Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Summary

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Abstract

Mutanty są nieocenionymi zasobami genetycznymi do badań nad funkcjami genów. Do generowania kolekcji mutantów można wykorzystać trzy rodzaje mutagenów, w tym biologiczne, takie jak T-DNA lub transpozon, chemiczne, takie jak metanosulfonian etylu (EMS), lub fizyczne, takie jak promieniowanie jonizacyjne. Rodzaj obserwowanej mutacji różni się w zależności od zastosowanego mutagenu. W przypadku mutantów wywołanych promieniowaniem jonizacyjnym mutacje obejmują delecję, duplikację lub rearanżację. Podczas gdy T-DNA lub mutageneza oparta na transpozonach jest ograniczona do gatunków, które są podatne na transformację, mutageneza chemiczna lub fizyczna może być stosowana do szerokiego zakresu gatunków. Jednak charakterystyka mutacji pochodzących z mutagenezy chemicznej lub fizycznej tradycyjnie opiera się na podejściu do klonowania opartym na mapach, które jest pracochłonne i czasochłonne. Tutaj pokazujemy, że platforma porównawczej hybrydyzacji genomowej (aCGH) oparta na macierzy genomu o dużej gęstości może być zastosowana do skutecznego wykrywania i charakteryzowania zmian liczby kopii (CNV) w mutantach pochodzących z mutagenezy bombardowania szybkimi neutronami (FNB) w Medicago truncatula, gatunku roślin strączkowych. Analiza sekwencji całego genomu pokazuje, że u M. truncatula znajduje się ponad 50 000 genów lub modeli genów. Obecnie mutanty indukowane przez FNB u M. truncatula pochodzą z ponad 150 000 linii M1, co stanowi nieocenione zasoby genetyczne do funkcjonalnych badań genów w genomie. Opisana tutaj platforma aCGH jest skutecznym narzędziem do charakteryzowania mutantów indukowanych przez FNB u M. truncatula.

Introduction

Rośliny strączkowe (Fabaceae) to trzecia co do wielkości rodzina roślin kwitnących, z wieloma ważnymi gospodarczo gatunkami, takimi jak soja (Glycine max) i lucerna (Medicago sativa). Rośliny strączkowe mogą wchodzić w interakcje z bakteriami glebowymi wiążącymi azot, ogólnie nazywanymi Rhizobia, w celu wytworzenia guzków korzeniowych, w których atmosferyczny diazot jest redukowany do amoniaku do wykorzystania przez roślinę żywicielską. W związku z tym uprawa roślin strączkowych wymaga niewielkiego nakładu nawozów azotowych, a tym samym przyczynia się do zrównoważonego rolnictwa. Rośliny strączkowe wytwarzają liście i nasiona o wyso....

Protocol

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje pięć kroków dla protokołu tablicowego CGH. Są to: 1) Przygotowanie materiałów roślinnych; 2) Izolacja wysokiej jakości próbek DNA; 3) Znakowanie i oczyszczanie próbek DNA; 4) Hybrydyzacja, mycie i skanowanie całych macierzy genomowych; oraz 5) analiza danych CGH. Macierze kafelkowe całego genomu M. truncatula zawierają łącznie 971 041 unikalnych sond oligonugologicznych ukierunkowanych na ponad 50 000 genów lub modeli genów w genomie (patrz tabela materiałów). Unikalne sondy są rozmieszczone w przybliżeniu co 150 par zasad (bp) w regionach egzonicznych i 261 pz w regionach intronowych ge....

Results

Rysunek 2 pokazuje rozkład znormalizowanych stosunków logarytmu₂ sygnałów mutanta i WT w całym genomie. Analiza danych CGH ujawniła około 22 kb delecji na chromosomie 4, która obejmuje cały gen SUNN ³³ i kilka innych oznaczonych adnotacjami genów w mutancie FN6191 (Rysunek 2, Rycina 3). Kandydujący usunięty region został pokryty 73 kolejnymi sondami na tablicy ze średnimi zno.......

Discussion

Opracowaliśmy opartą na macierzy platformę CGH do wykrywania i charakteryzowania mutantów indukowanych szybkim bombardowaniem neutronami (FNB) u M. truncatula cv. Jemalong A17. Aby zademonstrować zastosowanie metody macierzy CGH w wykrywaniu mutacji genów, przeprowadziliśmy analizę aCGH zmutowanego FN6191, który wykazywał fenotyp hiperguzkowy w przeciwieństwie do roślin typu dzikiego, po inokulacji S. meliloti Sm1021. Na potrzeby analizy segmentacyjnej segment został uznany za istotny, jeśli średnia ze .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula macierz genomowa, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)	We własnym zakresie	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (odniesienie)	W domu	A17
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant Mini zestaw	Qiagen	69104
Spektrofotometr Nanodrop	Thermo Scientific	1000D
Zestaw do znakowania DNA SureTag	Agilent	5190-3400
Losowy starter	Agilent	5190-3399
Acetonitryl	Sigma-Aldrich	271004-1L
Termocykler	MJ research	PTC-200
Wirówka	Labnet international Inc	Spectrafuge 24D
Roztwór do stabilizacji i suszenia	Agilent	5185-5979
Zestaw do hybrydyzacji Oligo aCGH/ChIP-on-chip	Agilent	5188-5380
Prowadnice uszczelkowe komory hybrydyzacji	Agilent	G2505
Ludzkie łóżeczko 1 DNA	Agilent	5190-3393
Bufor myjący Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 i 2	Agilent	5188-5221
Komora hybrydyzacyjna, nierdzewna	Agilent	G2534A
Kolumny			Agilent
		5190-3391
Skaner laserowy	Roche	MS200
NimbleScan 2.6	Roche Mapa sygnału Nimblegen	5225035001
1.9	Roche Nimblegen	Mapa sygnałów1.9