Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Podsumowanie

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Streszczenie

Chociaż złożone organizmy wydają się statyczne, ich tkanki podlegają ciągłej rotacji. Gdy komórki starzeją się, umierają i są zastępowane przez nowe komórki, komórki poruszają się w tkankach w ściśle zaplanowany sposób. Podczas rozwoju guza równowaga ta zostaje zaburzona, a komórki nowotworowe opuszczają nabłonek, z którego pochodzą, aby zaatakować lokalne mikrośrodowisko, przemieszczać się do odległych miejsc i ostatecznie utworzyć guzy przerzutowe w odległych miejscach. Test punktowy jest prostym, dwuwymiarowym, nieograniczonym testem migracji, służącym do oceny ruchu netto arkuszy komórek do obszaru wolnego od komórek oraz do analizy parametrów migracji komórek za pomocą obrazowania poklatkowego. W tym przypadku test kropkowy jest demonstrowany przy użyciu ludzkiej inwazyjnej linii komórkowej raka piersi tworzącej kolonię płuc, MCF10CA1a, w celu analizy odpowiedzi migracyjnej komórek na naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), o którym wiadomo, że zwiększa potencjał złośliwy komórek raka piersi i zmienia fenotyp migracyjny komórek.

Wprowadzenie

Testy migracji są powszechnie stosowane do oceny potencjału inwazyjnego i przerzutowego komórek nowotworowych in vitro. Najczęściej test ran lub zadrapań jest używany do oceny migracji arkuszy nabłonka do obszaru oczyszczonego z komórek^1,2,3. Aby przeprowadzić test zarysowania, komórki są platerowane w monowarstwę i za pomocą końcówki pipety tworzony jest obszar "zadrapania" lub wolny od komórek. Test zarysowania jest łatwy do skonfigurowania za pomocą powszechnie dostępnych materiałów do hodowli tkankowych i może być wykonywany na płytkach wielodołkowych, co pozwala na przetwarzanie wielu próbek. Jednak w miarę tworzenia zadrapania komórki są fizycznie usuwane z monowarstwy i często ulegają śmierci komórkowej. Co więcej, macierz zewnątrzkomórkowa przymocowana do płytki często ulega uszkodzeniu podczas procesu drapania. Podobnie, użycie wkładek silikonowych (takich jak Ibidi chambers⁴) lub szablonów^5,6,7 może prowadzić do mechanicznego rozerwania komórek i częściowego usunięcia białek macierzy używanych do powlekania płytek. Kolejną wadą testów monitorujących zamknięcie ran czy zadrapań jest ich ograniczony przebieg w czasie, ponieważ migracja komórek może być analizowana tylko do momentu zamknięcia rysy.

Podczas wykonywania testu punktowego, komórki są umieszczane jako okrągła kolonia na powlekanej lub niepowlekanej płytce⁸. Uzasadnieniem dla tej strategii posiewu jest uzyskanie arkuszy komórek o zdefiniowanych krawędziach, które mogą migrować lub atakować otaczające obszary wolne od komórek bez zakłócania hodowli poprzez usuwanie komórek lub wkładek. Ogólnym celem testu punktowego jest obserwacja migracji arkuszy komórkowych mierzonej przemieszczeniem krawędzi lub średnicą kolonii, a także wykonanie obrazowania poklatkowego w celu analizy fenotypu migracyjnego komórek w wyższej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Na migrację komórek mogą wpływać różne sygnały mikrośrodowiskowe, takie jak chemokiny, cytokiny i czynniki wzrostu, takie jak EGF. EGF jest czynnikiem wzrostu, który wywiera swoje efekty biologiczne poprzez wiązanie się ze swoim receptorem, receptorem EGF⁹, i zwiększa inwazyjne i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych^4,9,10. W tym przypadku test kropkowy jest używany do badania stymulowanej przez EGF migracji komórek w ludzkiej inwazyjnej linii komórkowej raka piersi tworzącej kolonię płuc (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protokół

1. Powlekanie naczyń (Dzień 1)

UWAGA: Upewnij się, że nie pozostawiasz odcisków palców ani brudu na spodzie płytki podczas jej obsługi.

1. Rozmrozić kolagen myszy IV na lodzie i rozcieńczyć go 50 mM HCl (pH 1,3), aby przygotować 3 ml 10 μg/ml roztworu kolagenu dożylnie.
   UWAGA: Kolagen wytrąca się w temperaturze 37 °C. Dlatego ważne jest, aby utrzymywać roztwór kolagenu w niskiej temperaturze podczas rozmrażania i pracy z nim. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, przygotowując porcje o odpowiedniej wielkości i przechowując je w temperaturze -80 °C.
2. Dodaj 250 μl kolagenowego roztworu dożylnego do każdego dołka 12-dołkowych szklanych płytek dolnych i umieść je w szczelnie zamykanym plastikowym pudełku o odpowiedniej wielkości. Umieść mokry ręcznik papierowy na talerzach i wokół nich, aby uzyskać wilgotną komorę i zamknij pudełko. Inkubować płytki przez noc w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Ponieważ tylko obszar wzrostu musi być pokryty, wystarczy pokryć tylko szkiełko nakrywkowe, które jest przymocowane do dolnej części płytki, roztworem kolagenu (patrz Rysunek 1A, B dla schematu płytki).
3. Następnego ranka dwukrotnie przepłucz płytki dejonizowanym_H2O, aby usunąć niewchłonięty kolagen i bufor. Wodę należy skierować do krawędzi płytki, a nie do krawędzi utworzonej przez dno płytki i szkiełko nakrywkowe (jeśli woda zostanie odpipetowana do tego obszaru, rozpryskuje się). Wysuszyć płyty na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym. Płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4°C do 5 dni.
   Uwaga: Różne linie komórkowe mogą wymagać różnych powłok, takich jak fibronektyna lub kolagen I.

2. Posiewanie testu kropkowego (Dzień 2)

1. Przygotowanie zawiesiny komórek
   1. Do przygotowania zawiesiny komórkowej należy użyć komórek, które zostały wyhodowane w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 5% surowicą końską do 80% konfluencji
   2. Przepłukać komórki solą fizjologiczną (DPBS) Dulbecco bez wapnia i magnezu, dodać 500 μl trypsyny-EDTA (temperatura pokojowa) i inkubować komórki przez 3 - 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze.
   3. Zawiesić oderwane komórki w pożywce hodowlanej o pojemności 4,5 ml, aby zatrzymać aktywność trypsyny i odliczyć 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek w hemocytometrze.
   4. Pozostałe komórki umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 200 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do 3 x 10⁶ komórek/ml.
      UWAGA: W przypadku innych podłoży powlekających i/lub linii komórkowych należy ustalić optymalną gęstość komórek w serii rozcieńczeń. Jako punkt wyjścia zaleca się 3 x 10⁶ komórek/ml.
2. Ogniwa galwaniczne
   1. Umieść 10 μl kropli zawiesiny komórkowej na środku każdego szkiełka nakrywkowego 12-dołkowej szklanej płytki dolnej pokrytej kolagenem IV, nie dotykając ani nie rysując powłoki (Rysunek 1A, B). Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze, aby umożliwić połączenie komórek. Sprawdź w odwróconym mikroskopie, czy komórki są połączone.
      UWAGA: Najlepiej widać to na krawędzi kropli, gdzie można zaobserwować tworzenie się monowarstwy (Rysunek 1C). W razie potrzeby inkubować płytkę do 3 godzin. Upewnij się, że wilgotność w inkubatorze jest wystarczająco wysoka, ponieważ krople mogą szybko wyschnąć. Jeśli na tym etapie zaobserwuje się zmniejszenie objętości kropli, dodaj PBS do przestrzeni między studzienkami, aby zwiększyć wilgotność.
   2. Delikatnie umyj studzienki dwukrotnie 1 ml pożywki hodowlanej, aby usunąć nieprzyłączone komórki. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka. Sprawdź w odwróconym mikroskopie, czy nie pozostały żadne pływające komórki, w przeciwnym razie ponownie umyj studzienki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze, aby uzyskać dobrze zdefiniowane arkusze komórek.
      Uwaga: Pływające komórki prawdopodobnie ponownie przyczepią się do płytki i utworzą niepożądane kolonie komórek.

3. Stymulowanie komórek (Dzień 3)

1. Sprawdź wszystkie studzienki za pomocą mikroskopu odwrotnego, aby upewnić się, że kolonie komórek rosną prawidłowo. W razie potrzeby zaznacz nieodpowiednie studzienki i nie używaj ich.
2. Oznacz każdą studzienkę płytki odpowiednio dla każdego badanego stanu. Uruchom każdy warunek w dwóch lub trzech egzemplarzach.
3. Zmień pożywkę, aby zagłodzić komórki w DMEM/F12 zawierającym 0,1% surowicy końskiej (pożywka głodowa) na 3 godziny przed stymulacją komórek.
4. Stymulować komórki przez dodanie EGF (stężenie końcowe 5 ng/ml) lub innych pożądanych mediatorów i delikatnie wymieszać pożywkę za pomocą mikropipetora o pojemności 1 ml lub obracając płytkę.
5. Inkubować płytkę przez 1 - 4 dni, aby obserwować przemieszczenie krawędzi i kontur krawędzi, jak opisano w sekcji 4.1 lub wykonać obrazowanie poklatkowe zgodnie z opisem w sekcji 4.2.

4. Wizualizacja kolonii komórkowych i migracji komórek

1. Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) w celu pomiaru wzrostu kolonii (dzień 4 - 7)
   1. Utrwal komórki w 70% etanolu (1 ml / studzienkę) przez ~ 2 min.
   2. Zabarwić jądra hematoksyną (1 ml/studzienkę), ~2 min.
   3. Umyj komórki wodą z kranu (1 ml/studzienkę), aż jądra staną się niebieskie, 5 - 10 minut.
   4. Zabarwić cytoplazmę eozyną (1 ml / dołek), ~ 2 min.
   5. Spłucz wodą dejonizowaną (1 ml / studzienkę).
      Uwaga: Roztwory hematoksyliny i eozyny można zbierać i używać wielokrotnie, aż barwienie stanie się słabe.
   6. Płyta sucha na powietrzu.
   7. Odwróć talerz i zmierz średnicę kropki za pomocą linijki. Alternatywnie, zrób zdjęcia płytki za pomocą aparatu fotograficznego i przeanalizuj średnicę kropki w ImageJ.
2. Mikroskopia poklatkowa (dzień 3)
   1. Włączyć mikroskop inkubatora i ustawić temperaturę na 37 °C. Napełnić nawilżacz dH₂O. Dostosować CO₂ do 5%. Upewnij się, że komora inkubatora jest nawilżona i że zmotoryzowany stage może się swobodnie poruszać. Zamknąć komorę inkubatora i pozwolić, aby mikroskop ustawił się na 37 °C.
      UWAGA: Używany tutaj mikroskop (patrz Tabela materiałów) powinien być podgrzewany do 37 °C przez co najmniej 3 godziny przed obrazowaniem komórek, aby uniknąć dryfowania ostrości.
   2. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu inkubatora i ustaw listę etapów. Wyobraź sobie dwie przeciwległe krawędzie i środek każdej kropki komórki (Rysunek 1A).
   3. Rób zdjęcia co 3 minuty, przez 15 - 24 godziny przy użyciu obiektywu 10X. Pobierz dane i przystąp do analizy obrazu w wybranym programie, np. ImageJ lub Matlab.

Wyniki

Przedstawiony tutaj test kropelkowy (Rycina 1) został przeprowadzony z wykorzystaniem inwazyjnych komórek raka piersi tworzących kolonie w płucach (MCF10CA1a) jako systemu modelowego. Test kropelkowy pozwala na uzyskanie wysoce powtarzalnych kropel komórkowych nawet w przypadku osób początkujących, co czyni go wygodnym i łatwym do wykonania badaniem (Rycina 1D). Test kropelkowy w połączeniu z barwieniem HE lub ob...

Dyskusja

Podczas progresji nowotworu komórki migrują z tkanki pochodzenia, aby zaatakować otaczającą tkankę i dać przerzuty do odległych miejsc¹⁵. Migrację komórek z dala od kolonii komórkowej można zaobserwować w teście kropkowym. W tym miejscu test punktowy jest zilustrowany analizą fenotypu migracyjnego ludzkich komórek raka piersi w odpowiedzi na EGF.

Aby uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki, kluczowe znaczenie ma kilka etapów konfiguracji testów kropkowych. Po pierwsze, po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki MCF10CA1a	Karmanos Research Institute	N/A	komórki używane do oznaczania
kolagenu myszy IV	BD Biosciences	354233	używane do powlekania płytek
trypsyna / EDTA	Thermo Fisher	25300054	służy do usuwania komórek z płytek do hodowli tkankowych
DPBS	Mediatech	21-031-CV	stosowany do mycia komórek
DMEM / F12	Thermo Fisher	stosowany 11320082	jako pożywka hodowlana
surowica końska	Thermo Fisher	26050088	stosowany do uzupełnienia pożywki hodowlanej
12-dołkowa szklana płyta dolna	MatTek	P12G-1.5-14-F	służy do hodowli komórek do obrazowania
EGF (naskórkowy czynnik wzrostu, ludzki rekombinant)	Peprotech	AF-100-15	stosowany do stymulacji komórek
bez kwasów tłuszczowych BSA	Sigma	A8806-1G	używany do wytwarzania buforu dla
EGF hematoksyliny	Sigma	HHS32	używany do barwienia kolonii
eozyny	Mikroskopia elektronowa Sciences	26051-10	używany do barwienia kolonii
37 i #176; C, 5% CO2 inkubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver z komorą inkubatora i zmotoryzowanym stopniem Zeiss	model Axio Observer.Z1	używany do obrazowania poklatkowego	Kamera
sCMOS ORCA Flash LT	BioVision	C11440-42U-KIT	służy do obrazowania poklatkowego w połączeniu z Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	oprogramowanie do obrazowania poklatkowego
mikroskop odwrócony	Olympus	model IX70	służy do liczenia komórek i sprawdzania kolonii w plastikowym pudełku do hodowli tkankowych
	Lock& Zamek	N/A	używany jako wilgotna komora (można użyć dowolnego szczelnie zamykanego plastikowego pudełka, które pasuje do płyt)