Artykuł metodologiczny

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

DOI:

10.3791/56447

⸱

30 listopada 2017

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Whiteknights, University of Reading, 2Department of Bioengineering, Imperial College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż elektroencefalografia (EEG) jest powszechnie stosowana jako nieinwazyjna technika rejestrowania aktywności neuronalnej mózgu, nasze zrozumienie neurogenezy EEG jest nadal bardzo ograniczone. Lokalne potencjały pola (LFP) zarejestrowane za pomocą wielowarstwowej mikroelektrody mogą dostarczyć bardziej szczegółowego opisu jednoczesnej aktywności neuronalnej w różnych warstwach kory mózgowej w korze nowej, ale technika ta jest inwazyjna. Połączenie pomiarów EEG i LFP w modelu przedklinicznym może znacznie poprawić zrozumienie mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w generowanie sygnałów EEG i ułatwić uzyskanie bardziej realistycznego i biologicznie dokładnego modelu matematycznego EEG. Przedstawiono prostą procedurę pozyskiwania jednoczesnych i kolokalizowanych sygnałów EEG i wielowarstwowych LFP u znieczulonego gryzonia. Zbadaliśmy również, czy na sygnały EEG istotny wpływ miał otwór w czaszce wywiercony w celu wprowadzenia mikroelektrody. Nasze wyniki sugerują, że otwór w zadziorach ma znikomy wpływ na zapisy EEG.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie przyjmuje się, że LFP rejestrowane za pomocą mikroelektrod przede wszystkim odzwierciedlają ważoną sumę zsynchronizowanych pobudzających i hamujących aktywności synaptycznych lokalnych populacji neuronów piramidowych1,2,3,4. Nasze ostatnie badania wykazały, że profil sygnału LFP można podzielić na składowe wzbudzenia i hamowania5,6. Jednakże, ponieważ LFP jest zwykle mierzony za pomocą procedury inwazyjnej, nie nadaje się do większości badań ludzkiego mózgu.

Z drugiej strony, EEG jest nieinwazyjną techniką pomiaru aktywności elektrycznej mózgu. Jest szeroko stosowany jako narzędzie diagnostyczne dla niektórych rodzajów chorób neurologicznych, takich jak padaczka, oraz jako narzędzie badawcze w badaniach poznawczych na ludziach. Pomimo swojej popularności, głównym ograniczeniem EEG jest niemożność precyzyjnej interpretacji jego profili czasowych pod kątem leżących u jego podstaw sygnałów neuronowych7,8,9.

Coraz częściej opracowywane są modele matematyczne EEG, które pomagają lepiej zrozumieć funkcje mózgu10,11,12,13,14,15. Większość istniejących modeli EEG jest opracowywana w oparciu o dopasowanie charakterystyki domeny częstotliwości modelu przewidywanego wyjścia do widma danych EEG podczas spontanicznej aktywności, a bardzo niewiele modeli EEG może generować realistyczne sensoryczne potencjały wywołane. W tym kontekście, równoczesne zapisy EEG i LFP dostarczą ważnych informacji i ograniczeń dla opracowania dokładniejszych modeli matematycznych EEG.

Aby zaspokoić tę potrzebę jednoczesnych zapisów w celu dalszego zbadania neuronalnego pochodzenia EEG, opracowaliśmy metodologię jednoczesnego rejestrowania EEG i wielowarstwowych sygnałów LFP w korze nowej znieczulonego szczura. Konfiguracja jest podobna do poprzednich równoległych badań EEG/LFP przeprowadzonych na naczelnych16,17. Dalej badaliśmy wpływ otworu żarna wywierconego w czaszce na zapisy EEG otaczające otwór, porównując obustronne zapisy EEG (tj. Jedna półkula z otworem w dziorze, druga półkula nienaruszona) przy braku stymulacji sensorycznej. Nasze wyniki pokazują, że równoczesne zapisy EEG/LFP mogą być prowadzone prosto i skutecznie, przy niewielkich zniekształceniach sygnału EEG z otworu w czaszce.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Ustawa o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku) i zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań na Uniwersytecie w Reading w Wielkiej Brytanii.

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Samice szczurów z kapturem Lister były używane do wszystkich eksperymentów. Jest to procedura niepolegająca na przeżyciu.

  1. Zapisz wagę szczura na wadze laboratoryjnej.
  2. Znieczulić szczura w komorze z 5% izofluranem i natężeniem przepływu tlenu 1 l/min.
  3. Umieść szczura na uchwycie stereotaktycznym z ręcznikiem papierowym pod ciałem i z zębami opartymi o pręt gryzowy. Ręcznik papierowy ułatwi włożenie poduszki grzewczej (patrz krok 2.3) i złapie wszelkie odchody szczura podczas eksperymentu.
  4. Izofluran należy podawać w sposób ciągły przez stożek nosowy z twardego tworzywa sztucznego zamontowany na zacisku nosowym adaptera szczura w stężeniu 3% przy natężeniu przepływu tlenu 0,5 l/min. Podłączyć stożek do systemu znieczulającego izofluranem dla małych zwierząt.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Włóż termostatyczną poduszkę grzewczą pod ręcznik papierowy, na którym odpoczywa szczur, zabezpiecz głowę szczura dwoma nausznikami i monitoruj temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego.
  2. Ogol czubek głowy szczura.
  3. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Przed odsłonięciem czaszki nałóż krople lidokainy na skórę głowy i delikatnie wmasuj je w skórę.
  5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej około 2-3 cm na skórze głowy za pomocą skalpela, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
  6. Ostrożnie oddziel mięsień skroniowy po stronie bocznej do poduszeczki wąsa, która ma być stymulowana, od czaszki za pomocą skalera Jacquette i pary ząbkowanych i zakrzywionych kleszczy preparacyjnych. W razie potrzeby wyczyść czaszkę bawełnianymi wacikami.
  7. Za pomocą plecionego jedwabnego, niewchłanialnego szwu, przywiąż oddzielony mięsień do skóry głowy ciasnym węzłem, a następnie przywiąż szew bezpiecznie do ramy stereotaktycznej18.
  8. Użyj współrzędnych stereotaktycznych, aby zlokalizować korę lufy, 2,5 mm ogonową do bregma i 6 mm boczną do linii środkowej19. Narysuj kropkę w miejscu kory somatosensorycznej za pomocą ołówka lub markera.
  9. Wywierć otwór na zadziory w zaznaczonym miejscu za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zapobiec przegrzaniu czaszki podczas wiercenia, należy co 10-15 s nakładać sterylną sól fizjologiczną (chlorek sodu 0,9%) na obszar roboczy. Proces wiercenia składa się z następujących 3 kroków:
    1. Wywierć otwór o średnicy < 2 mm w czaszce za pomocą wiertła #4 (o średnicy 0,055). Uważaj, aby nie wiercić w oponie twardej.
    2. Rozcieńczyć dno otworu do przezroczystości za pomocą wiertła #1/4 (o średnicy 0,019).
    3. Użyj igły 27 G, aby przebić oponę twardą, aby umożliwić wprowadzenie mikroelektrody.
  10. Przenieś szczura, zabezpieczonego na ramie stereotaktycznej, do klatki Faradaya zamontowanej na górze stacji roboczej z izolacją drgań.
  11. Przymocuj zacisk czujnika pulsoksymetru podłączony do jednostki sterującej pulsoksymetrem do tylnej łapy szczura, aby w sposób ciągły monitorować następujące parametry fizjologiczne: tętno, częstość oddechów, nasycenie tlenem tętniczym, wzdęcie tętna i wzdęcie oddechu. Parametry te były wyświetlane w sposób ciągły na monitorze komputera, odzwierciedlając stan fizjologiczny i głębokość znieczulenia szczura.
  12. Zastąp stożek nosowy z twardego tworzywa sztucznego do podawania izofluranu i zacisk nosowy do adaptera szczura na odpowietrznik microflex wyposażony w przezroczysty stożek z miękkim nosem, który jest zmodyfikowany (Rysunek 1A), aby umożliwić łatwą stymulację wąsów po jednej stronie opuszki wąsów bez uszczerbku dla podawania izofluranu.
  13. Włóż dwie elektrody stymulujące ze stali nierdzewnej do podkładki wąsów odsłoniętej przez wycięcie w stożku nosowym.
  14. Podłącz elektrody stymulujące do izolowanego stymulatora prądu.
  15. Podnieś skórę linii środkowej szyi za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami o długości 1 ~ 2 cm, gotowe do umieszczenia elektrod referencyjnych. Uważaj, aby nie przeciąć tkanki mięśniowej.

3. Konfiguracja EEG/LFP w kolokowanej

lokalizacji
  1. Oczyść i osusz czaszkę otaczającą otwór zadziorów za pomocą bawełnianego wacika.
  2. Ostrożnie umieść przewodzącą pastę EEG na jednej płaskiej stronie elektrody pająka EEG. Pozostaw mały otwór z dala od pasty EEG na elektrodzie pająka, aby umożliwić przejście mikroelektrody wielolaminarnej przez otwór bez kontaktu pasty z elektrodą pająka. Zapobiega to kontaktowi elektrycznemu między elektrodą EEG a mikroelektrodą.
  3. Dopasuj elektrodę pająka do otworu w czaszce, tak aby pasta EEG była skierowana w stronę czaszki.
  4. Ostrożnie dociśnij elektrodę pająka do czaszki, mocno dotykając czaszki za pomocą pasty EEG. Usuń pastę zasłaniającą otwór zadziorów za pomocą igły na strzykawce.
  5. Usuń nadmiar pasty EEG poza obwód elektrody pająka, tak aby kontakt między elektrodą pająka a czaszką był przestrzennie ograniczony do rozmiaru elektrody (Rysunek 1B).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ogólna konfiguracja do jednoczesnego zapisu EEG/LFP. (A) Konfiguracja składa się ze zmodyfikowanego stożka nosowego ułatwiającego stymulację opuszki wąsa w znieczuleniu izofluranowym, dwóch elektrod stymulujących umieszczonych w opuszku wąsów, elektrody pająka umieszczonej na czaszce powyżej kory lufy przeciwnie do elektrod stymulujących, wielokanałowej mikroelektrody wprowadzonej do kory lufy przez elektrodę pająka oraz elektrod referencyjnych umieszczonych w nacięciu z tyłu szyi szczura. (B) Widok przez mikroskop elektrody pająka bezpiecznie umieszczonej na czaszce za pomocą pasty EEG. Mikroelektrodę wkłada się do otworu żarnowego wywierconego w czaszce pod elektrodą pająka. Skóra głowy jest przytrzymywana przez nić chirurgiczną (szew) przywiązaną do ramy stereotaktycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Rozsmaruj pastę EEG na elektrodzie referencyjnej EEG i umieść ją bezpiecznie w nacięciu z tyłu szyi szczura.
  2. Podłącz elektrody EEG do przedwzmacniacza za pomocą pasywnego rozdzielacza sygnału dla sygnałów o niskiej impedancji ( Rysunek 2). Upewnij się, że impedancja elektrody krzyżakowej jest niższa niż 5 kΩ. Jeśli tak nie jest, sprawdź, czy pasta EEG ma dobry kontakt z czaszką, a elektroda jest mocno dociśnięta do pasty EEG. W razie potrzeby dodaj więcej pasty EEG.
  3. Zamontuj ramię mikromanipulatora na ramie stereotaktycznej. Podłącz liniową 16-kanałową mikroelektrodę (odstęp 100 μm, powierzchnia każdego miejsca 177 μm2) do 16-kanałowej ostrej głowicy zaciśniętej bezpiecznie na ramieniu mikromanipulatora.
  4. Rozsmaruj pastę EEG na elektrodach referencyjnych EEG i mikroelektrodzie, a następnie bezpiecznie umieść je w nacięciu (Rysunek 1A).
  5. Wyreguluj kąt ramienia mikromanipulatora tak, aby mikroelektroda była prostopadła do powierzchni kory mózgowej. Kąt ten wynosi zwykle od 25 do 35 °.
  6. Opuść mikroelektrodę pod mikroskopem, obracając pokrętła mikromanipulatora tak, aby końcówka mikroelektrody była skierowana na mały otwór na dnie otworu żarna, aż najwyższa elektroda wniknie w powierzchnię kory. Należy uważać, aby nie wciskać mikroelektrody na powierzchnię opony twardej, ponieważ mogłoby to spowodować uszkodzenie elektrody.
  7. Połącz 16-kanałową mikroelektrodę z przedwzmacniaczem podłączonym do jednostki akwizycji danych za pomocą światłowodowego (Rysunek 2).
  8. Włącz przedwzmacniacz, jednostkę akwizycji danych i komputer podłączony do urządzenia. Włącz skrzynkę stymulatora.
  9. Włóż mikroelektrodę normalnie do powierzchni kory mózgowej, powoli obracając pokrętło osi z mikromanipulatora na głębokość 1,500 μm20.
  10. Mikroreguluj głębokość, przykładając ciąg bodźców do podkładki wąsów i obserwując 16-kanałowy LFP wywołany na monitorze komputera za pomocą oprogramowania jednostki akwizycji danych zainstalowanej na komputerze. Ostrożnie obracaj pokrętłem osi z na mikromanipulatorze, aż największa amplituda wywołanego LFP wystąpi wokół kanału 7 (ponieważ zbiega się to z warstwą IV w korze mózgowej).
    UWAGA: Konfiguracja elektrody Ipsi-boczna EEG: W niektórych eksperymentach drugą elektrodę pająka umieszczono po bocznej stronie ipsi-nienaruszonej czaszki powyżej kory lufy. Taka konfiguracja pozwoliła na obustronny zapis EEG w stanie spoczynku, aby zbadać wpływ otworu zadziorowego na sygnał EEG.
    UWAGA: Procedura chirurgiczna polegająca na ustawieniu elektrody EEG jest identyczna z opisaną powyżej, z wyjątkiem tego, że podczas kroku 2.6 mięsień skroniowy po każdej stronie głowy został ostrożnie oddzielony od czaszki, zszyty z powrotem i bezpiecznie przywiązany do odpowiedniej strony ramy stereotaktycznej.
    UWAGA: Jednoczesna konfiguracja EEG/LFP jest również identyczna z opisaną powyżej, z dodatkowym krokiem, w którym druga elektroda pająka jest ładowana pastą EEG, a następnie mocno dociskana do czaszki powyżej kory lufy bocznej ipsi.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Diagram przepływu sygnału. Szczura umieszcza się w klatce Faradaya. Elektrody stymulujące otrzymują polecenia ze skrzynki stymulatora sterowanej przez Jednostkę Akwizycji Danych za pośrednictwem jej oprogramowania zainstalowanego na komputerze PC. Sygnał neuronowy rejestrowany przez mikroelektrodę jest przesyłany do przedwzmacniacza wewnątrz klatki Faradaya. Sygnał neuronowy rejestrowany przez sondę EEG jest przesyłany do przedwzmacniacza za pośrednictwem rozdzielacza sygnału. Przedwzmacniacz jest podłączony do jednostki akwizycji danych na zewnątrz klatki Faradaya za pomocą światłowodowego. Dane neuronowe są następnie przechowywane na dysku lokalnym na komputerze, a także mogą być wyświetlane na monitorze komputera. Mobilny system izofluranu dla małych zwierząt podaje izofluran spoza klatki Faradaya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Stymulacja elektryczna i nagrania neuronalne

UWAGA: Częstotliwość próbkowania dla wszystkich danych neuronowych wynosi 24,41 kHz z rozdzielczością 16-bitową. Badanie składa się z pojedynczej stymulacji elektrycznej na początku badania. Każda próba trwa 10 sekund, co jest również interwałem między bodźcami (ISI). Każdy bodziec to impuls prądu kwadratowego o natężeniu 1,2 mA trwający 0,3 ms. W przypadku dwustronnych eksperymentów mających na celu zbadanie wpływu otworu w zadziorach rejestrowany jest również ciągły stan spoczynku wynoszący 250 s.

  1. Otwórz oprogramowanie do nagrywania na używanym komputerze.
  2. Załaduj prawidłowy obwód dla eksperymentu, wybierając pozycję "Załaduj projekt..." z menu rozwijanego "OpenProject". Pojawi się nowe okno ('WorkBench') (Rysunek 3).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wyświetlanie graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania dla jednostki akwizycji danych. Pozwala na wgranie odpowiedniego obwodu, ustawienie parametrów stymulacji oraz rejestrację i wizualizację danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Utwórz nowy katalog (nazywany przez oprogramowanie "Czołgiem") do przechowywania nagrań neuronowych.
    1. Kliknij "Plik" w górnej części okna i wybierz "Zarządzanie zadaniami danych". Pojawi się nowe okno ("Zarządzanie zbiornikami").
    2. W oknie "Zarządzanie zbiornikami" naciśnij prawy przycisk myszy, aby wyświetlić menu. Wybierz opcję "Utwórz nowy czołg". Pojawi się kolejne nowe okno ("Utwórz zbiornik danych").
    3. W oknie 'Create Data Tank' (Utwórz zbiornik danych) wybierz ścieżkę, w której planujesz utworzyć nowy katalog danych, a następnie wprowadź nazwę nowego katalogu. Następnie naciśnij "OK". To okno zniknie.
    4. Nowy katalog pojawi się w oknie "Zarządzanie zbiornikami", ale w kolorze szarym. Zarejestruj ten katalog, klikając go prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zarejestruj czołg" z menu rozwijanego. Czerwona gwiazdka i zielona strzałka pojawią się po lewej stronie nazwy nowego katalogu, która jest teraz w kolorze czarnym (Rysunek 4).
    5. Wyrejestruj wszystkie poprzednie katalogi, które nie były używane, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie "Zarządzanie zbiornikami" i wybierając "Odśwież listę czołgów" z menu rozwijanego.
    6. Kliknij "OK", aby wyjść z okna "Zarządzanie zbiornikami".

figure-protocol-4
Rysunek 4: Wyświetlanie graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania z zarejestrowanym katalogiem danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zarejestruj nowy katalog w polu "Zakres", aby wyświetlać sygnały neuronowe podczas eksperymentu.
    1. Kliknij ikonę "Zakres" w oknie "OpenProject". Pojawi się nowe okno ("Zakres").
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie "Zakres" i wybierz "Odśwież listę czołgów" z menu rozwijanego. Nazwa nowego katalogu będzie wyświetlana w kolorze szarym.
    3. Kliknij nowy katalog. Czerwona gwiazdka i zielona strzałka pojawią się po lewej stronie nazwy nowego katalogu, która jest teraz w kolorze czarnym.
  2. Ustaw parametry eksperymentalne do pozyskiwania danych w oknie "WorkBench", klikając "Konfiguracja" w górnej części okna. Pojawi się nowe okno. Wybierz opcję "Sweep loop", ustaw długość próby i liczbę prób, które mają być rejestrowane.
  3. Sprawdź, czy skrzynka stymulatora jest włączona.
  4. Naciśnij przycisk "Nagraj" w oknie "WorkBench". Pojawi się nowe okno. Wprowadź nazwę pliku danych, który chcesz zapisać na potrzeby eksperymentu, ale na tym etapie nie naciskaj przycisku powrotu, ponieważ parametry zapisu EEG muszą być ustawione.
  5. Ustaw parametry zapisu EEG za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI) na przedwzmacniaczu. Dotknij ekranu (w dowolnym miejscu) przedwzmacniacza, aby wybudzić ekran. Wybierz "Odblokuj", aby odblokować wyświetlacz (Rysunek 5).
    1. Naciśnij lewą ikonę w panelu "2: EEG". Pojawi się nowy ekran.
    2. Naciśnij "Sprzężenie" i wybierz "AC".
    3. Naciśnij "Ref Mode" i wybierz "Lokalny".
    4. Naciśnij "Samp Rate" i wybierz "25KHz".
    5. Naciśnij "OK", aby powrócić do oryginalnego wyświetlacza.

figure-protocol-5
Ilustracja 5: graficzny interfejs użytkownika przedwzmacniacza. Pozwala na ustawienie parametrów zapisu EEG (np. częstotliwości próbkowania i preferencji referencyjnych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Sprawdź impedancję sondy EEG, naciskając środkową ikonę w panelu "2: EEG". Jeśli jest zbyt wysoka, dodaj więcej pasty EEG do sondy. Naciśnij "OK", aby powrócić do oryginalnego wyświetlacza.
  2. Odczekaj 20 sekund, aby uniknąć rejestrowania początkowych wahań zapisów EEG.
  3. Wróć do monitora komputera (po 20 sekundach oczekiwania) i naciśnij "Return" na klawiaturze. Sygnały EEG i LFP będą rejestrowane.

5. Analiza danych

  1. Wstępnie przetwórz wywołane sygnały LFP i EEG na zasadzie próba po próbie, wykonując następujące kroki.
    1. Cofnij dane neuronowe w czasie o 20 próbek (co odpowiada 0,82 ms). Jest to opóźnienie wytwarzane przez obwód używany do zbierania danych neuronowych w samym TDT. Przesuwając dane, punkt zerowy czasu jest dostosowywany do początku bodźca.
    2. Usuń artefakt bodźca, zastępując dane neuronowe od 0 do 1 ms linią prostą łączącą punkt danych w 0 ms z punktem danych w 1 ms.
    3. Zerowa średnia każdej próby, odejmując średnią wartość sygnału neuronowego 200 ms przed nadejściem bodźca.
    4. Filtruj dolnoprzepustowe dane poniżej 800 Hz za pomocą filtra typu Butterworth IIR 4 rzędu w obu kierunkach, aby uniknąć wprowadzania jakichkolwiek przesunięć czasowych w danych.
    5. Dopasuj dane wielowarstwowe do wszystkich zwierząt. Dla danych LFP każdego zwierzęcia zastosuj analizę odwrotnej gęstości źródła prądu (splajn iCSD, promień źródła R = 0,5 mm) 21 z filtrem Gaussa (λ = 50 μm), aby zlokalizować warstwę IV sink1, która jest określona przez największy ujemny pik występujący na głębokości kory mózgowej poniżej powierzchni bodźca w ciągu pierwszych 15 ms od wystąpienia bodźca. Dane z CSD i odpowiadającego mu LFP są następnie wyrównywane zgodnie z ich położeniem w ujściu na zwierzętach. Wspólny zlew znajduje się w warstwie IV, ~ 600 μm poniżej powierzchni pialu.
    6. Po wyrównaniu użyj kanałów 2, 7 i 12 wyrównanego LFP jako reprezentantów odpowiedzi neuronalnych warstw supraziarnistych, ziarnistych i podziarnistych, odpowiednio w korze lufy.
  2. Oblicz średnią wywołaną LFP i EEG, uśredniając wstępnie przetworzone dane z 100 prób.
  3. Aby zbadać wpływ otworu w zadziorach na EEG, należy zmniejszyć próbkowanie sygnałów EEG do 1000 Hz i obliczyć gęstość widmową mocy (PSD) dla nagrań elektrod pająka przeciwbieżnych (z otworem w czaszce) i ipsi-bocznych (nienaruszona czaszka) w okresie spoczynku trwającym 250 sekund. PSD jest obliczane w zakresie 0,1-100 Hz w Matlabie za pomocą funkcji 'pmtm', która jest oparta na metodzie multitaper22.
  4. Podziel zakres częstotliwości na następujące dobrze znane pasma częstotliwości: Delta (δ): 0,1-4 Hz, Theta (): 4-8 Hz, Alfa (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. Oblicz średnią PSD w każdym paśmie.
  5. W każdym paśmie częstotliwości oblicz znormalizowaną różnicę w PSD, Perr, między przeciw- i ipsi-bocznym EEG, używając równania:
    figure-protocol-6
    gdzie Pc i Pi i są średnimi PSD EEG przeciw- i ipsi-stronnego, odpowiednio w paśmie częstotliwości będącym przedmiotem zainteresowania.
  6. W każdym paśmie częstotliwości wykonaj test t dla jednej próby, aby przetestować hipotezę, że nie ma znaczącej różnicy (na poziomie istotności 0,05) między PSD sygnału EEG zarejestrowanego z dwóch półkul.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane od 4 szczurów zostały uśrednione, aby uzyskać średnie szeregi czasowe tam, gdzie było to możliwe. Amplituda wywołanej odpowiedzi EEG, znana również jako potencjał związany ze zdarzeniem (ERP), jest zwykle znacznie mniejsza niż w przypadku LFP. Rysunek 6 pokazuje średnią ERP i LFP odpowiednio w warstwach supraziarnistych, ziarnistych i podziarnistych kory beczkowej. Pasmo błędu na każdym wykresie jest odpowiadającym mu błędem standardowym. Można zauważyć, że ERP jest około 10 razy mniejszy niż przywoływany LFP.

figure-results-1
Rysunek 6: Średnie (n = 4) sygnały neuronowe ERP, supragranularnego, granularnego i infrakrystalicznego LFP. Cień oznacza błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównania dynamiki czasowej ERP i LFP są pokazane w Rysunek 7. Bezpośrednia superpozycja ERP i supragranularnego LFP w Rysunek 7A ilustruje różnice w rzędzie amplitudy między tymi dwoma typami sygnałów neuronowych. Aby porównać dynamikę czasową, zarówno ERP, jak i LFP są znormalizowane w odniesieniu do ich ujemnej amplitudy szczytowej. Rysunek 7B i 7C pokazują znormalizowany ERP nałożony odpowiednio na znormalizowany supragranularny LFP i znormalizowany granulowany LFP.

Z Rysunek 7B wynika, że szczyty P1 i N1 dla ERP są bardziej opóźnione niż odpowiadające im piki LFP w warstwie supragranularnej. Jednak profile czasowe tych dwóch sygnałów neuronowych są podobne, przy czym P1 poprzedza N1. Z drugiej strony, profil czasowy ERP znacznie różni się od profilu granulowanego (warstwa IV kory beczkowej) LFP (Rysunek 7C). Co ważne, nie są one swoimi lustrzanymi odbiciami, przy czym ziarnisty LFP jest zdominowany przez pojedynczy ujemny pik (odzwierciedlający główny spadek w warstwie korowej IV), podczas gdy ERP składał się głównie z dwóch pików o przeciwnej polaryzacji.

figure-results-2
Rysunek 7: Porównanie dynamiki czasowej systemów ERP i LFP. (A) ERP (linia ciągła) nałożona na nadziarnisty LFP (linia przerywana). Cień oznacza błąd standardowy. (B) Znormalizowany ERP (linia ciągła) nałożony na znormalizowany nadziarnisty LFP (linia przerywana). (C) Znormalizowany ERP (linia ciągła) nałożony na znormalizowany ziarnisty LFP (linia przerywana). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sygnał ERP został zmierzony za pomocą elektrody pająka umieszczonej na czaszce z wywierconym w niej otworem na zadziory. Aby zbadać wpływ na zapisy EEG, kolejną elektrodę pajęczą umieszczono na nienaruszonej czaszce powyżej kory ipsi-bocznej lufy. Zadbano o to, aby impedancje dwóch elektrod pająka były porównywalne pod względem wielkości, dostosowując ilość użytej pasty EEG. Przedstawiono tutaj dane pochodzące od czterech szczurów (które nie były tymi samymi szczurami użytymi powyżej).

Rysunek 8 pokazuje równoczesne zapisy EEG stanu spoczynku z obu elektrod jednego szczura, z danymi 100 s wyświetlanymi w Rysunek 8A, a dane w prostokątnej ramce (20 s) są rozwinięte w Rysunek 8B. Oba sygnały EEG w dużej mierze różnią się od siebie, w podobnym zakresie amplitudy. Rysunek 9 pokazuje PSD czterech szczurów, przy czym górny rząd używa skali liniowej na osi częstotliwości, a dolny rząd używa skali logarytmicznej na osi częstotliwości, aby zapewnić rozszerzony widok w dolnym zakresie częstotliwości. Z Rysunek 9, nie wydaje się, aby w PSD istniała spójna stronniczość między tematami. Zostało to potwierdzone przez przeprowadzenie testów t dla jednej próby na znormalizowanych różnicach w uśrednionym PSD w pięciu pasmach częstotliwości, pokazanych na Rysunek 10. Żadna ze znormalizowanych różnic PSD w tych pasmach częstotliwości nie różniła się istotnie od zera (odpowiednio p = 0,32, 0,46, 0,85, 0,69 i 0,97).

figure-results-3
Rycina 8: Obustronne zapisy EEG. (A) Zapis EEG czaszki w stanie spoczynku z otworem w czaszce () i jednoczesny zapis EEG na przeciwległej półkuli z nienaruszoną czaszką (szary). (B) Rozszerzony widok przebiegów w prostokątnej ramce w (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 9: Gęstość widmowa mocy (PSD) EEG przeciwstawnego (niebieskiego) i ipsi-bocznego (czerwonego). Każda kolumna pokazuje PSD dla jednego szczura. Górne panele używają liniowej skali częstotliwości, podczas gdy dolne panele używają logarytmicznej skali częstotliwości, aby umożliwić wizualizację PSD w dolnym zakresie częstotliwości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 10: Analiza grupowa. Znormalizowana różnica między przeciwstawnym i ipsi-bocznym PSD z pięcioma pasmami częstotliwości: Delta, Theta, Alfa, Beta i Gamma. Każdy słupek pokazuje średnie znormalizowane różnice w paśmie częstotliwości, przy czym błąd standardowy jest pokazany jako słupek błędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy eksperymentalną procedurę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanych sygnałów EEG i LFP szczura znieczulonego izofluranem w odpowiedzi na stymulację opuszki wąsów. Mikroelektrodę wprowadzono do kory nowej przez otwór w elektrodzie pająka EEG, który był wyrównany z otworem w czaszce. Elektroda została przymocowana do czaszki za pomocą przewodzącej i adhezyjnej pasty EEG23. Stożek nosowy używany do podawania izofluranu został zmodyfikowany tak, aby elektrody stymulujące mogły być z łatwością wprowadzane do opuszki wąsów.

Pasta EEG skutecznie przymocowała elektrodę pająka do czaszki, zapewniając jednocześnie doskonałe przewodnictwo elektryczne przez cały dzień eksperymentalny bez konieczności dodatkowego stosowania pasty. Zastąpił on niepożądane użycie kleju do przymocowania obwodu elektrody pająka do czaszki, ponieważ klej nie przewodzi prądu i może zwiększyć impedancję elektrody, jeśli przebiega między czaszką a elektrodą. Pasta EEG ma wiele zalet w porównaniu z żelem EEG, który jest trudny do uformowania wokół otworu zadziorów i może wyschnąć podczas eksperymentu, co skutkuje słabymi sygnałami EEG.

Gdy szczur został umieszczony w klatce Faradaya, szum elektryczny spowodowany środowiskiem został znacznie stłumiony. Czasami jednak sygnał neuronowy był nadal dość głośny. W większości przypadków było to spowodowane tym, że elektroda referencyjna nie była prawidłowo ustawiona i dlatego wymagała ponownej regulacji lub użycia większej ilości pasty EEG. Innym częstym problemem było to, że wywołany LFP miał małą amplitudę. Może to być spowodowane tym, że mikroelektroda nie znajduje się w środku obszaru korowego aktywowanego przez elektrody stymulujące. Zamiast ponownie wprowadzać mikroelektrodę, co mogłoby spowodować większe uszkodzenie lokalnych neuronów, zwykle dostosowywaliśmy położenie elektrod stymulujących w podkładce wąsów, aż do momentu, gdy można było zaobserwować rozsądną amplitudę LFP (>3 mV).

Jednym z ograniczeń tej techniki jest słaba rozdzielczość przestrzenna elektrody pająka, która ma średnicę 6 mm. Jest to duże w porównaniu z rozmiarem czaszki szczura. Niestety, zastosowana tutaj elektroda krzyżowa jest najmniejszą dostępną do kupienia. Pożądane będzie zmniejszenie średnicy elektrody pająka do 2-4 mm, zwiększając w ten sposób specyficzność przestrzenną zapisów EEG, dzięki czemu porównanie sygnału EEG z sygnałem nadziarnistym LFP będzie mniej niejednoznaczne.

Szczególnej uwagi wymaga kilka krytycznych etapów protokołu. Pierwszym z nich jest wprowadzenie mikroelektrody przez otwór w zadziorach. Ponieważ opona twarda jest poza tym nienaruszona, precyzja włożenia ma kluczowe znaczenie. Niewielka rezystancja na końcówce elektrody zwykle oznacza, że elektroda nie jest prawidłowo ustawiona. Należy go podnieść, wyregulować pozycję i ponownie włożyć. Drugi to położenie stożka nosowego na szczurze. Nie może być zbyt luźny, ponieważ izofluran ucieknie ze stożka. Nie może być również zbyt ciasny, ponieważ może to zatkać nozdrza szczura i spowodować trudności w oddychaniu. Szczególną uwagę należy również zwrócić na to, aby amplituda zapisu EEG była znacznie mniejsza (zwykle od 5 do 10 razy mniejsza) niż w przypadku zapisu górnego kanału LFP. Jeśli są podobne, oznacza to, że sonda EEG miała bezpośredni lub pośredni kontakt z mikroelektrodą. Kontakt pośredni odbywa się zwykle przez płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), który czasami wypełnia otwór wywiercony w czaszce. Przewodność płynu mózgowo-rdzeniowego jest zwykle 100 razy większa niż czaszki24,25. Tak więc, jeśli poziom płynu mózgowo-rdzeniowego wewnątrz otworu zadziorowego jest wystarczająco wysoki, może on zetknąć się z elektrodą krzyżową. Aby tego uniknąć, otwór należy często czyścić super chłonnymi bawełnianymi gąbkami, takimi jak włócznie absorpcyjne.

Wpływ otworu zadziorowego (średnica <2 mm) w czaszce na zapis EEG otaczający otwór badano poprzez umieszczenie kolejnej elektrody pająka na nienaruszonej czaszce na szczycie bocznej kory lufy ipsi, aby można było porównać obustronne zapisy EEG. Wyniki przedstawione na wykresach 9 i 10 sugerują, że efekt jest nieistotny na poziomie istotności 0,05. Inne czynniki wpływające na amplitudę EEG obejmują to, jak dobrze pasta EEG stykała się z czaszką, jak mocno elektroda była dociśnięta do pasty oraz przestrzenny zasięg pasty EEG na czaszce.

Warto również zauważyć, że opisany tutaj protokół rejestrował EEG czaszki, co różni się od EEG skóry głowy stosowanego w badaniach EEG na ludziach. Skóra głowy działa jak rezystor lub filtr dolnoprzepustowy, co jeszcze bardziej zmniejszy stosunek sygnału do szumu w zapisie EEG.

Wreszcie, porównanie dynamiki czasowej ERP i dynamiki wywołanego LFP w warstwach korowych sugeruje, że somatosensoryczny potencjał wywołany lepiej odzwierciedla LFP w warstwie nadziarnistej kory mózgowej niż w warstwie ziarnistej i podkrystalicznej. Jest to zgodne z naszą wcześniejszą pracą6, pokazującą, że początkowy segment (P1) ERP jest związany z prądem powrotnym powstającym w wyniku napływu pobudzającego prądu synaptycznego występującego w warstwie ziarnistej, podczas gdy późniejszy spadek (N1) w ERP może być związany z opóźnionym przybyciem aferentnego wzgórza do warstw korowych II/III i/lub sygnałów sprzężenia zwrotnego z głębszych warstw korowych. Podsumowując, równoczesne zapisy EEG/LFP mogą poszerzyć zrozumienie neuronalnej genezy EEG i ułatwić matematyczne modelowanie EEG pod względem sygnałów neuronalnych w warstwach kory mózgowej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Andrew Crippsowi i Jednostce Zasobów Biologicznych na Uniwersytecie w Reading. Badania zostały sfinansowane przez BBSRC (numer grantu: BB/K010123/1). Dane związane z tą pracą są swobodnie dostępne w Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Samica szczura Lister HoodCharles Rivers
Elektroda pająkaUnimed Electrode Supplies LtdSCS24-426
Pasta EEG: Ten20Unimed Electrode Supplies Ltd10-20-S
Uchwyt stereotaktyczny z dwoma ramionami mikromanipulatora: Rama stereotaktyczna z podwójnym manipulatorem 18° Listwy nauszneWPI (World Precision Instruments)502603
IsofluraneNational Vet Services Limited50878
Stożek nosowy z twardego plastiku: Maska przeciwgazowa anestezjologiczna dla szczuraWPI502054
System znieczulenia izofluranem dla małych zwierzątWPIEZ-B800A Termostatyczna poduszka
grzewcza: Rat Blanket System 230 VHarvard Apparatus Wielka Brytania50-7221-F
Maść okulistyczna: Optixcare Lubrykant do oczuViovet203865
Chlorowodorek lidokainy (wstrzyknięcie 2%)Larkmead Vets
Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, HollowWPI503421
Ząbkowane i zakrzywione kleszczyki preparacyjneWPI15915
Pleciony jedwab, niewchłanialny szew: Mersilk Suture W502HNational Vet Services Limited153746
Wiertło dentystyczne: BONE MICRO DRILL SYST 230 VACHarvard Apparatus UK72-4860
Sterylna sól fizjologiczna: Chlorek sodu 0,9%Animalcare Ltd14K26BT
Wiertło #4 : Młyn kulowy, węglik spiekany, # 4Harvard Apparatus UK72-4958
Wiertło # 4 : Młyn kulowy, węglik spiekany, # 1/4Aparat Harvard UK72-4962
Klatka FaradayaNewport CorporationVIS-FDC-3600
Stacja robocza z izolacją drgań: Vision IsoStationNewport CorporationM-VIS3660-RG4-325A
: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp.WPIO15001
Przezroczysty miękki stożek nosowy: Microflex Non-Rebreathing Unit ze szczurem NoseconeWPIEZ-103A
Elektrody stymulujące ze stali nierdzewnejPlasticsOneE363/1/SPC
Izolowany stymulator prąduWyprodukowany w domu
16-kanałowa mikroelektroda, 100 μ m rozstaw, powierzchnia każdej witryny 177 μ m2NeuroNexusA1x16-10mm-100-177-A16
16-kanałowa ostra stacja czołowaTucker David Technologies Inc., TDTRA16AC-Z
Przedwzmacniacz: 64-kanałowy przedwzmacniacz neuro-cyfrowy serii ZTDTPZ5-64
Pasywny rozdzielacz sygnału: 32-kanałowy rozdzielacz do PZ5TDTS-BOX_PZ5
Jednostka akwizycji danych: Procesor RZ2 BioAmp. Seria Z 4-DSP ultra wysokowydajny procesorTDTRZ2-4
Oprogramowanie do neurofizjologii: OpenEXTDT
Matlab MathWorks
Włócznie absorpcyjneFine Sicence Tools18105-01
Jednostka sterująca i czujnik pulsoksymetru

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiol Rev. 65 (1), 37-100 (1985).
  2. Logothetis, N. K. The Underpinnings of the BOLD Functional Magnetic Resonance Imaging Signal. J Neurosci. 23 (10), 3963-3971 (2003).
  3. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  4. Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).
  5. Zheng, Y., et al. Balanced excitation and inhibition: Model based analysis of local field potentials. Neuroimage. 63 (1), 81-94 (2012).
  6. Bruyns-Haylett, M., et al. The neurogenesis of P1 and N1: A concurrent EEG/LFP study. Neuroimage. 146, 575-588 (2017).
  7. Nunez, P. L. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press. (1981).
  8. Jackson, A. F., Bolger, D. J. The neurophysiological bases of EEG and EEG measurement: A review for the rest of us. Psychophysiology. 51 (11), 1061-1071 (2014).
  9. Cohen, M. X. Where Does EEG Come From and What Does It Mean? Trends Neurosci. 40 (4), 208-218 (2017).
  10. Bojak, I., Oostendorp, T., Reid, A., Kötter, R. Connecting Mean Field Models of Neural Activity to EEG and fMRI Data. Brain Topogr. 23 (2), 139-149 (2010).
  11. Coombes, S. Large-scale neural dynamics: Simple and complex. Neuroimage. 52 (3), 731-739 (2010).
  12. Deco, G., Jirsa, V. K., Robinson, P. A., Breakspear, M., Friston, K. J. The dynamic brain: from spiking neurons to neural-masses and cortical fields. PLoS Comput. Biol. 4 (8), e1000092(2008).
  13. Pinotsis, D. A., Friston, K. J. Neural fields, spectral responses and lateral connections. Neuroimage. 55 (1), 39-48 (2011).
  14. Riera, J. J., et al. Pitfalls in the dipolar model for the neocortical EEG sources. J Neurophysiol. 108 (4), 956-975 (2012).
  15. Valdes, P. A., Jimenez, J. C., Riera, J., Biscay, R., Ozaki, T. Nonlinear EEG analysis based on a neural mass model. Biol Cybern. 81 (5), 415-424 (1999).
  16. Musall, S., von Pföstl, V., Rauch, A., Logothetis, N. K., Whittingstall, K. Effects of Neural Synchrony on Surface EEG. Cereb Cortex. 24 (4), 1045-1053 (2014).
  17. Snyder, A. C., Morais, M. J., Willis, C. M., Smith, M. A. Global network influences on local functional connectivity. Nat Neurosci. 18 (5), 736-743 (2015).
  18. Mayhew, J., et al. Spectroscopic analysis of neural activity in brain: Increased oxygen consumption following activation of barrel cortex. Neuroimage. 12 (6), 664-675 (2000).
  19. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Academic Press. (2005).
  20. Martindale, J., et al. The hemodynamic impulse response to a single neural event. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (5), 546-555 (2003).
  21. Pettersen, K. H., Devor, A., Ulbert, I., Dale, A. M., Einevoll, G. T. Current-source density estimation based on inversion of electrostatic forward solution: Effects of finite extent of neuronal activity and conductivity discontinuities. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 116-133 (2006).
  22. Thomson, D. J., et al. Multitaper analysis of nonstationary and nonlinear time series data. Nonlinear and Nonstationary Signal Processing. Fitzgerald, W. J., et al. , 317-394 (2000).
  23. Bae, J., Deshmukh, A., Song, Y., Riera, J. Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (100), e52700(2015).
  24. Baumann, S. B., Wozny, D. R., Kelly, S. K., Meno, F. M. The electrical conductivity of human cerebrospinal fluid at body temperature. IEEE Trans Biomed Eng. 44 (3), 220-223 (1997).
  25. Wendel, K., et al. The Influence of Age and Skull Conductivity on Surface and Subdermal Bipolar EEG Leads. Computational Intelligence and Neuroscience. 2010, (2010).
  26. Flemming, L., et al. Evaluation of the distortion of EEG signals caused by a hole in the skull mimicking the fontanel in the skull of human neonates. Clin Neurophysiol. 116 (5), 1141-1152 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja wsp lokalizacyjnauchwyt stereotaksycznyotw r trepanacyjnywprowadzanie mikroelektrodaplikacja pasty EEGstymulacja opuszek wibrys wmonitorowanie wywo anego LFPanaliza sygna u ERP

Powiązane artykuły