Artykuł metodologiczny

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56447

⸱

30 listopada 2017

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Whiteknights, University of Reading, 2Department of Bioengineering, Imperial College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Streszczenie

Chociaż elektroencefalografia (EEG) jest powszechnie stosowana jako nieinwazyjna technika rejestrowania aktywności neuronalnej mózgu, nasze zrozumienie neurogenezy EEG jest nadal bardzo ograniczone. Lokalne potencjały pola (LFP) zarejestrowane za pomocą wielowarstwowej mikroelektrody mogą dostarczyć bardziej szczegółowego opisu jednoczesnej aktywności neuronalnej w różnych warstwach kory mózgowej w korze nowej, ale technika ta jest inwazyjna. Połączenie pomiarów EEG i LFP w modelu przedklinicznym może znacznie poprawić zrozumienie mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w generowanie sygnałów EEG i ułatwić uzyskanie bardziej realistycznego i biologicznie dokładnego modelu matematycznego EEG. Przedstawiono prostą procedurę pozyskiwania jednoczesnych i kolokalizowanych sygnałów EEG i wielowarstwowych LFP u znieczulonego gryzonia. Zbadaliśmy również, czy na sygnały EEG istotny wpływ miał otwór w czaszce wywiercony w celu wprowadzenia mikroelektrody. Nasze wyniki sugerują, że otwór w zadziorach ma znikomy wpływ na zapisy EEG.

Wprowadzenie

Ogólnie przyjmuje się, że LFP rejestrowane za pomocą mikroelektrod przede wszystkim odzwierciedlają ważoną sumę zsynchronizowanych pobudzających i hamujących aktywności synaptycznych lokalnych populacji neuronów piramidowych1,2,3,4. Nasze ostatnie badania wykazały, że profil sygnału LFP można podzielić na składowe wzbudzenia i hamowania5,6. Jednakże, ponieważ LFP jest zwykle mierzony za pomocą procedury inwazyjnej, nie nadaje się do większości badań ludzkiego mózgu.

Z drugiej strony, EEG jest nieinwazyjną techniką pomiaru aktywności elektrycznej mózgu. Jest szeroko stosowany jako narzędzie diagnostyczne dla niektórych rodzajów chorób neurologicznych, takich jak padaczka, oraz jako narzędzie badawcze w badaniach poznawczych na ludziach. Pomimo swojej popularności, głównym ograniczeniem EEG jest niemożność precyzyjnej interpretacji jego profili czasowych pod kątem leżących u jego podstaw sygnałów neuronowych7,8,9.

Coraz częściej opracowywane są modele matematyczne EEG, które pomagają lepiej zrozumieć funkcje mózgu10,11,12,13,14,15. Większość istniejących modeli EEG jest opracowywana w oparciu o dopasowanie charakterystyki domeny częstotliwości modelu przewidywanego wyjścia do widma danych EEG podczas spontanicznej aktywności, a bardzo niewiele modeli EEG może generować realistyczne sensoryczne potencjały wywołane. W tym kontekście, równoczesne zapisy EEG i LFP dostarczą ważnych informacji i ograniczeń dla opracowania dokładniejszych modeli matematycznych EEG.

Aby zaspokoić tę potrzebę jednoczesnych zapisów w celu dalszego zbadania neuronalnego pochodzenia EEG, opracowaliśmy metodologię jednoczesnego rejestrowania EEG i wielowarstwowych sygnałów LFP w korze nowej znieczulonego szczura. Konfiguracja jest podobna do poprzednich równoległych badań EEG/LFP przeprowadzonych na naczelnych16,17. Dalej badaliśmy wpływ otworu żarna wywierconego w czaszce na zapisy EEG otaczające otwór, porównując obustronne zapisy EEG (tj. Jedna półkula z otworem w dziorze, druga półkula nienaruszona) przy braku stymulacji sensorycznej. Nasze wyniki pokazują, że równoczesne zapisy EEG/LFP mogą być prowadzone prosto i skutecznie, przy niewielkich zniekształceniach sygnału EEG z otworu w czaszce.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Ustawa o zwierzętach (procedury badawcze) z 1986 roku) i zatwierdzono je przez Komitet Etyki Badań na Uniwersytecie w Reading, Wielka Brytania.

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Do wszystkich eksperymentów wykorzystano samic rysów Lister Hooded. Jest to procedura nienadająca się do przeżycia.

  1. Zważ szczura na wadze laboratoryjnej.
  2. Uśpij szczura w komorze z 5% izofluranem i przepływem tlenu 1 L/min.
  3. Umieść szczura w uchwycie stereotaksyjnym, podkładając pod jego ciało ręcznik papierowy, a zęby umocuj za pomocą listwy do gryzienia. Ręcznik papierowy ułatwi późniejsze włożenie podkładki grzewczej (patrz krok 2.3) oraz zabezpieczy przed ewentualnym odchodzeniem kału podczas eksperymentu.
  4. Podawaj izofluran ciągle przez nosówkę z twardego plastiku zamocowaną do zacisku nosowego dla adaptera szczura, w stężeniu 3% przy przepływie tlenu 0.5 L/min. Podłącz nosówkę do systemu znieczulenia izofluranem dla zwierząt drobnych.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Umieść podgrzewane podkładki termostatyczne pod ręcznikiem papierowym, na którym spoczywa szczur, zablokuj głowę szczura za pomocą dwóch sztyftów umieszczonych w uszach i monitoruj temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytowego.
  2. Wygol głowę szczura.
  3. Zaaplikuj maść do oczu, aby zapobiec wyschnięciu rogówki.
  4. Przed odsłonięciem czaszki na skórę głowy nałóż krople lidokainy i delikatnie wmasuj je w skórę.
  5. Wykonaj cięcie w linii środkowej o długości około 2–3 cm na skórze głowy za pomocą skalpela, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
  6. Delikatnie oddziel mięsień skroniowy po stronie przeciwnej do wąsów, które mają być poddane stymulacji, od czaszki za pomocą skalera Jacquette’a i szczypczyków anatomicznych o ząbkowanych, zakrzywionych końcach. Oczyść czaszkę za pomocą patyczków bawełnianych w razie potrzeby.
  7. Używając jedwabiu plątanego, nieresorbowalnego szwu, zawiąż ciasny węzeł oddzielonego mięśnia do skóry głowy, a następnie solidnie przymocuj szew do ramy stereotaksycznej18.
  8. Użyj współrzędnych stereotaksycznych, aby zlokalizować korę beczkową, 2,5 mm do tyłu od bregmy i 6 mm bocznie od linii środkowej19. Zaznacz położenie kory czuciowo-ruchowej za pomocą ołówka lub markera.
  9. Wykonaj otwór trepanacyjny w oznaczonym miejscu za pomocą wiertarki dentystycznej. Aby zapobiec przegrzaniu się czaszki podczas wiercenia, co 10–15 sekund podlewaj sterylne roztworem soli fizjologicznej (chlorek sodu 0,9%) obszar roboczy. Proces wiercenia obejmuje następujące trzy etapy:
    1. Wykonaj otwór o średnicy < 2 mm w czaszce za pomocą wiertła nr 4 (o średnicy 0,055 cala). Uważaj, aby nie wiercić w twardą oponę mózgową.
    2. Wytłuszczyj dno otworu do prześwitu za pomocą wiertła nr 1/4 (o średnicy 0,019 cala).
    3. Użyj igły 27 G, aby przebić twardą oponę mózgową i umożliwić wstawienie mikroelektrody.
  10. Przenieś szczura zamocowanego na ramie stereotaksycznej do klatki Faradaya umieszczonej na wibracyjnie izolowanym stanowisku roboczym.
  11. Przymocuj czujnik pulsoksymetru podłączony do jednostki sterującej pulsoksymetru do tylnego łapy szczura, aby w sposób ciągły monitorować następujące parametry fizjologiczne: tętno, częstotliwość oddechów, nasycenie tlenem krwi tętniczej, rozszerzalność tętna i rozszerzalność oddechową. Parametry te były ciągle wyświetlane na monitorze komputera, odzwierciedlając stan fizjologiczny i głębokość narkozy u szczura.
  12. Zamień twardą plastikową maskę nosową do podawania izofluranu oraz zacisk nosowy dla adaptera szczura na mikroelastyczną maskę oddechową wyposażoną w przezroczystą, miękką maskę nosową, zmodyfikowaną (Rycina 1A), aby umożliwić łatwą stymulację wąsów z jednej strony bez naruszania podawania izofluranu.
  13. Wprowadź dwie stymulujące elektrody ze stali nierdzewnej do wąsów odsłoniętych przez wycięcie w masce nosowej.
  14. Połącz elektrody stymulujące z izolowanym stymulatorem prądu stałego.
  15. Podnieś skórę w linii środkowej szyi szczypczykami i wykonaj cięcie długości 1~2 cm nożyczkami, aby przygotować miejsce na umieszczenie elektrod odniesienia. Uważaj, aby nie przeciąć tkanki mięśniowej.

3. Konfiguracja jednoczesnego EEG/LFP

  1. Wyczyść i osusz czaszkę wokół otworu trepanacyjnego za pomocą patyczka bawełnianego.
  2. Delikatnie nałóż przewodzący żel EEG na jedną płaską stronę elektrody pajęczej EEG. Pozostaw niewielkie otwarte miejsce pozbawione żelu EEG na elektrodzie pajęczej, aby umożliwić przejście wielowarstwowej mikroelektrody przez to otwarcie bez kontaktu z żelem i elektrodą pajęczą. Zapobiega to kontaktowi elektrycznemu między elektrodą EEG a mikroelektrodą.
  3. Wyrównaj elektrodę pajęczą względem otworu trepanacyjnego w czaszce, tak aby żel EEG był skierowany ku czaszce.
  4. Delikatnie przyciśnij elektrodę pajęczą do czaszki, zapewniając silny kontakt z nią poprzez żel EEG. Usuń wszelki żel przesłaniający otwór trepanacyjny za pomocą igły zamontowanej na strzykawce.
  5. Usuń nadmiar żelu EEG poza obwodem elektrody pajęczej, tak aby kontakt między elektrodą pajęczą a czaszką był ograniczony przestrzennie do wielkości samej elektrody (Ryc. 1B).

Układ eksperymentalny w neurologii; elektrody EEG, mikroelektroda, stymulacja; schemat operacyjny.
Rysunek 1: Ogólny układ do jednoczesnego rejestrowania EEG/LFP. (A) Układ składa się z zmodyfikowanej kapturki do łatwej stymulacji poduszki wibryszej pod znieczuleniem izofluranem, dwóch elektrod stymulujących umieszczonych w poduszce wibryszej, elektrody pajęczej umieszczonej na czaszce nad korą beczkową po stronie przeciwnej do elektrod stymulujących, wielokanałowej mikroelektrody wprowadzonej do kory beczkowej przez elektrodę pajęczą oraz elektrod referencyjnych umieszczonych w nacięciu na karku szczura. (B) Widok przez mikroskop: elektroda pajęcza jest bezpiecznie umocowana na czaszce za pomocą masy EEG. Mikroelektroda jest wprowadzana przez otwór trepanacyjny wykonany w czaszce pod elektrodą pajęczą. Skóra głowy jest odsunięta za pomocą nici chirurgicznej (szwu) przymocowanej do ramy stereotaksycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Nałóż pastę EEG na elektrodę referencyjną do EEG i umieść ją pewnie wewnątrz nacięcia na karku szczura.
  2. Połącz elektrody EEG z wzmacniaczem wstępnym za pomocą pasywnego rozdzielacza sygnału dla sygnałów o niskim oporze (Rycina 2). Upewnij się, że opór elektrody pajęczej jest poniżej 5 kΩ. Jeśli nie, sprawdź, czy pasta EEG dobrze styka się z czaszką, a elektroda jest mocno przyciśnięta do pasty EEG. W razie potrzeby dodaj więcej pasty EEG.
  3. Zamocuj ramię mikromanipulatora na ramieniu stereotaksyjnym. Podłącz liniową 16-kanałową mikroelektrodę (odstęp 100 µm, powierzchnia każdego miejsca 177 µm2) do 16-kanałowego ostrza akwizycyjnego przymocowanego solidnie do ramienia mikromanipulatora.
  4. Nałóż pastę EEG na elektrody referencyjne do EEG i mikroelektrody, a następnie umieść je pewnie wewnątrz nacięcia (Rycina 1A).
  5. Dopasuj kąt ramienia mikromanipulatora tak, aby mikroelektroda była prostopadła do powierzchni kory. Kąt ten wynosi zazwyczaj między 25–35°.
  6. Opuść mikroelektrodę pod mikroskopem, obracając pokrętła mikromanipulatora, tak aby jej koniec był skierowany na maleńkie otwarcie na dnie otworu wierconego, aż najwyższy elektrodowy kontakt ledwo wniknie w powierzchnię kory. Należy zachować ostrożność, aby nie naciskać siłowo mikroelektrodą na powierzchnię twardówki, co mogłoby spowodować jej uszkodzenie.
  7. Połącz 16-kanałową mikroelektrodę z wzmacniaczem wstępnym połączonym z jednostką akwizycji danych za pomocą kabla światłowodowego (Rycina 2).
  8. Włącz wzmacniacz wstępny, jednostkę akwizycji danych oraz komputer połączony z tą jednostką. Włącz skrzynkę stymulatora.
  9. Wprowadź mikroelektrodę prostopadle do powierzchni kory, powoli obracając pokrętło osi z mikromanipulatora do głębokości 1 500 µm20.
  10. Dokonaj drobnej korekty głębokości, podając serię impulsów do opuszka wibryssów i obserwując wywołane potencjały lokalne (LFP) z 16 kanałów na monitorze komputera za pomocą oprogramowania jednostki akwizycji danych zainstalowanego na komputerze. Ostrożnie obracaj pokrętło osi z mikromanipulatora, aż najwyższa amplituda wywołanego LFP pojawi się wokół kanału 7 (co odpowiada warstwie IV kory).
    UWAGA: Konfiguracja elektrody EEG po stronie ipsilateralnej: W niektórych eksperymentach dodatkową elektrodę pajęczą umieszczano po stronie ipsilateralnej na nieuszkodzonej czaszce nad korą beczkową. Taka konfiguracja umożliwiała dwustronne rejestrowanie EEG w stanie spoczynku w celu zbadania wpływu otworu wierconego na sygnał EEG.
    UWAGA: Procedura chirurgiczna zakładania elektrody EEG jest identyczna jak opisana powyżej, z tą różnicą, że w kroku 2.6 mięsień skroniowy po każdej stronie głowy ostrożnie oddzielano od czaszki, zszywano i mocno przywiązywano do odpowiedniej strony ramienia stereotaksyjnego.
    UWAGA: Jednoczesna konfiguracja EEG/LFP jest również identyczna jak opisana powyżej, z dodatkowym krokiem polegającym na nałożeniu pasty EEG na drugą elektrodę pajęczą, a następnie mocnym przyciśnięciu jej do czaszki nad ipsilateralną korą beczkową.

Schemat eksperymentu z zakresu neurobiologii: EEG, sygnały z mikroelektrody, pozyskiwanie danych, układ z klatką Faradaya.
Rysunek 2. Schemat przepływu sygnału. Szczur umieszczony jest wewnątrz klatki Faradaya. Elektrody stymulacyjne otrzymują polecenia z urządzenia stymulującego, kontrolowanego przez Jednostkę Pozyskiwania Danych za pośrednictwem oprogramowania zainstalowanego na komputerze PC. Sygnał nerwowy rejestrowany przez mikroelektrodę jest przesyłany do wzmacniacza wstępnie umieszczonego w klatce Faradaya. Sygnał nerwowy rejestrowany przez sondę EEG jest przesyłany do wzmacniacza wstępnego poprzez rozdzielacz sygnału. Wzmacniacz wstępny połączony jest z Jednostką Pozyskiwania Danych znajdującą się na zewnątrz klatki Faradaya za pomocą kabla światłowodowego. Dane nerwowe są następnie zapisywane na lokalnym dysku komputera PC, a jednocześnie mogą być wyświetlone na monitorze. Przenośne urządzenie do podawania izoflurana u małych zwierząt wprowadza izofluran z zewnątrz klatki Faradaya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Stymulacja elektryczna i rejestracja aktywności nerwowej

UWAGA: Częstotliwość próbkowania dla wszystkich danych nerwowych wynosi 24,41 kHz przy rozdzielczości 16-bitowej. Próba składa się z pojedynczego bodźca elektrycznego na początku próby. Każda próba trwa 10 s, co odpowiada również przedziałowi między bodźcami (ISI). Każdy bodziec to prostokątne impulsy prądu o natężeniu 1,2 mA trwające 0,3 ms. W przypadku eksperymentów dwustronnych mających na celu zbadanie wpływu otworu trepanacyjnego rejestrowany jest również ciągły stan spoczynkowy trwający 250 s.

  1. Otwórz oprogramowanie do nagrywania na używanym komputerze.
  2. Wczytaj odpowiedni obwód do eksperymentu, wybierając opcję „Wczytaj projekt…” z rozwijanego menu „Otwórz projekt”. Pojawi się nowe okno („Środowisko pracy”) (Rysunek 3).

Interfejs oprogramowania OpenWorkbench, konfiguracja danych dla eksperymentu lekowego, zarządzanie plikami obwodów, częstotliwość próbkowania.
Rysunek 3. Wyświetlacz interfejsu graficznego oprogramowania dla urządzenia do akwizycji danych. Umożliwia załadowanie odpowiedniego obwodu, ustawienie parametrów stymulacji oraz zapis i wizualizację danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Utwórz nowy katalog (nazywany przez oprogramowanie „Zbiornikiem”) do przechowywania zapisów nerwowych.
    1. Kliknij opcję „Plik” u góry okna i wybierz „Zarządzanie zadaniami danych”. Pojawi się nowe okno („Zarządzanie zbiornikami”).
    2. W oknie „Zarządzanie zbiornikami” naciśnij prawy przycisk myszy, aby wyświetlić menu. Wybierz opcję „Utwórz nowy zbiornik”. Zostanie otwarte kolejne okno („Utwórz zbiornik danych”).
    3. W oknie „Utwórz zbiornik danych” wybierz ścieżkę, w której chcesz utworzyć nowy katalog danych, oraz wpisz nazwę nowego katalogu. Następnie naciśnij „OK”. Okno to zniknie.
    4. Nowy katalog pojawi się w oknie „Zarządzanie zbiornikami”, ale w kolorze szarym. Zarejestruj ten katalog, klikając go prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję „Zarejestruj zbiornik” z menu rozwijanego. Po lewej stronie nazwy nowego katalogu, która teraz jest czarna, pojawi się czerwona gwiazdka i zielona strzałka (Rysunek 4).
    5. Wyrejestruj wszystkie poprzednie katalogi, których nie używasz, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie „Zarządzanie zbiornikami” i wybierając opcję „Odśwież listę zbiorników” z menu rozwijanego.
    6. Kliknij „OK”, aby zamknąć okno „Zarządzanie zbiornikami”.

Interfejs konfiguracji systemu Tank Management; wybór serwera, opcje tworzenia projektu, ustawienia nazewnictwa bloków.
Rycina 4: Widok interfejsu graficznego oprogramowania przedstawiającego zarejestrowany katalog danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Zarejestruj nowy katalog w „Scope”, aby wyświetlić sygnały nerwowe podczas eksperymentu.
    1. Kliknij ikonę „Scope” w oknie „OpenProject”. Zostanie otwarte nowe okno („Scope”).
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie „Scope” i wybierz opcję „Refresh Tank List” z menu rozwijanego. Nazwa nowego katalogu pojawi się na szaro.
    3. Kliknij nowy katalog. Po lewej stronie nazwy katalogu, która teraz jest czarna, pojawi się czerwona gwiazdka i zielona strzałka.
  2. Skonfiguruj parametry eksperymentu do rejestracji danych w oknie „WorkBench”, klikając opcję „Setup” u góry okna. Zostanie otwarte nowe okno. Wybierz „Sweep loop” oraz ustaw długość pojedynczej próby i liczbę powtórzeń do zapisania.
  3. Sprawdź, czy urządzenie stymulujące jest włączone.
  4. Kliknij przycisk „Record” w oknie „WorkBench”. Zostanie otwarte nowe okno. Wpisz nazwę pliku danych, który chcesz zapisać dla bieżącego eksperymentu, ale nie naciskaj jeszcze klawisza Enter, ponieważ należy najpierw skonfigurować parametry rejestracji EEG.
  5. Skonfiguruj parametry rejestracji EEG za pomocą interfejsu graficznego (GUI) na wzmacniaczu wstępnym. Dotknij ekranu wzmacniacza (w dowolnym miejscu), aby go odbudzić. Wybierz opcję „Unlock”, aby odblokować wyświetlacz (Rycina 5).
    1. Naciśnij lewy ikonę w panelu „2: EEG”. Zostanie wyświetlone nowe okno.
    2. Naciśnij „Coupling” i wybierz „AC”.
    3. Naciśnij „Ref Mode” i wybierz „Local”.
    4. Naciśnij „Samp Rate” i wybierz „25KHz”.
    5. Naciśnij „OK”, aby powrócić do pierwotnego ekranu.

EEG, wyświetlacz sygnału SU; 16 kanałów, ustawienia 25 kHz, interfejs elektroniczny, analiza danych naukowych
Rysunek 5: Interfejs użytkownika na wstępnych wzmacniaczach. Umożliwia rejestrowanie parametrów EEG (np., częstotliwość próbkowania oraz preferencje odniesienia) do ustawienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Sprawdź impedancję sondy(y) EEG, naciskając środkową ikonę w panelu „2: EEG”. Jeśli impedancja jest zbyt wysoka, dodaj więcej pasty EEG do sondy. Naciśnij „OK”, aby powrócić do pierwotnego ekranu.
  2. Poczekaj 20 s, aby uniknąć rejestrowania początkowych fluktuacji zapisu EEG.
  3. Po upływie 20 sekund wróć do monitora komputera i naciśnij klawisz „Return” na klawiaturze. Zostaną zarejestrowane sygnały EEG oraz LFP.

5. Analiza danych

  1. Przetwarzaj sygnały LFP i EEG wywołane trial po triału, stosując następujące kroki.
    1. Przesuń dane nerwowe wstecz w czasie o 20 próbek (odpowiednik 0,82 ms). Jest to opóźnienie wywołane obwodem używanym do zbierania danych nerwowych w systemie TDT. Poprzez przesunięcie danych, punkt czasu zero zostaje wyrównany do początku bodźca.
    2. Usuń artefakt stymulacyjny, zastępując dane nerwowe z przedziału od 0 do 1 ms linią prostą łączącą punkt danych w 0 ms z punktem danych w 1 ms.
    3. Wyzeruj średnie każdej próbki, odejmując średnią wartość sygnału nerwowego zarejestrowaną 200 ms przed rozpoczęciem bodźca.
    4. Filtruj dane dolnoprzepustowo poniżej 800 Hz przy użyciu filtra 4th filtr typu Butterwortha IIR rzędu w obu kierunkach, aby uniknąć wprowadzenia jakiegokolwiek przesunięcia czasowego w danych.
    5. Wyrównaj dane wielowarstwowe między poszczególnymi zwierzętami. Dla danych LFP każdego zwierzęcia zastosuj odwrotną analizę gęstości źródła prądu (spline iCSD, promień źródła R = 0,5 mm)21 z filtrem Gaussa (λ = 50 µm) aby zlokalizować warstwę IV jako ujście1, który jest określany jako największy negatywny szczyt występujący na głębokości korowej poniżej powierzchni pajalnej w ciągu pierwszych 15 ms po wystąpieniu bodźca. Dane CSD oraz odpowiadające im dane LFP są następnie wyrównywane według położenia zlewów u poszczególnych zwierząt. Wspólny zlew znajduje się w warstwie IV, ~ 600 µm poniżej powierzchni pajęczej
    6. Po wyrównaniu użyj kanałów 2, 7 i 12 ponownie wyjustowanych LFP jako reprezentantów odpowiedzi nerwowych warstw nadziarnistych, ziarnistych i podziarnistych w korze wąsoszczotkowej.
  2. Oblicz średni wywołany potencjał lokalny (LFP) i EEG, uśredniając przetworzone dane z 100 prób.
  3. Aby zbadać wpływ otwarcia otworu trepanacyjnego na EEG, przeprowadź decymację sygnałów EEG do częstotliwości 1000 Hz oraz oblicz gęstość mocy widmowej (PSD) dla zapisów z elektrody pajęczej po stronie przeciwnej (z otworem w czaszce) i po stronie tej samej strony ciała (intaktna czaszka) w okresie 250 s stanu spoczynkowego. PSD obliczono w zakresie 0,1–100 Hz w środowisku Matlab przy użyciu funkcji „pmtm”, opartej na metodzie wielokrotnych okienek (multitaper).22.
  4. Podziel zakres częstotliwości na następujące dobrze znane pasma częstotliwości: Delta (δ): 0,1–4 Hz, Theta (θ): 4–8 Hz, Alpha (α): 8–13 Hz, Beta (β): 13–31 Hz, Gamma (γ): 31–100 Hz. Oblicz średnią gęstość mocy spektralnej (PSD) w obrębie każdego pasma.
  5. W obrębie każdego pasma częstotliwościowego oblicz znormalizowaną różnicę w PSD, Pbłąd, między sygnałami EEG z przeciwnego i tego samego boku, używając równania:
    Wzór na współczynnik błędu: (Pc - Pi)/Pi, równanie do analizy precyzji.
    gdzie Pc i Pi to średnie PSD sygnału EEG z boku kontralateralnego i ipsilateralnego, odpowiednio, w badanej paśmie częstotliwości.
  6. W obrębie każdej wstęgi częstotliwościowej przeprowadź test t dla jednej próby, aby sprawdzić hipotezę, że nie istnieje istotna różnica (na poziomie istotności 0,05) między widmem mocy sygnału EEG zarejestrowanym z obu półkul mózgowych.

Wyniki

Dane z 4 szczurów zostały uśrednione w celu uzyskania średnich szeregów czasowych, gdzie było to możliwe. Amplituda wywołanej odpowiedzi EEG, znana również jako potencjał wywołany (ERP), jest zazwyczaj znacznie mniejsza niż amplituda LFP. Rysunek 6 przedstawia odpowiednio średni ERP i LFP w warstwach supragranularnej, granularnej i infragranularnej kory beczkowej. Wstęga błędu na każdym wykresie oznacza odpowiadający jej błąd standardowy. Widać, że ERP jest około 10 razy mniejszy niż wywołany LFP.

Schemat przebiegu potencjałów wywołanych (ERP); warstwy: od supragranularnych do infragranularnych; zaznaczono skalę amplitudy i czasu.
Rysunek 6: Średnie (n = 4) sygnały neuronalne ERP oraz LFP z warstw supragranularnych, granularnych i infragranularnych. Zacieniowanie oznacza błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównania dynamiki czasowej ERP i LFP przedstawiono w Rysunek 7Bezpośrednia superpozycja ERP i supragranularnego LFP w Rysunek 7A ilustruje różnicę rzędów wielkości amplitudy między tymi dwoma rodzajami sygnałów neuronalnych. Aby porównać dynamikę czasową, zarówno ERP, jak i LFP zostają znormalizowane względem amplitudy ich ujemnego piku. Rycina 7B i 7C przedstaw znormalizowane ERP nałożone odpowiednio na znormalizowane LFP supragranularne oraz znormalizowane LFP granularne.

Z Rysunku 7B wynika, że piki P1 i N1 dla ERP są bardziej opóźnione niż odpowiadające im piki LFP w warstwie supragranularnej. Jednak profile czasowe tych dwóch sygnałów neuronalnych są podobne, przy czym P1 wyprzedza N1. Z drugiej strony, profil czasowy ERP wyraźnie różni się od profilu LFP z warstwy granularnej (warstwa IV kory beczkowej) (Rysunek 7C). Co istotne, nie są one swoimi odbiciami lustrzanymi; w LFP granularnym dominuje pojedynczy pik ujemny (odzwierciedlający główny dopływ prądu w korowej warstwie IV), podczas gdy ERP składa się głównie z dwóch pików o przeciwnej polaryzacji.

Wykres potencjałów wywołanych; porównanie ERP pomiędzy warstwami nadziarnistymi a ziarnistymi.
Rysunek 7: Porównanie dynamiki czasowej ERP i LFP. (A) ERP (linia ciągła) nałożone na supragranularne LFP (linia przerywana). Cieniowanie oznacza błąd standardowy. (B) Znormalizowane ERP (linia ciągła) nałożone na znormalizowane LFP z warstw supragranularnych (linia przerywana). (C) Znormalizowany potencjał wywołany (linia ciągła) nałożony na znormalizowane LFP ziarniste (linia przerywana). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Sygnał ERP mierzono za pomocą elektrody typu „spider” umieszczonej na czaszce w miejscu wywierconego otworu trepanacyjnego. Aby zbadać wpływ otworu na zapisy EEG, drugą elektrodę typu „spider” umieszczono na nienaruszonej czaszce powyżej ipsilateralnej kory beczkowej. Dbano o to, aby impedancje obu elektrod były porównywalne pod względem wartości, regulując ilość użytej pasty do EEG. Przedstawiono tutaj dane od czterech szczurów (które nie były tymi samymi osobnikami, co w powyższej części).

Rycina 8 przedstawia jednoczesne zapisy EEG w stanie spoczynku z obu elektrod jednego szczura, przy czym dane z 100 s wyświetlono na Rycini 8A, a dane w ramce prostokątnej (20 s) zostały powiększone na Rycini 8B. Dwa sygnały EEG wykazują w dużej mierze współzmienność w podobnym zakresie amplitudy. Rycina 9 przedstawia PSD czterech szczurów, gdzie górny rząd wykorzystuje skalę liniową na osi częstotliwości, a dolny rząd skalę logarytmiczną na osi częstotliwości w celu zapewnienia powiększonego widoku w zakresie niskich częstotliwości. Z Ryciny 9 wynika, że nie występuje spójna tendencja w PSD pomiędzy badanymi osobnikami. Potwierdzono to, przeprowadzając jednopróbowe testy t dla znormalizowanych różnic w uśrednionym PSD w pięciu pasmach częstotliwości, co pokazano na Rycini 10. Żadna znormalizowanych różnic PSD w tych pasmach częstotliwości nie różniła się istotnie od zera (odpowiednio p = 0,32, 0,46, 0,85, 0,69 i 0,97).

Wykres analizy EEG porównujący sygnały z czaszki, ilustrujący wpływ otworu w czaszce na dane o falach mózgowych.
Rysunek 8: Obustronne zapisy EEG. (A) Rejestracja EEG z powierzchni czaszki w stanie spoczynku z otworem trepanacyjnym w czaszce (kolor czarny) oraz jednoczesna rejestracja EEG w przeciwległej półkuli z nienaruszoną czaszką (kolor szary). (B) Powiększony widok przebiegów fal wewnątrz prostokątnej ramki na (A). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy gęstości widmowej mocy (PSD) szczurów; analiza częstotliwości w eksperymencie neuronaukowym.
Rysunek 9: Gęstość widmowa mocy (PSD) EEG po stronie przeciwnej (niebieski) i tej samej (czerwony). Każda kolumna przedstawia PSD dla jednego szczura. Górne panele wykorzystują liniową skalę częstotliwości, natomiast dolne panele wykorzystują logarytmiczną skalę częstotliwości, aby umożliwić wizualizację PSD w niższym zakresie częstotliwości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy częstotliwości fal mózgowych; znormalizowane PSD wykazujące różnice w pasmach δ, θ, α, β, γ.
Rysunek 10: Analiza grupowa. Znormalizowana różnica między przeciwległym a ipsilateralnym PSD dla pięciu pasm częstotliwości: delta, theta, alfa, beta i gamma. Każdy słupek przedstawia średnią znormalizowaną różnicę w obrębie pasma częstotliwości, a błąd standardowy jest zaznaczony jako słupek błędu. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Opisaliśmy eksperymentalną procedurę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanych sygnałów EEG i LFP szczura znieczulonego izofluranem w odpowiedzi na stymulację opuszki wąsów. Mikroelektrodę wprowadzono do kory nowej przez otwór w elektrodzie pająka EEG, który był wyrównany z otworem w czaszce. Elektroda została przymocowana do czaszki za pomocą przewodzącej i adhezyjnej pasty EEG23. Stożek nosowy używany do podawania izofluranu został zmodyfikowany tak, aby elektrody stymulujące mogły być z łatwością wprowadzane do opuszki wąsów.

Pasta EEG skutecznie przymocowała elektrodę pająka do czaszki, zapewniając jednocześnie doskonałe przewodnictwo elektryczne przez cały dzień eksperymentalny bez konieczności dodatkowego stosowania pasty. Zastąpił on niepożądane użycie kleju do przymocowania obwodu elektrody pająka do czaszki, ponieważ klej nie przewodzi prądu i może zwiększyć impedancję elektrody, jeśli przebiega między czaszką a elektrodą. Pasta EEG ma wiele zalet w porównaniu z żelem EEG, który jest trudny do uformowania wokół otworu zadziorów i może wyschnąć podczas eksperymentu, co skutkuje słabymi sygnałami EEG.

Gdy szczur został umieszczony w klatce Faradaya, szum elektryczny spowodowany środowiskiem został znacznie stłumiony. Czasami jednak sygnał neuronowy był nadal dość głośny. W większości przypadków było to spowodowane tym, że elektroda referencyjna nie była prawidłowo ustawiona i dlatego wymagała ponownej regulacji lub użycia większej ilości pasty EEG. Innym częstym problemem było to, że wywołany LFP miał małą amplitudę. Może to być spowodowane tym, że mikroelektroda nie znajduje się w środku obszaru korowego aktywowanego przez elektrody stymulujące. Zamiast ponownie wprowadzać mikroelektrodę, co mogłoby spowodować większe uszkodzenie lokalnych neuronów, zwykle dostosowywaliśmy położenie elektrod stymulujących w podkładce wąsów, aż do momentu, gdy można było zaobserwować rozsądną amplitudę LFP (>3 mV).

Jednym z ograniczeń tej techniki jest słaba rozdzielczość przestrzenna elektrody pająka, która ma średnicę 6 mm. Jest to duże w porównaniu z rozmiarem czaszki szczura. Niestety, zastosowana tutaj elektroda krzyżowa jest najmniejszą dostępną do kupienia. Pożądane będzie zmniejszenie średnicy elektrody pająka do 2-4 mm, zwiększając w ten sposób specyficzność przestrzenną zapisów EEG, dzięki czemu porównanie sygnału EEG z sygnałem nadziarnistym LFP będzie mniej niejednoznaczne.

Szczególnej uwagi wymaga kilka krytycznych etapów protokołu. Pierwszym z nich jest wprowadzenie mikroelektrody przez otwór w zadziorach. Ponieważ opona twarda jest poza tym nienaruszona, precyzja włożenia ma kluczowe znaczenie. Niewielka rezystancja na końcówce elektrody zwykle oznacza, że elektroda nie jest prawidłowo ustawiona. Należy go podnieść, wyregulować pozycję i ponownie włożyć. Drugi to położenie stożka nosowego na szczurze. Nie może być zbyt luźny, ponieważ izofluran ucieknie ze stożka. Nie może być również zbyt ciasny, ponieważ może to zatkać nozdrza szczura i spowodować trudności w oddychaniu. Szczególną uwagę należy również zwrócić na to, aby amplituda zapisu EEG była znacznie mniejsza (zwykle od 5 do 10 razy mniejsza) niż w przypadku zapisu górnego kanału LFP. Jeśli są podobne, oznacza to, że sonda EEG miała bezpośredni lub pośredni kontakt z mikroelektrodą. Kontakt pośredni odbywa się zwykle przez płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), który czasami wypełnia otwór wywiercony w czaszce. Przewodność płynu mózgowo-rdzeniowego jest zwykle 100 razy większa niż czaszki24,25. Tak więc, jeśli poziom płynu mózgowo-rdzeniowego wewnątrz otworu zadziorowego jest wystarczająco wysoki, może on zetknąć się z elektrodą krzyżową. Aby tego uniknąć, otwór należy często czyścić super chłonnymi bawełnianymi gąbkami, takimi jak włócznie absorpcyjne.

Wpływ otworu zadziorowego (średnica <2 mm) w czaszce na zapis EEG otaczający otwór badano poprzez umieszczenie kolejnej elektrody pająka na nienaruszonej czaszce na szczycie bocznej kory lufy ipsi, aby można było porównać obustronne zapisy EEG. Wyniki przedstawione na wykresach 9 i 10 sugerują, że efekt jest nieistotny na poziomie istotności 0,05. Inne czynniki wpływające na amplitudę EEG obejmują to, jak dobrze pasta EEG stykała się z czaszką, jak mocno elektroda była dociśnięta do pasty oraz przestrzenny zasięg pasty EEG na czaszce.

Warto również zauważyć, że opisany tutaj protokół rejestrował EEG czaszki, co różni się od EEG skóry głowy stosowanego w badaniach EEG na ludziach. Skóra głowy działa jak rezystor lub filtr dolnoprzepustowy, co jeszcze bardziej zmniejszy stosunek sygnału do szumu w zapisie EEG.

Wreszcie, porównanie dynamiki czasowej ERP i dynamiki wywołanego LFP w warstwach korowych sugeruje, że somatosensoryczny potencjał wywołany lepiej odzwierciedla LFP w warstwie nadziarnistej kory mózgowej niż w warstwie ziarnistej i podkrystalicznej. Jest to zgodne z naszą wcześniejszą pracą6, pokazującą, że początkowy segment (P1) ERP jest związany z prądem powrotnym powstającym w wyniku napływu pobudzającego prądu synaptycznego występującego w warstwie ziarnistej, podczas gdy późniejszy spadek (N1) w ERP może być związany z opóźnionym przybyciem aferentnego wzgórza do warstw korowych II/III i/lub sygnałów sprzężenia zwrotnego z głębszych warstw korowych. Podsumowując, równoczesne zapisy EEG/LFP mogą poszerzyć zrozumienie neuronalnej genezy EEG i ułatwić matematyczne modelowanie EEG pod względem sygnałów neuronalnych w warstwach kory mózgowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Andrew Crippsowi i Jednostce Zasobów Biologicznych na Uniwersytecie w Reading. Badania zostały sfinansowane przez BBSRC (numer grantu: BB/K010123/1). Dane związane z tą pracą są swobodnie dostępne w Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Samica szczura Lister HoodCharles Rivers
Elektroda pająkaUnimed Electrode Supplies LtdSCS24-426
Pasta EEG: Ten20Unimed Electrode Supplies Ltd10-20-S
Uchwyt stereotaktyczny z dwoma ramionami mikromanipulatora: Rama stereotaktyczna z podwójnym manipulatorem 18° Listwy nauszneWPI (World Precision Instruments)502603
IsofluraneNational Vet Services Limited50878
Stożek nosowy z twardego plastiku: Maska przeciwgazowa anestezjologiczna dla szczuraWPI502054
System znieczulenia izofluranem dla małych zwierzątWPIEZ-B800A Termostatyczna poduszka
grzewcza: Rat Blanket System 230 VHarvard Apparatus Wielka Brytania50-7221-F
Maść okulistyczna: Optixcare Lubrykant do oczuViovet203865
Chlorowodorek lidokainy (wstrzyknięcie 2%)Larkmead Vets
Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, HollowWPI503421
Ząbkowane i zakrzywione kleszczyki preparacyjneWPI15915
Pleciony jedwab, niewchłanialny szew: Mersilk Suture W502HNational Vet Services Limited153746
Wiertło dentystyczne: BONE MICRO DRILL SYST 230 VACHarvard Apparatus UK72-4860
Sterylna sól fizjologiczna: Chlorek sodu 0,9%Animalcare Ltd14K26BT
Wiertło #4 : Młyn kulowy, węglik spiekany, # 4Harvard Apparatus UK72-4958
Wiertło # 4 : Młyn kulowy, węglik spiekany, # 1/4Aparat Harvard UK72-4962
Klatka FaradayaNewport CorporationVIS-FDC-3600
Stacja robocza z izolacją drgań: Vision IsoStationNewport CorporationM-VIS3660-RG4-325A
: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp.WPIO15001
Przezroczysty miękki stożek nosowy: Microflex Non-Rebreathing Unit ze szczurem NoseconeWPIEZ-103A
Elektrody stymulujące ze stali nierdzewnejPlasticsOneE363/1/SPC
Izolowany stymulator prąduWyprodukowany w domu
16-kanałowa mikroelektroda, 100 μ m rozstaw, powierzchnia każdej witryny 177 μ m2NeuroNexusA1x16-10mm-100-177-A16
16-kanałowa ostra stacja czołowaTucker David Technologies Inc., TDTRA16AC-Z
Przedwzmacniacz: 64-kanałowy przedwzmacniacz neuro-cyfrowy serii ZTDTPZ5-64
Pasywny rozdzielacz sygnału: 32-kanałowy rozdzielacz do PZ5TDTS-BOX_PZ5
Jednostka akwizycji danych: Procesor RZ2 BioAmp. Seria Z 4-DSP ultra wysokowydajny procesorTDTRZ2-4
Oprogramowanie do neurofizjologii: OpenEXTDT
Matlab MathWorks
Włócznie absorpcyjneFine Sicence Tools18105-01
Jednostka sterująca i czujnik pulsoksymetru

Bibliografia

  1. Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
  2. Logothetis, N. K. The Underpinnings of the BOLD Functional Magnetic Resonance Imaging Signal. J Neurosci. 23 (10), 3963-3971 (2003).
  3. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  4. Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
  5. Zheng, Y., et al. Balanced excitation and inhibition: Model based analysis of local field potentials. Neuroimage. 63 (1), 81-94 (2012).
  6. Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. Neuroimage. 146, 575-588 (2017).
  7. Nunez, P. L. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press. (1981).
  8. Jackson, A. F., Bolger, D. J. The neurophysiological bases of EEG and EEG measurement: A review for the rest of us. Psychophysiology. 51 (11), 1061-1071 (2014).
  9. Cohen, M. X. Where Does EEG Come From and What Does It Mean? Trends Neurosci. 40 (4), 208-218 (2017).
  10. Bojak, I., Oostendorp, T., Reid, A., Kötter, R. Connecting Mean Field Models of Neural Activity to EEG and fMRI Data. Brain Topogr. 23 (2), 139-149 (2010).
  11. Coombes, S. Large-scale neural dynamics: Simple and complex. Neuroimage. 52 (3), 731-739 (2010).
  12. Deco, G., Jirsa, V. K., Robinson, P. A., Breakspear, M., Friston, K. J. The dynamic brain: from spiking neurons to neural-masses and cortical fields. PLoS Comput. Biol. 4 (8), e1000092(2008).
  13. Pinotsis, D. A., Friston, K. J. Neural fields, spectral responses and lateral connections. Neuroimage. 55 (1), 39-48 (2011).
  14. Riera, J. J., et al. Pitfalls in the dipolar model for the neocortical EEG sources. J Neurophysiol. 108 (4), 956-975 (2012).
  15. Valdes, P. A., Jimenez, J. C., Riera, J., Biscay, R., Ozaki, T. Nonlinear EEG analysis based on a neural mass model. Biol Cybern. 81 (5), 415-424 (1999).
  16. Musall, S., von Pföstl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of Neural Synchrony on Surface EEG. Cereb Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
  17. Snyder, A. C., Morais, M. J., Willis, C. M., Smith, M. A. Global network influences on local functional connectivity. Nat Neurosci. 18 (5), 736-743 (2015).
  18. Mayhew, J., et al. Spectroscopic analysis of neural activity in brain: Increased oxygen consumption following activation of barrel cortex. Neuroimage. 12 (6), 664-675 (2000).
  19. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Academic Press. (2005).
  20. Martindale, J., et al. The hemodynamic impulse response to a single neural event. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (5), 546-555 (2003).
  21. Pettersen, K. H., Devor, A., Ulbert, I., Dale, A. M., Einevoll, G. T. Current-source density estimation based on inversion of electrostatic forward solution: Effects of finite extent of neuronal activity and conductivity discontinuities. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 116-133 (2006).
  22. Thomson, D. J., et al. Multitaper analysis of nonstationary and nonlinear time series data. Nonlinear and Nonstationary Signal Processing. Fitzgerald, W. J., et al. , 317-394 (2000).
  23. Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (100), e52700(2015).
  24. Baumann, S. B., Wozny, D. R., Kelly, S. K., Meno, F. M. The electrical conductivity of human cerebrospinal fluid at body temperature. IEEE Trans Biomed Eng. 44 (3), 220-223 (1997).
  25. Wendel, K., et al. The Influence of Age and Skull Conductivity on Surface and Subdermal Bipolar EEG Leads. Computational Intelligence and Neuroscience. 2010, (2010).
  26. Flemming, L., et al. Evaluation of the distortion of EEG signals caused by a hole in the skull mimicking the fontanel in the skull of human neonates. Clin Neurophysiol. 116 (5), 1141-1152 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wsp lokalizowana rejestracjauchwyt stereotaktycznyotw r trepanacyjnywprowadzanie mikroelektrodaplikacja pasty EEGstymulacja poduszeczki wibrysowejmonitorowanie wywo anych LFPanaliza sygna u ERP
Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.