Method Article

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki norowirus powoduje znaczne straty w zdrowiu publicznym i gospodarce na całym świecie. Pojawiające się postępy w uprawie in vitro nie mają jeszcze zastosowania do rutynowego wykrywania wirusa. Obecne techniki wykrywania i kwantyfikacji, które opierają się głównie na amplifikacji kwasów nukleinowych, nie rozróżniają zakaźnych i niezakaźnych cząstek wirusa. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie szczegółowych informacji na temat najnowszych postępów w technikach stosowanych łącznie w celu uzyskania dalszych informacji na temat statusu zakaźności cząstek wirusa. Jedna z technik polega na ocenie wiązania aptameru ssDNA norowirusa z kapsydami. Aptamery mają tę zaletę, że są łatwe do syntezy i modyfikacji, a także niedrogie i stabilne. Inna technika, dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), ma tę zaletę, że obserwuje zachowanie kapsydu w roztworze. Mikroskopia elektronowa pozwala na wizualizację integralności strukturalnej kapsydów wirusa. Chociaż jest obiecująca, każda technika ma pewne wady, takie jak niespecyficzne wiązanie aptamerów z dodatnio naładowanymi cząsteczkami z matryc próbek, wymóg oczyszczonego kapsydu dla DLS i słaba czułość dla mikroskopii elektronowej. Niemniej jednak, gdy techniki te są stosowane łącznie, uzyskane dane dostarczają bardziej wyczerpujących informacji na temat integralności kapsydu norowirusa, które można wykorzystać do wnioskowania o zakaźności, informacji, które są niezbędne do dokładnej oceny metod inaktywacji lub interpretacji wykrywania wirusa. W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania tych metod do rozróżniania zakaźnych cząstek ludzkiego norowirusa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki norowirus jest odpowiedzialny za znaczne obciążenie zdrowia publicznego na całym świecie, powodując około 685 milionów chorób i 212 000 zgonów rocznie1, co kosztuje miliardy dolarów2,3. Obecnie wykrywanie i kwantyfikacja norowirusów obejmuje amplifikację genomu i/lub platformy oparte na ligandach. Ta pierwsza opcja jest ogólnie preferowana, ponieważ jest bardziej czuła, dostarcza informacji ilościowych i ma ogólnie mniejsze ryzyko wyników fałszywie dodatnich4. Najpowszechniejszą techniką amplifikacji genomu w wykrywaniu i kwantyfikacji norowirusów jest ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR). Ponieważ sam RT-qPCR jest ukierunkowany na niewielki segment ludzkiego genomu norowirusa i amplifikuje go, nie jest w stanie rozróżnić cząstek zakaźnych i niezakaźnych, ponieważ wolne genomowe RNA, uszkodzone kapsydy zawierające genomy i kapsydy ze śmiertelnie zmutowanymi/skróconymi genomami mogą być nadal amplifikowane przez RT-qPCR. Chociaż niedawno zgłoszono dwie nowe techniki hodowli in vitro dla ludzkiego norowirusa5,6, obie nadal opierają się na RT-qPCR do kwantyfikacji wirusa i nie są jeszcze wykonalnymi metodami do rutynowych testów klinicznych/środowiskowych dla ludzkich norowirusów. W związku z tym RT-qPCR pozostaje złotym standardem w testach klinicznych/środowiskowych.

Inne metody in vitro zostały opracowane w celu lepszego oszacowania statusu zakaźności cząsteczek norowirusa. Metody te można ogólnie sklasyfikować jako te, które dotyczą integralności kapsydu norowirusa i te, które oceniają integralność genomu. Pierwsze podejście jest bardziej popularne. Powszechnie stosowaną metodą jest wstępne leczenie RNazą przed ekstrakcją genomowego RNA wirusa, jednak nie uwzględnia to cząstek wirusa, które pozostają nienaruszone, ale nie mają zdolności wiązania receptorów/kofaktorów gospodarza, a także cząstek wirusa, które uległy śmiertelnej mutacji lub mają skrócone lub marginalnie uszkodzone genomy7. Integralność kapsydu można również ocenić na podstawie zdolności wirusa do wiązania się z ludzkimi koreceptorami/kofaktorami norowirusa, które są węglowodanami znanymi jako antygeny grup krwi (HBGA). HBGA są obecne w komórkach nabłonka jelitowego gospodarza jako część glikoprotein lub glikolipidów (wśród wielu innych tkanek) i mogą być wydzielane w płynach ustrojowych, takich jak ślina. Wykazano również, że bakterie jelitowe zawierające na swojej powierzchni substancje podobne do HBGA wiążą ludzkiego norowirusa8,9,10, a takie interakcje mogą sprzyjać infekcji norowirusem5. Podstawowa koncepcja wykorzystania wiązania HBGA polega na tym, że tylko cząsteczki wirusa zdolne do wiązania domniemanego receptora / kofaktora byłyby zdolne do infekowania komórek. Liczne badania sugerują, że wiązanie HBGA na podstawie koralików poprzedzające amplifikację kwasu nukleinowego jest obiecującą metodą dyskryminacji zakaźności11,12,13,14,15,16. Głównym wyzwaniem związanym z HBGA jest to, że żaden pojedynczy typ HBGA nie jest w stanie związać wszystkich ludzkich genotypów norowirusa. Aby temu zaradzić, mucyna żołądkowa świń, która zawiera HBGA, została użyta zamiast oczyszczonych węglowodanów HBGA w interesie łatwości syntezy, spójności i obniżenia kosztów.

Niedawna publikacja Moore'a i wsp.17 wprowadził zestaw nowych technik szacowania integralności ludzkiego kapsydu norowirusa. Zamiast HBGA, Moore i wsp.17 zbadał wiązanie szeroko reaktywnego aptamera kwasu nukleinowego (M6-2)18 i szeroko reaktywnego przeciwciała monoklonalnego (NS14)19 z poddanymi obróbce termicznej kapsydami norowirusa z Sydney (cząstkami wirusopodobnymi lub VLP) i porównał to z wiązaniem z syntetycznymi HBGA. Aptamery kwasów nukleinowych to krótkie (~20 - 80 nt) jednoniciowe kwasy nukleinowe (ssDNA lub RNA), które w wyniku swojej sekwencji składają się w unikalne trójwymiarowe struktury i wiążą cel. Ponieważ są to kwasy nukleinowe, są mniej kosztowne; łatwo syntetyzowany chemicznie, oczyszczany i modyfikowany; i stabilny na ciepło. Istnieje kilka doniesień o aptamerach generowanych przeciwko norowirusom, a niektóre z nich wykazują szeroką reaktywność na różne szczepy18,20,21,22. Na przykład Moore i wsp.17 wykazał, że aptamer M6-2 wiąże się z oczyszczonymi, złożonymi ludzkimi kapsydami norowirusa (VLP) i zachowuje się podobnie do HBGA w zależności od kapsydu wirusa, aby utrzymać strukturę białka wyższego rzędu (np. drugorzędową i trzeciorzędową) do wystąpienia wiązania. Z drugiej strony, znaczna część wiązania norowirusa VLP z przeciwciałem NS14 pozostała po całkowitej denaturacji kapsydów. Ocena wiązania norowirusa w badaniu Moore'a i wsp.17 został wykonany przy użyciu prostej, opartej na płytce metody podobnej do ELISA, z wyjątkiem tego, że aptamery są używane zamiast przeciwciał (stąd metoda została nazwana ELASA). Ta wysokoprzepustowa metoda eksperymentalna została wykorzystana do oceny wpływu różnych metod leczenia na kapsyd norowirusa, co jest cenne dla zrozumienia mechanizmu inaktywacji wirusa po ekspozycji na fizyczne lub chemiczne czynniki stresogenne. Jednak jedną z wad tej metody jest mniejsza czułość i brak tolerancji dla zanieczyszczeń związanych z matrycą na wyższych poziomach, które powodują niespecyficzne wiązanie przez aptamery.

Moore et al.17 użył innej metody, dynamicznego rozpraszania światła (DLS), do monitorowania agregacji cząstek wirusa w odpowiedzi na obróbkę cieplną. DLS jest powszechnie używany do oceny wielkości zawiesin nanocząstek i został rozszerzony na białka23,24 i wirusy25,26,27. Intensywność światła rozproszonego przez cząstki w roztworze zmienia się w funkcji wielkości cząstek, co pozwala na obliczenie współczynnika dyfuzji, a następnie średnicy cząstek przy użyciu dobrze znanych wzorów. Technika DLS pozwala na rozróżnienie średnicy hydrodynamicznej rozproszonych cząstek aż do nanoskali, co pozwala na wykrywanie rozproszonych wirusów, pojedynczych białek kapsydu lub dimerów oraz agregatów wirusów na podstawie size27. Agregacja wirusa, reprezentowana przez wzrost wielkości cząstek, wskazuje na utratę integralności kapsydu. Gdy kapsyd ulega denaturacji, a jego struktura zostaje zakłócona, pozostałości hydrofobowe zostają odsłonięte i powodują sklejanie się cząstek i tworzenie agregatów. DLS może być używany do pomiaru wielkości cząstek po określonym traktowaniu lub kinetyki agregacji w czasie rzeczywistym17,28. Metoda ta ma tę zaletę, że umożliwia obserwację zachowania kapsydu w roztworze, ale wymaga wysokich stężeń oczyszczonego kapsydu, który może nie być w pełni reprezentatywny dla wirusa w jego naturalnym stanie.

Ostatnia metoda wykorzystana przez Moore'a i wsp.17 to transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Chociaż metoda ta nie jest czuła i nie daje danych ilościowych, pozwala na wizualizację wpływu różnych zabiegów na strukturę kapsydu wirusa. Chociaż nie jest to jeszcze idealne rozwiązanie w warunkach klinicznych/środowiskowych, zastosowanie tych metod w połączeniu jest cenne w zrozumieniu inaktywacji ludzkiego norowirusa. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów dla metod przygotowania testu wiązania na płytkach (ELASA), DLS i TEM stosowanych do badania wpływu obróbki cieplnej na kapsyd norowirusa w kontekście wpływu leczenia na integralność kapsydu, jak przedstawiono w Moore i wsp.17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test wiązania na płytce do oceny utraty struktury kapsydu norowirusa wyższego rzędu

UWAGA: Opublikowano bardzo podobny protokół ELASA do tego przedstawionego tutaj29, a podobne testy ELASA zostały wcześniej zgłoszone jako część artykułów naukowych w innych miejscach17,18,22.

  1. Obróbka cieplna ludzkiego norowirusa GII.4 Kapsydy Sydney
    1. Otrzymać oczyszczone białko kapsydu głównego ludzkiego norowirusa (VP1) GII.4 Sydney (Accession: JX459908) złożone w kapsydy.
      UWAGA: Kapsydy w badaniu uzyskano dzięki uprzejmości R. Atmara (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
    2. Rozcieńczyć kapsydy do 50 μg/ml w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,2) do maksymalnej objętości 15 μl w pojedynczych probówkach PCR z nakrętką. Upewnij się, że probówka zawiera co najmniej 600 ng kapsydu. Upewnij się, że w każdej kombinacji ligandów terapeutycznych znajduje się 600 ng kapsydu.
    3. Rozgrzej termocykler do żądanej obróbki cieplnej.
      UWAGA: Do celów niniejszego protokołu wybrano leczenie w temperaturze 68 °C przez różne czasy (0 - 25 min).
    4. Rozgrzej dodatkowy termocykler do 4 °C w celu natychmiastowego schłodzenia. Dodaj probówki z roztworem kapsydu do termocyklera na żądany czas. Natychmiast przenieść do wstępnie schłodzonego cyklera o temperaturze 4 °C na 5 minut po podgrzaniu.
      1. Włączyć 95 °C na 5-minutowy zabieg jako kontrolę denaturowanego kapsydu. Włączyć niepoddanych działaniu substancji (23 °C) roztwór kapsydu jako kontrolę dodatnią. Włączyć PBS bez kapsydu jako dodatkową kontrolę ujemną.
    5. Krótko odwirować w wirówce, aby wszystkie kropelki opadły na dno probówki i rozcieńczyć poddane działaniu kapsydu roztwory kapsydu w PBS do 3 μg/ml. Upewnij się, że jest co najmniej 200 μl rozcieńczonego, poddanego działaniu środka kapsydu (100 μl/basenik).
  2. Nałóż 100 μl roztworu kapsydu do każdej studzienki, upewniając się, że są co najmniej dwie studzienki na zabieg. Dodatkowo dołącz 2 studzienki kontrolne ze 100 μl PBS dla każdego liganda; Zapewnia to absorbancję tła testu. Przykryj płytkę pokrywką, uszczelnij krawędzie folią parafinową w celu zmniejszenia parowania i pozostaw na noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C lub na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować bufor blokujący, wytwarzając 5% odtłuszczonej suchej masy mlecznej (w/v) w PBS z 0,05% Tween 20 (PBST).
  4. Usunąć poddane działaniu kapsydu roztwory kapsydu z płytki. Dodać 200 μl/studzienkę buforu blokującego. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc, szczelnie zamknięty w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj roztwory wiążące ligand dla biotynylowanego aptameru M6-218,29 i biotynylowanej syntetycznej grupy krwi HBGA A lub biotynylowanej grupy H.
    1. Rozcieńczyć biotynylowany aptamer do 1 μM w wodzie wolnej od nukleaz. Upewnij się, że roztwór jest wystarczający na 200 μl łącznie na każdy zabieg. Rozcieńczyć wybrany biotynylowany HBGA do 30 μg/ml w buforze blokującym. Upewnij się, że roztwór jest wystarczający na 200 μl całkowitej objętości dla każdego zabiegu.
      UWAGA: Aby zużyć mniej HBGA, można zastąpić 10 μg/ml HBGA w 0,25% odtłuszczonym mleku-PBST. Stężenia zarówno biotynylowanego M6-2, jak i HBGA zostały wcześniej zoptymalizowane i zgłoszone.
  6. Usunąć bufor blokujący i przemyć płytki 3 razy 200 μl/basenik PBST. Poklep talerz do góry nogami na sterylnych ręcznikach papierowych, aby wysuszyć resztki wilgoci.
  7. Dodać 100 μl/studzienkę roztworów wiążących ligandy, upewniając się, że na kombinację ligandów do obróbki cieplnej przypadają 2 dołki. Inkubować płytkę przykrytą pokrywką na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 60 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Należy pamiętać o dołączeniu 2 studzienek po 2 kapsydy niepoddane działaniu substancji i całkowicie zdenaturowanych kapsydów dla każdego liganda jako odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej. Dodatkowo dołącz 2 studzienki "bez kapsydu" dla każdego liganda jako kontrolkę tła płytki.
  8. Usunąć roztwory ligandów i przemyć studzienki 3 razy 200 μl/studzienkę PBST. Poklep talerz do góry nogami na sterylnych ręcznikach papierowych, aby wysuszyć resztki wilgoci.
  9. Dodać 100 μl/studzienkę roztworu 0,2 μg/ml peroksydazy streptawidynowo-chrzanowej w PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce orbitalnej.
    UWAGA: Różne koniugaty streptawidyny i peroksydazy chrzanowej będą miały różne stężenia. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać idealny zakres stężeń dla aplikacji enzymu ELISA i upewnij się, że jest on optymalny.
  10. Usuń sprzężony roztwór. Przemyć 3 razy 200 μl/studzienkę PBST. Poklep talerz do góry nogami na sterylnych ręcznikach papierowych, aby wysuszyć resztki wilgoci.
  11. Dodać 100 μl/studzienkę substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i pozostawić kolor do rozwinięcia się przez 5 - 15 minut. Obserwuj studzienki kontroli ujemnej dla dowolnego koloru i upewnij się, że stale rozwijasz się przez ten sam czas między powtórzonymi płytkami. Należy również pamiętać o zakresie absorbancji używanego czytnika płytek.
    UWAGA: Czasy wywoływania mogą się różnić w zależności od jakości użytych ligandów/odczynników.
  12. Zatrzymać rozwój reakcji za pomocą 100 μL/studzienkę 1M kwasu fosforowego. Natychmiast odczytać płytkę przy 450 nm. Zapisz dane.
    UWAGA: Wprowadzenie kwasu na ogół drastycznie spowalnia reakcję, ale nie zatrzymuje jej całkowicie. Nie pozostawiaj zamkniętej płytki na dłuższy czas przed odczytaniem absorbancji.

2. Analiza wyników testów na płytkach

  1. Zapisz surowe dane absorbancji w arkuszu kalkulacyjnym. Uzyskać średnie absorbancje dla każdej studzienki w parze z określonym traktowaniem i ligandem. Tych średnich należy używać we wszystkich kolejnych analizach.
    UWAGA: Porównaj absorbancje obu studzienek, aby upewnić się, że żadna para studzienek nie ma znacząco rozbieżnych wartości.
  2. Aby przeanalizować bezwzględną integralność kapsydu (wszystkie wiązania), odejmij surową absorbancję kontroli "bez kapsydu" od każdej innej wartości absorbancji próbki.
    UWAGA: Alternatywnie, utrata wiązania spowodowana utratą struktury wyższego rzędu (drugorzędnego, trzeciorzędowego, czwartorzędowego) może być analizowana bezpośrednio. Zamiast odejmować absorbancję kontroli ujemnej (bez kapsydu), należy odjąć wartość całkowicie zdenaturowanej kontroli kapsydu. To usuwa cały sygnał wiązania spowodowany niespecyficznym wiązaniem z aparatem, a także wiązaniem spowodowanym sekwencją kapsydu. HBGA i aptamer M6-2 wykazują niewielkie wiązanie z całkowicie zdenaturowanym kapsydem, więc obie metody dają podobne wyniki. Fałszywie dodatni sygnał przypisywany niespecyficznemu wiązaniu aptamerów musi być brany pod uwagę przy wyborze analizy, którą należy zastosować.
  3. W przypadku ujemnych lub denaturowanych absorbancji kontrolnych należy podzielić absorbancje poddane działaniu substancji przez odpowiednie dodatnie (bez poddawania działaniu substancji) absorbancje kontrolne i pomnożyć przez 100. Zapewnia to procentowy udział sygnału kapsydu poddanego działaniu środka w stosunku do nieleczonej kontroli.
  4. Aby oszacować stopień sygnału wiązania dla każdego ligandu, który można przypisać sekwencji kapsydu, należy odjąć kontrolę ujemną "bez kapsydu" od początkowych absorbancji i przyjąć skorygowaną absorbancję denaturowanego kapsydu. Podziel to przez skorygowaną absorbancję dodatniego sygnału kontrolnego i pomnóż przez 100. Daje to pozorny procent sygnału spowodowany wiązaniem liganda ze zdenaturowaną sekwencją kapsydu/kapsydu.

3. DLS do wykrywania agregacji wirusów po obróbce cieplnej

UWAGA: Poniższe kroki mogą być specyficzne dla używanego oprogramowania i instrumentu, ale mogą być dostosowane i zastosowane do podobnych urządzeń.

  1. Utwórz nowy rozmiar SOP w oprogramowaniu przyrządu DLS, korzystając z: Materiał = Białko, Dyspergator = PBS, Temperatura = 25 °C, Czas równowagi = 0 sekund, Typ ogniwa = kuweta jednorazowa (mała objętość, ZEN0040), Kąt pomiaru = 173° Rozproszenie wsteczne, Czas pomiaru = automatyczny, Liczba pomiarów = 3, Opóźnienie między pomiarami = 0 sekund, Przetwarzanie danych: Model analizy = Ogólnego przeznaczenia (normalna rozdzielczość). Użyj ustawień domyślnych dla wszystkich innych parametrów.
  2. Wybierz zieloną strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu i nazwij przykład.
  3. Wykonaj kroki od 1.1.1 do 1.1.4 w celu obróbki cieplnej VLP.
  4. Rozcieńczyć VLP poddane obróbce cieplnej w stosunku 1:10 w 1x PBS do końcowego stężenia 5 μg/ml. (Opcjonalnie) Przefiltrować próbkę z porami o wielkości 1 μm, aby usunąć cząsteczki kurzu; DLS jest bardzo wrażliwy na kurz, ponieważ duże cząstki rozpraszają znacznie więcej światła niż małe.
  5. Przenieś 50 μl rozcieńczonych VLP do jednorazowej kuwety o małej objętości. Włóż kuwetę do sample komory przyrządu.
  6. Rozpocznij bieg i skorzystaj z zakładek "Correlogram", "Dopasowanie kumulantów" i "Porady ekspertów", aby ocenić jakość danych.
    1. Podczas cyklu sprawdź, czy wartość wskaźnika polidyspersyjności jest mniejsza niż 0,3, co odpowiada pomiarowi jakości. W zakładce "Multi-view" upewnij się, że współczynnik korelacji jest stały i bliski, ale nie większy niż 1, w krótkim czasie, a później gwałtownie spada do 0, co jest charakterystyczne dla wielkości cząstek. Skorzystaj z zakładki "Porady eksperta", aby uzyskać informacje zwrotne na temat jakości danych podczas pomiarów.
    2. Po zakończeniu pomiaru sprawdź ponownie, czy wartość wskaźnika polidyspersyjności jest mniejsza niż 0,3. Upewnij się, że linia dopasowania kumulantów ściśle przylega do punktów danych na karcie "Dopasowanie kumulantów".
  7. Przyjmuje się średnią średnicy cząstek Z podawaną dla każdego pomiaru jako wielkość cząstek w każdej próbce. Wykreślić średnicę w nm w funkcji temperatury w °C.

4. DLS do wykrywania agregacji wirusów w czasie rzeczywistym

UWAGA: Poniższe kroki mogą być specyficzne dla używanego oprogramowania i instrumentu, ale mogą być dostosowane i zastosowane do podobnych urządzeń.

  1. Utwórz nowy rozmiar SOP w oprogramowaniu przyrządu DLS za pomocą: Materiał = Białko, Dyspergator = PBS, Temperatura = zgodnie z życzeniem, Czas równowagi = 0 sekund, Typ ogniwa = kuweta kwarcowa, Kąt pomiaru = 173° Rozproszenie wsteczne, Czas pomiaru = automatyczny, Liczba pomiarów = 50 (może być zwiększona lub zmniejszona w zależności od szybkości agregacji), Opóźnienie między pomiarami = 0 sekund, Przetwarzanie danych: Model analizy = Wiele wąskich trybów (wysoka rozdzielczość). Użyj ustawień domyślnych dla wszystkich innych parametrów.
  2. Wybierz strzałkę uruchamiania w oprogramowaniu, aby otworzyć i nazwać nową próbkę i pozwolić instrumentowi osiągnąć równowagę temperatury.
  3. Zawiesić VLP w 1X PBS w probówce do mikrowirówki o stężeniu 5 μg/ml i objętości między 200 - 500 μL. Odwirować zawiesinę.
  4. Wiruj zawieszenie VLP przez 5 - 10 s w wirówce stołowej w celu odgazowania. Pomaga to zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków podczas obróbki cieplnej, które zakłócają pomiary wielkości.
  5. Przenieś zawiesinę VLP do kuwety kwarcowej o małej objętości - unikaj pęcherzyków i powoli pipetuj przy ściance kuwety. Gdy przyrząd osiągnie równowagę temperaturową, włóż kuwetę do komory na próbkę.
  6. Odczekaj 10 sekund, aż temperatura próbki się zrównoważy, a następnie rozpocznij bieg. Uruchom stoper na początku biegu. Zatrzymaj minutnik na końcu pierwszego pomiaru. Potraktuj ten czas jako pierwszy punkt czasowy. Uzyskiwanie kolejnych punktów czasowych z czasów pomiarów zarejestrowanych przez oprogramowanie.
  7. Rozpocznij przebieg i monitoruj korelogram, dopasowanie dystrybucji i porady ekspertów, aby ocenić jakość danych.
    UWAGA: PDI dla tych pomiarów niekoniecznie będzie mniejsze niż 0,3, ponieważ oczekuje się, że próbka będzie polidyspersyjna podczas agregacji.
    1. Upewnij się, że współczynnik korelacji jest stały i bliski, ale nie większy niż 1 w krótkim czasie, i gwałtownie spada w jednym lub kilku późniejszych momentach, charakterystycznych dla wielkości cząstek.
    2. Upewnij się, że linia dopasowania rozkładu ściśle podąża za punktami danych.
  8. Przeanalizuj dane dotyczące rozmiaru.
    1. Określ każdy punkt czasowy na podstawie różnicy czasu między każdym pomiarem a początkowym punktem czasowym. Nie wszystkie czasy pomiaru są dokładnie takie same.
    2. Korzystając z rozkładu intensywności, zapisz rozmiar pików z największymi obszarami dla każdego pomiaru/punktu czasowego.
    3. Wykreślić średnice pików w nm w funkcji czasu w min.

5. Przygotowanie próbki TEM

  1. Uzyskać kratki z włókna węglowego (nikiel) przeznaczone do TEM.
    UWAGA: Skonsultuj się z podstawową placówką w sprawie zalecanych odczynników i obchodzenia się z nimi do użytku z mikroskopem w placówce. Pamiętaj, aby przechowywać kratki w pudełku zawierającym środek osuszający lub komorze próżniowej, aby zminimalizować narażenie na wilgoć.
  2. Rozerwij kawałki bibuły filtracyjnej o wymiarach około 5 cm x 5 cm. Zaopatrz się w szklane szalki Petriego i odpowiednią samozamykającą się pęsetę odwrotną przeznaczoną do użytku w mikroskopii.
  3. Wytnij około 2,5 cm x 5 cm kawałek folii parafinowej. Umieść na blacie.
  4. Obróbka cieplna norowirusa GII.4 Kapsydy Sydney
    1. Postępuj zgodnie z procedurą obróbki cieplnej dokładnie tak, jak opisano powyżej w krokach 1.1.1 - 1.1.5, z wyjątkiem: użyj 10 mM HEPES (pH 7,4) do obróbki zamiast PBS i nie rozcieńczaj dalej kapsydów po zabiegu (utrzymuj roztwór na poziomie 50 μg/ml). Odpipetować całą kroplę ~15 μl poddanego działaniu kapsydu na folię parafinową.
  5. Chwyć krawędź siatki pęsetą, pozwalając im zamknąć się na krawędzi, aby przytrzymać siatkę, i umieść siatkę stroną węglową do dołu na kropli potraktowanego roztworu. Pozostawić do inkubacji na 10 minut, aby kapsyd mógł przyczepić się do siatki.
    1. W zależności od czystości preparatu kapsydu, w razie potrzeby dodać popłuczyny 10 mM roztworu HEPES w postaci kropelek o objętości 10-15 μl umieszczonych w jednej linii za kroplą kapsydu poddanej działaniu kapsydu.
    2. Po 10 minutach podnieś siatkę z kroplą. Umieść siatkę prawie prostopadle do kawałka bibuły filtracyjnej, aby odprowadzić kroplę. Zbierz kroplę 10 - 15 μl buforu HEPES za pomocą siatki, przytrzymaj przez 30 sekund, a następnie odchwać kolejnym kawałkiem bibuły filtracyjnej do umycia.
  6. Umieść 15 μl kropli 2% roztworu octanu uranylu na folii parafinowej w pustym miejscu.
    1. Podnieś kroplę octanu uranylu za pomocą siatki i przytrzymaj przez 45 sekund. Odchować octan uranylu, upewniając się, że usunąłeś większość roztworu. Umieść siatkę stroną węglową do góry na kawałku bibuły filtracyjnej, uważając, aby siatka nie "przykleiła się" do wilgoci na pęsetze. Umieść bibułę filtracyjną z siatką na otwartej szklanej szalce Petriego.
      UWAGA: Nie używaj plastikowych szalek Petriego, ponieważ siatki zostaną do nich przyciągnięte elektrostatycznie i przykleją się do naczynia.
  7. Powtórz dla wszystkich zabiegów. Umieść połówki szalki Petriego wraz z kratkami w eksykatorze na noc do wyschnięcia przed obserwacją za pomocą TEM.
  8. Skonsultuj się z zakładem mikroskopowym w odpowiedniej instytucji w sprawie obserwacji przygotowanych siatek. Niektóre obiekty pozwalają użytkownikowi na przeszkolenie w zakresie obsługi przyrządu w jego placówce. Szczegółowe informacje na temat konfiguracji i obserwacji konkretnego mikroskopu wykraczają poza zakres tego artykułu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność strukturalna ludzkich norowirusów GII.4 Kapsydy Sydney (VLP) zostały ocenione przy użyciu kilku nowatorskich metod, przedstawionych przez Moore'a i wsp.17. Po pierwsze, przeprowadzono eksperyment, w którym porównano integralność kapsydów w funkcji ich zdolności do wiązania domniemanego receptora/kofaktora (HBGA) lub aptameru ssDNA (M6-2) (Rysunek 1). Przedstawione wyniki zostały wcześniej zaprezentowane przez Moore'a i ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół i techniki umożliwiają ocenę integralności/funkcjonalności ludzkiego norowirusa kapsydu. Metody te mogą być wykorzystane do uzyskania mechanistycznego wglądu w efekty leczenia inaktywacją wirusa i mogą potencjalnie uzupełnić bardziej tradycyjne metody oceny inaktywacji, takie jak RT-qPCR lub test płytki nazębnej. Na przykład ocena chemicznej lub fizycznej inaktywacji za pomocą samego testu płytki miażdżycowej dostarcza miary stopnia inaktywacji wirusa, ale nie mechanizmu leżącego u podstaw tej inak...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Konkurencyjny Grant nr 2011-68003-30395 od Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa poprzez projekt NoroCORE. Finansowanie opłaty za otwarty dostęp zostało zapewnione przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Chcielibyśmy podziękować Robertowi Atmarowi (Baylor College of Medicine, Houston, Teksas) za uprzejme dostarczenie nam oczyszczonych kapsydów oraz Valerie Lapham za jej pomoc przy obrazach TEM. Chcielibyśmy również podziękować Frankowi N. Barry'emu za pomoc w rozpoczęciu prezentowanych eksperymentów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Test wiązania oparty na płytce do oceny utraty struktury kapsydu norowirusa wyższego rzędu
96-well, średnio wiążąca płytka EIA z polistyrenuFisher (Costar)07-200-36
Pokrywka do płytki 96-dołkowejThermo Fisher3098
Folia parafinowa (Parafilm)Thermo FisherPM999
1x PBS (pH 7,2)Life Technologies20012-050
Polisorbat 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS (pH 7,2) + 0,05% Polisorbat 20N/ANIE DOTYCZY
Oczyszczony, zmontowany ludzki norowirus GII.4 kapsydyN/A/A
Indywidualne probówki PCR 0,2 mlGenesee Scientific22-154G
2 termocykleryBio-Rad
Mini wirówka stołowaFisher Scientific12-006-901
Odtłuszczone mleko w suchej masieThermo FisherLP0031B
, biotynylowanyGlycotech01-017
Biotynylowany aptamer M6-2 (stężenie podstawowe 100 &mikro; M w wodzie wolnej od nukleaz): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
koniugat streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (ocena ELISA), Używamy Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB), temperatura pokojowaThermo Fisher50-76-00
1 M kwas fosforowyN/AN/A
Czytnik mikropłytek zdolny do odczytu 450 nmTecanInfinite m200 Pro
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Analiza wyników testów płytkowych
Microsoft Excel lub podobny programNie dotyczyNie dotyczy
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Eksperymenty z dynamicznym rozpraszaniem światła
Zetasizer ZSP lub podobny przyrząd do analizy wielkości cząstekMalvern InstrumentsN/A
VortexFisher Scientifc02-215-365
Kuweta kwarcowaHellma104-002-10-40
Kuweta jednorazowa o małej pojemności (w celu zmniejszenia zużycia VLP)Malvern InstrumentsZEN0040
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Transmisyjna mikroskopia elektronowa Przygotowanie próbki
Siatki mikroskopii elektronowej niklu z folią węglowąLadd Research10880-100
Pęseta do samozamykającej się mikroskopii elektronowej z odwróconymTed Pella5372-NM
Bibuła filtracyjna jakościowaSigma-Aldrich (Whatman)WHA1002055
Szkło szalki PetriegoSigma-AldrichBR455743
100 mM roztwór HEPES (pH 7,2)N/AN/D
2% octan uranyluN/AN/D
N1861096 Syntetyczny disacharyd histo-grupy krwi typu A ekranem

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Related Articles