Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56453

⸱

6 lutego 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Streszczenie

Progresja mejotyczna u mężczyzn to proces, który wymaga skoordynowanego działania wielu wysoce regulowanych zdarzeń komórkowych. Błędy występujące podczas mejozy mogą prowadzić do niepłodności, utraty ciąży lub wad genetycznych. Rozpoczynając się na początku okresu dojrzewania i kontynuując przez całe dorosłe życie, ciągłe półsynchroniczne fale spermatocytów ulegają spermatogenezie i ostatecznie tworzą haploidalne plemniki. Pierwsza fala mysich spermatocytów poddawanych inicjacji mejotycznej pojawia się w 10 dniu po porodzie (10 dpp) i jest uwalniana do światła kanalików nasiennych jako dojrzałe plemniki po 35 dpp. Dlatego korzystne jest wykorzystanie myszy w tym oknie rozwojowym w celu uzyskania wysoce wzbogaconych populacji będących przedmiotem zainteresowania. Analiza rzadkich stadiów komórkowych jest trudniejsza u starszych myszy ze względu na udział kolejnych fal spermatogennych, które zwiększają różnorodność populacji komórkowych w kanalikach. Opisana tutaj metoda jest łatwą do wdrożenia techniką oceny cytologicznej komórek znajdujących się w kanalikach nasiennych myszy, w tym spermatogonii, spermatocytów i spermatydów. Technika kanalikowego squasha utrzymuje integralność izolowanych męskich komórek rozrodczych i umożliwia badanie struktur komórkowych, które nie są łatwe do wizualizacji za pomocą innych technik. Aby zademonstrować możliwe zastosowania tej techniki zgniatania kanalików, monitorowano montaż wrzeciona w spermatocytach przechodzących przez przejście od profazy do metafazy I (przejście G2/MI). Ponadto oceniono duplikację centrosomów, mejotyczną inaktywację chromosomów płciowych (MSCI) i tworzenie bukietów chromosomów jako przykłady struktur cytologicznych, które można zaobserwować za pomocą tej metody kanalików. Technika ta może być wykorzystana do wskazania określonych defektów podczas spermatogenezy, które są spowodowane mutacją lub zaburzeniami egzogennymi, a tym samym przyczynia się do naszego molekularnego zrozumienia spermatogenezy.

Wprowadzenie

Mejoza to złożone zdarzenie komórkowe, w którym po pojedynczej rundzie replikacji DNA następują dwie kolejne rundy podziału komórki. Kilka zdarzeń specyficznych dla mejozy musi być skoordynowanych podczas początkowych etapów mejozy, aby zapewnić dokładną segregację chromosomów. Zdarzenia te obejmują zakończenie rekombinacji homologicznej, koorientację kinetochorów siostrzanych podczas pierwszego podziału mejotycznego oraz stopniową utratę kompleksów kohezyny w celu rozwiązania chiazmatów między homologami. Precyzyjna regulacja tych procesów jest niezbędna do utrzymania płodności i zapobiegania zdarzeniom nieprawidłowej segregacji chromosomów, które mogą prowadzić do genetycznych zaburzeń rozwojowych i spontanicznych poronień1.

Podczas gdy kluczowe zdarzenia mejozy mają miejsce zarówno u mężczyzn, jak i kobiet, istnieją znaczące czasowe i mechanistyczne różnice między spermatogenezą a oogenezą2. Na przykład podczas mejozy żeńskiej profaza I występuje podczas rozwoju embrionalnego i zatrzymuje się na etapie dyktowania aż do dojrzewania. Natomiast spermatogeneza rozpoczyna się w okresie dojrzewania i postępuje falami przez całe dorosłe życie bez zatrzymania. Różnice między mejozą męską i żeńską podkreślają potrzebę opracowania metod, które są specjalnie ukierunkowane na ocenę tych procesów zarówno w spermatocytach, jak i oocytach. Obecnie ocena progresji mejotycznej w dużej mierze opiera się na wykorzystaniu spreadów chromatyny3,4,5. Chociaż rozprzestrzenianie się chromatyny jest przydatne do badania chromosomów mejotycznych, nie udaje im się zachować integralności komórkowej, uniemożliwiając ocenę struktur komórkowych, takich jak mikrotubule wrzecionowate, centrosomy, otoczka jądrowa i przyłączenia telomerów. Obrazowanie na żywo i techniki długoterminowego hodowli znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat mejozy kobiet; Podobne podejścia do wizualizacji całej nienaruszonej komórki są jednak rzadziej stosowane w badaniu spermatogenezy6,7. Aby zobrazować dynamiczne zdarzenia podczas mejozy męskiej, dostosowaliśmy sprawdzone techniki zgniatania kanalików, aby szybko ocenić cechy cytologiczne rozwijających się spermatocytów myszy8,9. Opisana tutaj metoda utrzymuje integralność komórki, umożliwiając badanie wielu struktur komórkowych na różnych etapach spermatogenezy.

Ta technika zgniatania kanalików to podejście całościowe, które pozwala na ocenę struktur komórkowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Powszechne podejścia histologiczne do wizualizacji progresji mejotycznej u samców myszy, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną jąder zanurzonych w parafinie oraz immunofluorescencyjne znakowanie kriosekcji, pozwalają na szeroki przegląd progresji mejotycznej. Jednak techniki te nie są w stanie rozpoznać pojedynczych komórek w stopniu niezbędnym do szczegółowej analizy zdarzeń zachodzących podczas mejozy10,11. Alternatywne techniki wizualizacji procesów mejotycznych polegają na znacznym zaburzeniu chemiosmotycznym spermatocytów w celu wyizolowania i utrwalenia materiałów jądrowych3,4,5. Te zabiegi chemiczne utrudniają obserwację typów komórek innych niż pierwotne spermatocyty. Niedawno opisana metoda przez Namekawę umożliwiła społeczności badawczej zachowanie architektury jądrowej izolowanych spermatocytów, ale wymaga użycia cytospinu i akcesoriów, które mogą nie być łatwo dostępne dla niektórych laboratoriów4. W przeciwieństwie do tego, technika squasha kanalików wymaga jedynie sprzętu, który jest ogólnie standardem w większości laboratoriów biologii komórki.

Opisana tutaj metoda zgniatania kanalików może być użyta do wizualizacji różnych typów komórek znajdujących się w kanaliku nasiennym, w tym komórek Sertoliego, spermatogonii, pierwotnych i wtórnych spermatocytów oraz spermatyd. Łącząc tę technikę z niemal synchroniczną pierwszą falą spermatogenezy u młodych myszy, możliwe jest uzyskanie wzbogaconych populacji komórek spermatogennych w miarę ich postępu przez mejozę12. Proces ten pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w spermatogenezie, takich jak wczesne zdarzenia profazy, przejścia G2/MI i metafazy do anafazy oraz spermiogeneza. Ponadto preparaty do squasha kanalików mogą być wykorzystywane do wizualizacji cech cytologicznych chromosomów (np. domen międzychromatydowych (ICD) i kinetochorów) oraz centrosomów (centrioli i materiału/matryc pericentrioralnych). Metoda squasha może być z łatwością stosowana równolegle z innymi podejściami eksperymentalnymi, takimi jak rozprzestrzenianie chromatyny i ekstrakcja białek. Ponadto technika ta została z powodzeniem zmodyfikowana w celu osadzania żywych komórek plemnikotwórczych na szkiełkach w celu bezpośredniej wizualizacji13.

Opisana tutaj metoda obejmuje technikę zgniatania kanalików nasiennych całokomórkowych do analizy przejścia G2/MI u myszy C57BL/6J typu dzikiego. Cechy cytologiczne pierwotnych spermatocytów wchodzących do pierwszego podziału mejotycznego uwidoczniono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu obserwacji wrzeciona mejotycznego. Tę wszechstronną technikę można łatwo zmodyfikować, aby uwidocznić inne etapy mejotyczne i różne typy komórek. Technika ta jest również podatna na alternatywne strategie wizualizacji, takie jak podejścia DNA i RNA FISH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie myszy zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Eksperymenty przeprowadzono na młodocianych (20 - 26 dni po porodzie, dpp) myszach C57BL/6J, wykorzystując półsynchroniczną pierwszą falę spermatogenezy. Jednak tę technikę można również wykonać na dorosłych myszach.

1. Sekcja i izolacja kanalików nasiennych myszy

  1. Przygotować roztwór utrwalający/do lizy i bufor do rozcieńczania przeciwciał (ADB) opisane w Tabeli 1 i Tabeli 2.
  2. Przygotuj jedną 35-milimetrową szalkę Petriego z 3 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS, pH 7,4) i drugą 35-milimetrową szalkę z 2 ml roztworu do utrwalania/lizy na mysz.
  3. Poświęć mysz poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie CO2 i spryskaj brzuszną część brzucha 70% etanolem. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V. Następnie usuń jądra, ciągnąc za poduszeczkę tłuszczową najądrza za pomocą kleszczy i unikaj naruszania osłonki białawej. Umieścić jądra na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 1x PBS.
    nuta: Wykorzystaj pierwszą falę spermatogenezy, aby zaobserwować wzbogaconą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania14. Poszczególne etapy spermatogenezy są wzbogacone w różnym wieku myszy (Tabela 3).
  4. Usuń osłonkę białawą jąder, nakłuwając tkankę kleszczami z ostrymi końcówkami i zbierz luźne kanaliki nasienne. Przenieść kanaliki na nową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml roztworu do utrwalania/lizy.
  5. Inkubować kanaliki w roztworze do utrwalania/lizy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie kanalików nasiennych

  1. Przygotować szkiełko podstawowe pokryte poli-L-lizyną, obrysowując krawędzie szkiełka pisakiem blokującym płyny.
  2. Nanieść 100 μl roztworu utrwalającego/do lizy na środek szkiełka
    3. podstawowego.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek delikatnie rozsuń kanaliki nasienne. Wycinanie długich, pojedynczych segmentów kanalików o długości około 20 mm.
    nuta: Aby uwidocznić struktury, które są wrażliwe na długotrwałą ekspozycję utrwalającą, takie jak centrosomy, najpierw oddziel kanaliki w 1x PBS, a następnie bezpośrednio zmiel kanaliki na powierzchni szkiełek polilizynowych pokrytych 100 μl roztworu do utrwalania.
  4. Przenieść pięć segmentów kanalików nasiennych o długości 20 mm do przygotowanego szkiełka szklanego pokrytego poli-L-lizyną zawierającego roztwór utrwalający/lizyzowy.
  5. Za pomocą sterylnych nożyczek rozdrobnij kanaliki nasienne na segmenty o średnicy od 1,5 do 3,0 mm.
  6. Za pomocą sterylnych kleszczyków ułóż segmenty kanalików na szkiełku tak, aby żadna tkanka nie zachodziła na siebie, a kanaliki były równomiernie rozłożone.
    nuta: Optymalna liczba segmentów kanalików na szkiełku podstawowym wynosi od 20 do 40.

3. Zgniatanie kanalików nasiennych

  1. Przenieść szkiełko zawierające rozproszone segmenty kanalików nasiennych na blat stołu. Usuń nadmiar płynu za pomocą chusteczki laboratoryjnej, aby uniknąć utraty tkanki podczas etapu squasha.
  2. Nałóż szkiełko nakrywkowe (22 x 60 - 1,5 mm) na szkiełko podstawowe i dociskaj piętą dłoni przez 10 - 20 sekund. Ważne jest, aby przyłożyć wystarczającą siłę, aby rozproszyć spermatocyty z kanalików nasiennych.
    nuta: Obserwuj kanaliki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby zoptymalizować etap zgniatania, tak aby wszystkie segmenty kanalików zostały przerwane.
  3. Za pomocą kleszczyków do szkiełków natychmiast błyskawicznie zamroź szklane szkiełko w małym dewarze cieczy N2 na 15 sekund lub do momentu, gdy płyn przestanie bulgotać. W przypadku natychmiastowego znakowania immunologicznego usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki o prostej krawędzi, kleszczyków z cienką końcówką lub igły o rozmiarze 21.
    nuta: W celu uzyskania optymalnych wyników należy natychmiast oznaczyć immunologicznie preparaty (patrz krok 4). Jednak w tym momencie szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch tygodni. Aby zmaksymalizować żywotność białek i struktur komórkowych, należy natychmiast przechowywać szkiełka na suchym lodzie lub przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C, a szkiełko nakrywkowe trzymać na szkiełku. W przypadku znakowania immunologicznego przechowywanych szkiełek należy usunąć szkiełko nakrywkowe, zanurzając szkiełka w płynieN2 na 15 sekund, jak opisano w kroku 3.3.

4. Znakowanie immunologiczne zamontowanych kanalików nasiennych

  1. Zanurz szkiełko w 1x PBS i umyj trzy razy przez 5 minut w 50-mililitrowym słoiku Coplin zawierającym 1x PBS.
    nuta: Nigdy nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia szkiełek podczas znakowania immunologicznego.
  2. Nanieść 1 ml buforu do rozcieńczania przeciwciał na szkiełko podstawowe i blokować przez 1-2 godziny w wilgotnej komorze.
  3. Wyjąć bufor do rozcieńczania przeciwciał i nanieść 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze do rozcieńczania przeciwciał w wilgotnej komorze.
    nuta: W celu uzyskania najlepszych wyników należy inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować mniejsze objętości przeciwciał (np. 50 μl), przykrywając szkiełko szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem. Walidacja i optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych15.
  4. Płucz szkiełka trzy razy przez 5 minut w słoiku Coplin o pojemności 50 ml zawierającym 1x PBS.
    nuta: Aby usprawnić mycie, zamieszaj słoiki Coplin za pomocą małego magnetycznego pręta mieszającego i umieść na magnetycznej płycie mieszającej z niską prędkością lub umieść słoik Coplin na mikserze stołowym z niską prędkością.
  5. Stosować 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym przeciwciała przez 1 do 1,5 godziny w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Inkubować szkiełka w ciemnym pudełku, aby uniknąć fotowybielania przeciwciał sprzężonych z fluoroforem.
    nuta: Należy stosować mniejsze objętości przeciwciał (np. 50 μl), przykrywając szkiełko szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem.
  6. Płucz szkiełka dwa razy przez 5 minut w 50-mililitrowym słoiku Coplin zawierającym 1x PBS.
  7. Zamontuj szkiełka w podłożu montażowym zawierającym 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI, 1,5 μg/ml) i nałóż szkiełka nakrywkowe (22 x 60 - 1,5 mm).
  8. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe do szkiełek przezroczystym lakierem do paznokci, aby zachować szkiełka i zapobiec przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych.

5. Analiza i obrazowanie preparatów do squasha w kanalikach

  1. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego ze zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia precyzyjny ruch w osi Z, oraz kamery o wysokiej rozdzielczości do przechwytywania obrazu. Alternatywnie można użyć laserowego mikroskopu konfokalnego.
    nuta: Na tym etapie użyj dowolnego dostępnego sprzętu i oprogramowania. Na przykład obrazy wyświetlane w formatach Rysunek 1 i Rysunek 2 zostały zarejestrowane za pomocą skanera Zeiss Cell Observer Z1 połączonego z kamerą CMOS ORCA-Flash 4.0 i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów Zeiss ZEN 2012 blue edition.
  2. Oceń slajdy za pomocą obiektywu 20X, aby określić jakość przygotowania do squasha. Szkiełka dobrej jakości mają monowarstwę jąder, które są równomiernie rozłożone.
    nuta: Niektóre sekcje slajdu mogą być lepsze od innych, warto zanotować współrzędne, w których można znaleźć najlepsze obszary slajdu do dalszej analizy przy użyciu większego powiększenia.
  3. Używając obiektywu o większym powiększeniu (np. 63X lub 100X), uchwyć obszary szkiełka, które mają spójną monowarstwę jąder. Po wybraniu regionu ustaw górny i dolny stos Z, aby upewnić się, że całe ostre światło jest przechwytywane.
    nuta: Optymalna liczba stosów Z uchwyconych między górną a dolną granicą jest zazwyczaj określana przez oprogramowanie do akwizycji obrazu i jest różna dla każdego obiektywu.
  4. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby skompilować obraz o rozszerzonej głębi ostrości. Oprogramowanie łączy w sobie ostre światło z każdego stosu Z i jest niezbędne do optymalnego obrazowania preparatów do squasha w kanałach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu zastosowano metodę rozgniatania kanalików (tubule squash method) w celu wizualizacji przejściowych populacji komórek przechodzących z profazy do metafazy I (G2/MI), których zagęszczenie uzyskano poprzez pobranie jąder od młodzieńczych myszy typu dzikiego znajdujących się w pierwszej fali spermatogenezy (24. dzień po urodzeniu, dpp). Rycina 1 przedstawia reprezentatywne obrazy różnych stadiów komórek, które można zwizualizować za pomocą me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Myszy okazały się użytecznym organizmem modelowym do badania zdarzeń komórkowych, które rządzą progresją mejotyczną podczas spermatogenezy. Ponadto konieczne jest opracowanie narzędzi przeznaczonych do badania spermatogenezy, ponieważ wiele zdarzeń, takich jak wyjście z mejotycznej profazy I, jest dymorficznych płciowo. Protokół ten opisuje metodę squasha kanalików nasiennych do wizualizacji i badania różnych etapów spermatogenezy myszy. Metoda ta zachowuje integralność komórkową, a tym samym umożliwia szczegółowe analiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIGMS (R01GM11755) dla P.W.J. oraz przez stypendium szkoleniowe od National Cancer Institute (NIH) (CA009110) dla S.R.W. i J.H.
 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% Paraformaldehydowa wodnamikroskopia elektronowa Nauki (EMS)15710
10x PBSJakość Biologiczna119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
Surowica dla koniaSigmaH-1270
35mm x 10mm szalka Petriego, sterylna, niepoddana obróbceCellTreatP886-229638
Szkiełka szklane powlekane poli-L-lizynąSigmaP0425-72EA
Liquid Blocker PenMikroskopia elektronowa Sciences (EMS)71310
Wilgotne pudełkoEvergreen240-9020-Z10
Naczynie do barwienia ze szkła Wheaton Coplin na 5 lub 10 szkiełekFisher08-813E
VECTASHIELD Montaż zapobiegający blaknięciu Średni z szkiełkami podstawowymi mikroskopu DAPIVector LabsH-1200
(22mmx60mm)Fisher12-544-G
Bezbarwny lakier do paznokciAmazonN/A
Microsopes
NazwaFirmaNumer katalogowy Komentarze
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Obserwator Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 blue edition oprogramowanie do obrazowaniaZeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS KameraHamamatsu
Primary Przeciwciała
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz anty-SYCP3Santa Cruzsc-745691 na 50
Królik anty-SYCP3Fisher (Novus)NB300-2311 na 1000
Koza anty-SCP3Santa Cruzsc-208451 na 50
Ludzkie przeciwciałaanty-centromerowe15-2351 na 100
Mysia anty-alfa tubulinaSigmaT90261 na 1000
Mysz anty-AIM1BD Biosciences6110821 na 200
Mysz anty-γ H2AXThermo FisherMA1-20221 na 500
Mysz anty-CENT3AbnovaH00001070-M011 na 200
Królik anty-perycentrynaAbcamab44481 na 200
Królik anty-REC8Dzięki uprzejmości  Dr. Karen SchindlerN/A1 na 1000

Bibliografia

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  2. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  3. Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
  4. Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819(2014).
  5. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
  6. Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
  7. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
  8. Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
  9. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  10. Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
  11. Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
  12. Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
  13. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
  14. Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
  17. Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
  18. Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
  19. Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
  20. Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
  21. Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  22. Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
  23. Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
  24. Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676(2016).
  25. Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
  26. Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
  27. Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).
  28. Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
  29. Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
  30. Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
  31. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  32. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  33. Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
  34. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).
  35. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
  36. Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
  37. Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
  38. Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
  39. Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
  40. Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spermatogeneza myszyizolacja komórek linii zarodkowejprzygotowanie kanalikówroztwór lizujący utrwalającyszkiełko z poli-L-lizynąbarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia epifluorescencyjnaformowanie bukietu chromosomowego
Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.