Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Streszczenie

Egzosomy to nano-rozmiarowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez płyny ustrojowe i znane są z tego, że reprezentują cechy komórek, które je wydzielają. Zawartość i morfologia wydzielanych pęcherzyków odzwierciedla zachowanie komórek lub stan fizjologiczny, na przykład wzrost komórek, migrację, rozszczepienie i śmierć. Rola egzosomów może w dużym stopniu zależeć od wielkości, a wielkość egzosomów waha się od 30 do 300 nm. Najczęściej stosowaną metodą obrazowania egzosomów jest barwienie ujemne, podczas gdy inne wyniki opierają się na kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej, skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopii sił atomowych. Typowa morfologia egzosomu oceniana za pomocą barwienia ujemnego ma kształt miseczki, ale dalsze szczegóły nie są jeszcze jasne. Egzosom dobrze scharakteryzowany przez badania strukturalne jest niezbędny, szczególnie w dziedzinach medycznych i farmaceutycznych. Dlatego morfologia zależna od funkcji powinna być weryfikowana za pomocą technik mikroskopii elektronowej, takich jak znakowanie określonego białka w szczegółowej strukturze egzosomu. Aby zaobserwować szczegółową strukturę, porównano ultracienkie przekroje i negatywy barwione obrazy egzosomów. W tym protokole sugerujemy transmisyjną mikroskopię elektronową do obrazowania egzosomów, w tym barwienie ujemne, barwienie immunologiczne całej góry, przygotowanie bloku, cienki przekrój i znakowanie immuno-złotem.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe wydzielane przez komórki, a ich rozmiar waha się od 30 do 300 nm. EV zostały po raz pierwszy zgłoszone w 1978 roku, z dowodami z pęcherzyków pacjentów z chorobą Hodgkina¹. Doniesiono, że pęcherzyki te mają wielkość od 40 do 120 nanometrów. W 1980 roku doniesiono, że EV są zaangażowane w układ krzepnięcia i zakrzepicę, tworzenie skrzepu krwi w naczyniu krwionośnym u pacjentów z rakiem². Po 30 latach stwierdzono, że EV są ważnym czynnikiem sprzyjającym inwazji guza, ucieczce immunologicznej i angiogenezie³. Ponadto badano funkcje EV jako regulatorów interakcji komórkowych w obszarach zapalenia, zaburzeń immunologicznych, chorób neurologicznych i raka⁴. Ponieważ EV zawierają specyficzne biomolekuły, takie jak białka, mRNA i mikroRNA⁵, przeanalizowano ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce i terapii^6,7. EV to kategoria składająca się z podgrup, w tym egzosomów, prostasomów, onkosomów, deksosomów, mikrocząstek, promininosomów, argosomów i pęcherzyków podobnych do egzosomów, w zależności od ich pochodzenia komórkowego i funkcji biologicznej³. Ponadto, na podstawie ich biogenezy, te EV można podzielić na mikropęcherzyki (zrzucane mikropęcherzyki, 100 - 1000 nm) i egzosomy (30 - 300 nm)^8,9. Wśród nich egzosom został opisany jako komunikator komórkowy dla odpowiedzi immunologicznej¹⁰, cancer^11,12, oraz infectious disease¹³.

Zainteresowanie egzosomami jako biomarkerem do wczesnej diagnozy gwałtownie rośnie, a oczyszczaniu i charakterystyce egzosomów muszą towarzyszyć techniki obrazowania molekularnego. Różne rozmiary i morfologie egzosomów, w zależności od ich pochodzenia i funkcji¹⁴, można rozróżnić za pomocą technik mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia elektronowa. Większość egzosomów została zwizualizowana za pomocą negatywnie wybarwionej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)^15,16,17, a wyniki te zostały potwierdzone przez immunoznakowanie specyficznego białka w całym pęcherzyku mount¹⁸. Kilka grup badawczych opisało strukturę za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, mikroskopii sił atomowych^19,20 i Cryo-TEM^21,22. Jednak, chociaż techniki te są przydatne do badania struktury egzosomu, są niewystarczające do obserwacji położenia określonych białek znajdujących się wewnątrz egzosomu. W związku z tym wprowadziliśmy protokół obrazowania egzosomów z etykietowaniem określonego białka. Zastosowaliśmy przygotowanie bloków, ultracienkie sekcje i barwienie immunologiczne w celu ustalenia szczegółowej lokalizacji białka w egzosomie. Porównano to z barwieniem ujemnym i barwieniem immunologicznym całej góry, które jest tradycyjnie stosowane do charakterystyki egzosomu.

Protokół

1. Przygotowanie bloku, cięcie, barwienie i obrazowanie egzosomu

1. Osadzaj egzosomy z supernatantu hodowli komórek HCT116 przez wirowanie przy 100 000 x g przez 1,5 h²³. Usunąć supernatant hodowli i ostrożnie utrwalić oczyszczony osad egzosomu 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu (pH 7,0) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W przypadku 0,1 M kakodylanu sodu rozpuścić 4,28 g kwasu kakodylowego w 160 ml wody destylowanej (DW). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl, a następnie uzupełnij do 200 ml wodą destylowaną.
2. Usunąć utrwalacz i przepłukać granulki 1 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy, przy czym każda zmiana trwa 10 minut.
3. Po utrwaleniu próbek 1 ml 2% tetratlenku osmu należy utrwalić przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć utrwalacz i płukać trzykrotnie 0,1 M buforem kakodylanu sodu co 10 minut.
5. Inkubować przez 10 minut z sortowaną serią acetonu (odpowiednio 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) na wytrząsarce.
6. Usunąć aceton i inkubować roztwór mieszaniny acetonu o niskiej lepkości w stosunku 3:1 przez 30 minut. Osad egzosomu znajduje się w probówce.
7. Usuń pożywkę i dodaj aceton: pożywkę do osadzania acetonu o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez 30 minut.
8. Usuń pożywkę i dodaj pożywkę acetonu 1:3: mieszaninę do zatapiania o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez 30 minut.
9. Usuń pożywkę i dodaj 100% mieszaninę do zatapiania o niskiej lepkości i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
10. Zanurzyć próbkę w czystej mieszaninie do zatapiania o niskiej lepkości za pomocą formy do zatapiania i piec przez 24 godziny w temperaturze 65 °C.
11. Przygotować skrawki o grubości 60 nm przez ultramikrotom.
12. Podwójne barwienie 2% octanem uranylu przez 20 min i cytrynianem ołowiu przez 10 min.
    W przypadku roztworu ołowiu Reynoldsa dodać 1,33 g azotanu ołowiu i 1,76 g cytrynianu sodu do łącznie 50 ml wody destylowanej.
13. Obserwować siatkę pod transmisyjną mikroskopią elektronową przy napięciu 80 kV.
14. Kliknij "Pobierz", a następnie kliknij "Plik" i "Zapisz jako" w systemie kamer CCD pod mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV. Postępuj zgodnie z automatycznymi ustawieniami czasu ekspozycji.

2. Barwienie immunologiczne przekrojów i obrazowanie (Rysunek 1)

1. Wytnij ultracienkie odcinki 60 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz na siatce niklowej.
2. Inkubować siatki w 50 μl kropli 0,02 M glicyny przez 10 minut, aby stłumić wolne grupy aldehydowe.
3. Płukać w 100 μl DW trzy razy przez 10 minut. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w PBS zawierającym 1% BSA.
4. Inkubować siatki w 50 - 100 μL kropli przeciwciała anty KRS²⁴ (1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 godzinę (W razie potrzeby ten etap należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc.)
5. Myć kratki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającego 0,1% BSA przez 10 minut każda.
6. Przenieś siatki do kropli 2^nd przeciwciała przez 1 godzinę (anty-królicze IgG sprzężone z cząstką złota 10 nm (1:100) w PBS zawierającym 0,1% BSA).
7. Umyć kratki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającego 0,1% BSA co 10 minut.
8. Podwójne barwienie 2% octanem uranylu przez 20 minut w ciemności i cytrynianem ołowiu Reynoldsa odpowiednio przez 10 minut.
9. Kliknij "Pobierz", a następnie kliknij "Plik" i "Zapisz jako" w systemie kamer CCD pod TEM przy 80 kV. Czas naświetlania był zgodny z ustawieniami automatycznymi.

Rysunek 1: Proces przygotowania próbki i barwienia immunologicznego. (A) Podwójnie utrwalony egzosom jest odwadniany i infiltrowany żywicą osadzającą o niskiej lepkości. (B) Osadzanie żywicy. (C) Ultra-cienka sekcja z nożem diamentowym. (D) Konfiguracja do znakowania Immuno-gold. Siatki z ultracienkimi sekcjami są nakładane na kropelki płynu na parafolię, którą umieszcza się za pomocą mokrego ręcznika papierowego. Każda sekcja jest inkubowana z kropelkami 50 - 100 μl przeciwciała, a następnie przemywana buforem. (E) Podwójne barwienie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Pokrywka pokryta jest folią aluminiową do barwienia metali ciężkich. (F) Roztwór barwiący usuwa się za pomocą bibuły filtracyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Barwienie negatywne

1. Wyładowanie jarzeniowe cienkie siatki miedziane EM o siatce 200 mesh pokryte folią węglową przez 1 minutę za pomocą rozładowania żarowego.
2. Utrwal oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
   Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać w wentylowanym dygestorium.
3. Załadować 5 - 7 μl roztworu zawiesiny egzosomów na siatkę i inkubować przez 1 minutę. Jeśli stężenie egzosomu jest zbyt wysokie, rozcieńczyć stężenie do 1/2 - 1/5.
4. Natychmiast zabarwić ~20 kroplami przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu (UA) na powierzchni siatki EM za pomocą strzykawki.
5. Usunąć nadmiar roztworu UA z siatki, stykając krawędź siatki z bibułą filtracyjną.
6. Szybko spłucz siatkę kroplą wody. Ten krok usunie nadmiar roztworu barwiącego.
7. Umieść siatkę na stole, przytrzymując pęsetą i częściowo przykryj siatkę naczyniem hodowlanym do wyschnięcia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Przechowuj siatkę w skrzynce siatkowej EM do przyszłej obserwacji przez TEM przy napięciu 80 kV.

4. Cały wierzchowiec do barwienia immunologicznego

1. Rozładowanie jarzeniowe cienkich siatek miedzianych EM o siatce 200 mesh pokrytych folią węglową przez 30 s.
2. Utrwal oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
   Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać w wentylowanym dygestorium.
3. Załadować 5 - 7 μl utrwalonego roztworu egzosomu na siatkę i inkubować przez 5 min. Płukać 100 μl PBS trzy razy przez 10 min.
4. Traktuj siatki 50 μl 0,05 M glicyny przez 10 minut, aby stłumić wolne grupy aldehydowe.
5. Przenieś siatki do kropli bufora blokującego (PBS zawierający 1% BSA) na 30 min.
6. Inkubować siatki z 50 - 100 μl przeciwciała anty PD-L1 (1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 godzinę (w razie potrzeby etap ten należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc).
7. Płukać siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda.
8. Przenieś siatkę do kropli 2^nd przeciwciało przez 1 h. Anty-mysie IgG sprzężone z cząstką złota 9 - 11 nm rozcieńczoną w stosunku 1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA.
9. Płukać siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 μl) PBS zawierającymi 0,1% BSA przez 10 minut każda. Umyj kratkę dwoma oddzielnymi kroplami (50 μl) DW. Wykonaj barwienie ujemne 2% octanem uranylu zgodnie z opisem od 3,4 do 3,8.
10. Przechowuj siatkę w skrzynce siatkowej EM do przyszłej obserwacji przez TEM przy napięciu 80 kV.

Wyniki

Obecnie egzosomy są klasyfikowane według kategorii wielkości i kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Rysunek 2 pokazuje negatywnie zabarwiony egzosom i egzosom znakowany immunologicznie w stanie pełnego wierzchowania. Rysunek 3 pokazuje sekcjonowane egzosomy i egzosomy znakowane immunologicznie po cienkim przekroju. Barwienie immuno-złotem przy użyciu przeciwciał określonych białek służy do pozytywnej identyfikacji egz...

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół szczegółowej obserwacji struktury egzosomu i znakowania jego specyficznych białek. Barwienie ujemne zostało uznane za najlepszą metodę obrazowania egzosomów¹⁷. Ta konwencjonalna technika pokazała strukturę egzosomów w kształcie miseczki. Jednak ten kształt miseczki jest formą artefaktu, który może wystąpić w wyniku procesu suszenia. Wyniki Cryo-TEM wykazały, że egzosomy mają idealnie kulistą strukturę w roztworze wodnym^25,26

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aldehyd glutarowy	EMS	16200
Kakodylan sodu	EMS	12300
Tetroksynek osmu 1 g kryształ	EMS	19100	Stosować tylko w acetonie pod wyciągiem
	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-mikrotom	Leica	UCT
Octan uranylu	EMS	22400	Niebezpieczna substancja chemiczna
Cytrynian ołowiu	EMS	17900
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Hitachi	H7600
siatka niklowa	EMS	G200-Ni
Siatka miedziana	EMS	G200-Cu
glicyna	SIGMA	022K5404
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna	SIGMA	P4417
Albumina surowicy bydlęcej	Aurion	25557
1.			w trybie ręcznym
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD274 (B7-H1, PD-L1)	BioLegend	329710	Cała góra Immumogold
Oczyszczona mysz IgG2b, κ Isotype Ctrl	BioLegend	401202	Całe mocowanie Immumogold (Kontrola)
2nd Anty-mysia igG sprzężona 9-11 nm cząstka złota	sigma	G7652
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	JEOL	JEM2200FS
Wyładowanie jarzeniowe	JEOL	JFC1100E
Siatka węglowa	EMS	121119
Paraformaldehyd	EMS	19210
Siatka miedziana powlekana węglem Formvar (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Powlekana węglem Formvar  Siatka niklowa (200 oczek)	EMS	FCF200-NI