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami
- Ekstubować, przykryć ciepłymi kocami i przetransportować zwierzę do rekonwalescencji.
- Postępuj zgodnie ze standardowymi instytucjonalnymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi monitorowania pooperacyjnego i rekonwalescencji po operacji przeżycia. Zwierzę należy obserwować co najmniej co 15 minut aż do odzyskania przytomności, co godzinę aż do osiągnięcia pełnej rekonwalescencji po znieczuleniu, a następnie dwa razy dziennie.
- Leczenie bólu pooperacyjnego należy zapewnić poprzez podawanie domięśniowo lub doustnego karprofenu, podawanego w dawce 4 mg/kg, raz na dobę przez 5 dni, począwszy od dnia pooperacyjnego 0. Buprenorfinę SR należy podawać podskórnie w dawce 0,18 mg/kg raz w 2. dniu po operacji.
- Pooperacyjne leczenie antyseptyczne należy podawać domięśniowo ceftiofur w dawce 5 mg/kg mc. jednorazowo w 4. dniu po operacji.
- Usuń bandaż w 5 - 7 dniu po operacji. Zdejmij szwy po zakończeniu gojenia się rany, zwykle w 10-14 dniu po operacji.
- Humanitarna eutanazja zwierzęcia zgodnie ze standardowymi instytucjonalnymi procedurami operacyjnymi po osiągnięciu punktu końcowego badania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ocena histologiczna rozprzestrzeniania się wstrzykniętego preparatu
Prawidłowe podanie preparatu do zwoju korzeni grzbietowych (DRG) określa się poprzez histologiczną ocenę rozprzestrzeniania się barwnika DAPI. Technika ta polega na umieszczeniu końcówki igły w trójwymiarowym centrum DRG. W związku z tym sukces podania preparatu ocenia się poprzez analizę zakresu barwienia DAPI na przekrojach histologicznych zarówno w pobliżu (centralne przekroje DRG), jak i w oddaleniu (peryferyjne przekroje DRG) od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Staraliśmy się opisać metodę chirurgicznego narażenia na DRG poprzez laminotomię i wstrzyknięcie dozwojowe u zdrowego dużego gatunku zwierząt, w szczególności trzody chlewnej. U gryzoni podobna metoda została szczegółowo opisana 12 i stosowana do dostarczania konwencjonalnych środków farmakologicznych 8,10 i wektorów wirusowych 6,7,9,12
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden; Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tym badaniem.
Podziękowania
Badanie zostało przeprowadzone przy wsparciu Fundacji Rodziny Schulze (dla A.S.B.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Duża humanitarna chusta dla zwierząt | Britz & Firma | 002539 | Zmodyfikowana w celu uwzględnienia apertury brzusznej |
| Adhezyjna elektroda powrotna pacjenta - 9 cali | Medtronic | E7506-System | |
| podgrzewania krwi i płynów Ranger | 3M | 24500-Laktowany | |
| płyn Ringera | Hospira | 0409-7953-09-Urządzenie | |
| do podgrzewania powietrza | Force 3M | 77500- | |
| Roztwór Duraprep z aplikatorem, 26 ml (0,7% jodu povacrylex, 74% alkoholu izopropylowego) | 3M | 8630-Sterylne | |
| jednorazowe ręczniki chirurgiczne | Medline | ||
| MDT2168286-Ioban 2 serwety do nacinania | 3M | 6651EZSB-Jednorazowy | |
| kanister ssący i rurka | Medline | DYND44703H-Przełącznik | |
| przyciskowy elektrochirurgiczny ołówek | monopolarnyMedtronic | E2450H-Drobne | |
| , gładkie, proste, bipolarne kleszcze elektrochirurgiczne, 4 1/2 cala | Bovie | A826 | - |
| #15 ostrze | Miltex | 4-315 | - |
| #11 ostrze | Miltex | 4-311-4 | |
| x 4 gaza chirurgiczna | Dynarex | 3262-Weitlaner | |
| samozabezpieczający się zwijacz, 8 cali | Miltex | 11-618 | - |
| Samozatrzymujący się zwijacz Meyerding, 1 x 2 3/8 cala | Sklar | 42-2078-Gelpi | |
| , 7 cali | Sklar | 60-6570-Freer | |
| winda, 5 mm | Medline | MDS4641518F-Wosk | |
| kostny | Ethicon | W31G-Spurling | |
| krążek międzykręgowy rongeur, 3 mm | Sklar | 42-2852 | - |
| Spurling 45-stopniowy, podgryzający Kerrison rongeur, 2 mm | Medline | MDS4052802-Leksell | |
| kątowy rongeur, 2 mm | Sklar | 40-4097-Gelfoam | |
| , rozmiar 50 | Pfizer | ||
| AZL32301-Cottonoid patty | Końcówka | 8004007-Frazier | |
| , 6 Fr | Sklar | 50-2006-Końcówka | |
| ssąca Frazier, 10 Fr | Sklar | 50-2010-Dandy | |
| hak nerwowy pod kątem prostym | Szew nylonowy Medline | MDS4005220 | |
| , 6-0 | Ethicon | 697G-Castroviejo | |
| gładki uchwyt na mikroigły | Medline | MDG2428614-22 | |
| gauge Igła rdzeniowa z punktem Quinke | Halyard Health | 18397-32 | |
| z blokadą piasty Luer | Zobacz komentarze | n/a | Jak w: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimalnie inwazyjne dostarczanie leków biologicznych wspomaganych konwekcją do zwojów korzenia grzbietowego: walidacja w modelu świni i modelowanie prospektywne u ludzi. Uwaga techniczna. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014). |
| Rurka polietylenowa, 5 stóp | Scientific Commodities | BB31695-PE/05-Monoject | |
| strzykawka, 3 ml | Pompa | ||
| SY15352-NanoJet | Chemyx | 10050-DAPI | |
| Sigma-Aldrich | D9542-Fast | ||
| Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-Strzykawka | |
| irygacji żarówek | Medline | DYND20125-Kleszcze | |
| Adson o drobnych zębach | Szew | ||
| MDS1000212-Vicryl, 0 | Ethicon | J603H-Szew | |
| Vicryl, 2-0 | Ethicon | J317H-Licznik | |
| igieł | Medline | ||
| NC20FBRGS-Steri-strip zamknięcie skóry, 1/2x4 cal | 3M | R1547 | - |
Bibliografia
- Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57 (1), 1-164 (1999).
- Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. , (2016).
- Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91 (4), 522-533 (2016).
- Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. , Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
- Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
- Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1024-1031 (2013).
- Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14 (9), 897-906 (2003).
- Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
- Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
- Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. , Thieme. (2010).
- Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251(2016).
- Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23 (3), 319-335 (1994).
- Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371(2012).
- Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30 (3), 142-159 (2013).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36 (3), e164(2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71 (2), 405-416 (2012).
- Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16 (1), 61-69 (1991).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122 (3), 697-706 (2015).
- Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27 (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
- Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121 (4), 851-858 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
