Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

40.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56482

⸱

4 stycznia 2018

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Streszczenie

Egzosomy to nano-rozmiarowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez płyny ustrojowe i znane są z tego, że reprezentują cechy komórek, które je wydzielają. Zawartość i morfologia wydzielanych pęcherzyków odzwierciedla zachowanie komórek lub stan fizjologiczny, na przykład wzrost komórek, migrację, rozszczepienie i śmierć. Rola egzosomów może w dużym stopniu zależeć od wielkości, a wielkość egzosomów waha się od 30 do 300 nm. Najczęściej stosowaną metodą obrazowania egzosomów jest barwienie ujemne, podczas gdy inne wyniki opierają się na kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej, skaningowej mikroskopii elektronowej i mikroskopii sił atomowych. Typowa morfologia egzosomu oceniana za pomocą barwienia ujemnego ma kształt miseczki, ale dalsze szczegóły nie są jeszcze jasne. Egzosom dobrze scharakteryzowany przez badania strukturalne jest niezbędny, szczególnie w dziedzinach medycznych i farmaceutycznych. Dlatego morfologia zależna od funkcji powinna być weryfikowana za pomocą technik mikroskopii elektronowej, takich jak znakowanie określonego białka w szczegółowej strukturze egzosomu. Aby zaobserwować szczegółową strukturę, porównano ultracienkie przekroje i negatywy barwione obrazy egzosomów. W tym protokole sugerujemy transmisyjną mikroskopię elektronową do obrazowania egzosomów, w tym barwienie ujemne, barwienie immunologiczne całej góry, przygotowanie bloku, cienki przekrój i znakowanie immuno-złotem.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe wydzielane przez komórki, a ich rozmiar waha się od 30 do 300 nm. EV zostały po raz pierwszy zgłoszone w 1978 roku, z dowodami z pęcherzyków pacjentów z chorobą Hodgkina1. Doniesiono, że pęcherzyki te mają wielkość od 40 do 120 nanometrów. W 1980 roku doniesiono, że EV są zaangażowane w układ krzepnięcia i zakrzepicę, tworzenie skrzepu krwi w naczyniu krwionośnym u pacjentów z rakiem2. Po 30 latach stwierdzono, że EV są ważnym czynnikiem sprzyjającym inwazji guza, ucieczce immunologicznej i angiogenezie3. Ponadto badano funkcje EV jako regulatorów interakcji komórkowych w obszarach zapalenia, zaburzeń immunologicznych, chorób neurologicznych i raka4. Ponieważ EV zawierają specyficzne biomolekuły, takie jak białka, mRNA i mikroRNA5, przeanalizowano ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce i terapii6,7. EV to kategoria składająca się z podgrup, w tym egzosomów, prostasomów, onkosomów, deksosomów, mikrocząstek, promininosomów, argosomów i pęcherzyków podobnych do egzosomów, w zależności od ich pochodzenia komórkowego i funkcji biologicznej3. Ponadto, na podstawie ich biogenezy, te EV można podzielić na mikropęcherzyki (zrzucane mikropęcherzyki, 100 - 1000 nm) i egzosomy (30 - 300 nm)8,9. Wśród nich egzosom został opisany jako komunikator komórkowy dla odpowiedzi immunologicznej10, cancer11,12, oraz infectious disease13.

Zainteresowanie egzosomami jako biomarkerem do wczesnej diagnozy gwałtownie rośnie, a oczyszczaniu i charakterystyce egzosomów muszą towarzyszyć techniki obrazowania molekularnego. Różne rozmiary i morfologie egzosomów, w zależności od ich pochodzenia i funkcji14, można rozróżnić za pomocą technik mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia elektronowa. Większość egzosomów została zwizualizowana za pomocą negatywnie wybarwionej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)15,16,17, a wyniki te zostały potwierdzone przez immunoznakowanie specyficznego białka w całym pęcherzyku mount18. Kilka grup badawczych opisało strukturę za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, mikroskopii sił atomowych19,20 i Cryo-TEM21,22. Jednak, chociaż techniki te są przydatne do badania struktury egzosomu, są niewystarczające do obserwacji położenia określonych białek znajdujących się wewnątrz egzosomu. W związku z tym wprowadziliśmy protokół obrazowania egzosomów z etykietowaniem określonego białka. Zastosowaliśmy przygotowanie bloków, ultracienkie sekcje i barwienie immunologiczne w celu ustalenia szczegółowej lokalizacji białka w egzosomie. Porównano to z barwieniem ujemnym i barwieniem immunologicznym całej góry, które jest tradycyjnie stosowane do charakterystyki egzosomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie bloku, sekcjonowanie, barwienie i obrazowanie egzosomów

  1. Osad z egzosomów z supernatantu hodowli komórek HCT116 należy uzyskać poprzez wirowanie przy 100,000 x g przez 1,5 h23. Usunąć supernatant hodowli i ostrożnie utrwalić oczyszczony osad egzosomów w 1 mL 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M roztworze kodylanu sodu (pH 7,0) przez 1 h w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 0,1 M kodylan sodu, rozpuścić 4,28 g kwasu kodylanowego w 160 mL wody destylowanej (DW). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 0,1 M HCl, a następnie dopełnić wodą destylowaną do objętości 200 mL.
  2. Usunąć utrwalacz i przemyć osady 1 mL 0,1 M buforu kodylanu sodu w temperaturze pokojowej. Powtórzyć czynność trzykrotnie, przy czym każda wymiana buforu powinna trwać 10 min.
  3. Przystąpić do utrwalania wtórnego próbek w 1 mL 2% czetrotlenku osmu przez 1 h w temperaturze 4 °C.
  4. Usunąć utrwalacz i przemyć trzykrotnie 0,1 M buforem kodylanu sodu w odstępach 10 min.
  5. Inkubować przez 10 min w gradacji acetonu (odpowiednio 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) na wytrząsarce.
  6. Usunąć aceton i inkubować w roztworze mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 3:1 przez 30 min. Osad egzosomów znajduje się w probówce.
  7. Usunąć medium i dodać medium składające się z mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 1:1, a następnie inkubować przez 30 min.
  8. Usunąć medium i dodać medium składające się z mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości z acetonem w stosunku 1:3, a następnie inkubować przez 30 min.
  9. Usunąć medium i dodać 100% mieszaniny zatapiającej o niskiej lepkości, a następnie inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
  10. Zatopić próbkę w czystej mieszaninie zatapiającej o niskiej lepkości przy użyciu formy do zatapiania i polimeryzować przez 24 h w temperaturze 65 °C.
  11. Przygotować skrawki o grubości 60 nm za pomocą ultramikrotomu.
  12. Przeprowadzić podwójne barwienie 2% octanem uranylu przez 20 min oraz cytrynianem ołowia przez 10 min.
    Aby przygotować roztwór ołowia według metody Reynoldsa, dodać 1,33 g azotanu ołowiu i 1,76 g cytrynianu sodu do łącznie 50 mL wody destylowanej.
  13. Obserwować siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy 80 kV.
  14. Kliknąć „Acquire”, a następnie wybrać „File” i „Save as” w systemie kamery CCD pod mikroskopem elektronowym przy 80 kV. Zastosować automatyczne ustawienia czasu ekspozycji.

2. Immunobarwienie przekrojów i obrazowanie (Rysunek 1)

  1. Wyciąć ultrascienkie sekcje o grubości 60 nm za pomocą ultramikrotomu i zebrać je na siatce niklowej.
  2. Inkubować siatki w 50 µL kilka kropli 0,02 M glicyny przez 10 min w celu zablokowania wolnych grup aldehydowych.
  3. Płukać w 100 μL trzykrotnie w wodzie destylowanej (DW), za każdym razem przez 10 min. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h w buforze PBS zawierającym 1% BSA.
  4. Inkubować siatki w 50 - 100 µL krople przeciwciała anty-KRS24 (1:100 w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 h (W razie potrzeby krok ten należy przeprowadzić w 4 °C na noc.)
  5. Przemyj siatki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA przez 10 min każdy.
  6. Przenieś siatki do kropel 2nd przeciwciała przez 1 h (przeciwciała przeciwko IgG królika sprzężone z cząsteczkami złota 10 nm (1:100) w PBS zawierającym 0,1% BSA).
  7. Przemyj siatki pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w buforze PBS zawierającym 0,1% BSA co 10 min.
  8. Przeprowadź podwójne barwienie: najpierw 2% octanem uranylu przez 20 min w ciemności, a następnie cytrynianem ołowiu według metody Reynolda przez 10 min.
  9. Kliknij „Acquire”, a następnie „File” i „Save as” w systemie kamery CCD pod TEM przy 80 kV. Czas ekspozycji ustalono zgodnie z ustawieniami automatycznymi.

Sekwencyjny proces wykrywania wirusów za pomocą testu immunochemicznego: próbki, chip, analiza, wyświetlanie wyników.
Rycina 1: Proces przygotowania próbek i immunostainingu. (A) Podwójnie utrwalony egzosom zostaje odwodniony i infiltrowany niskolepką żywicą do zatapiania. (B) Zatapianie w żywicy. (C) Wycinanie ultraz cienkich sekcji nożem diamentowym. (D) Układ do znakowania złotem koloidalnym. Siatki z ultracienkimi sekcjami są umieszczane na kropelkach cieczy na parafilmie, który spoczywa na mokrym ręczniku papierowym. Każdą sekcję inkubuje się z kropelkami 50 - 100 µL przeciwciał, a następnie przemywa buforem. (E) Podwójne barwienie octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Pokrywkę przykrywa się folią aluminiową w celu barwienia metalami ciężkimi. (F) Roztwór barwiący jest usuwany za pomocą papieru filtrowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Barwienie negatywne

  1. Poddać działaniu wyładowań koronowych miedziane siatki EM o oczkach 200, pokryte cienką warstwą formvaru/węgla, przez 1 min przy użyciu urządzenia do glow discharge.
  2. Utrwalić oczyszczone egzosomy w 1 mL 2% paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
    Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy prowadzić w wentylowanej dygestorium.
  3. Nanieść 5 - 7 µL zawiesiny egzosomów na siatkę i inkubować przez 1 min. Jeśli stężenie egzosomów jest zbyt wysokie, rozcieńczyć je do 1/2 - 1/5.
  4. Niezwłocznie zabarwić, nanieksując za pomocą strzykawki około 20 kropli przefiltrowanego 1% roztworu octanu uranylu (UA) na powierzchnię siatki EM.
  5. Usunąć nadmiar roztworu UA z siatki, dotykając jej krawędzi papierem filtracyjnym.
  6. Szybko wypłukać siatkę kroplą wody. Krok ten usunie nadmiar roztworu barwiącego.
  7. Położyć siatkę na stole, trzymając ją pęsetą, i częściowo przykryć siatkę szalką Petriego, aby wyschła przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  8. Przechowywać siatkę w pudełku na siatki EM do późniejszej obserwacji za pomocą TEM przy 80 kV.

4. Całe preparaty do immunobarwienia

  1. Poddaj działaniu wyładowań Glow-discharge miedziane siatki EM o oczku 200, pokryte cienką warstwą formvaru/węgla, przez 30 s.
  2. Utrwalone oczyszczone egzosomy za pomocą 1 ml 2% Paraformaldehydu (PFA) przez 5 min.
    Uwaga: Opary paraformaldehydu są toksyczne. Wszystkie prace należy prowadzić w wentylowanej komorze dyfuzyjnej.
  3. Załaduj 5 - 7 µL naniesionego na siatkę roztworu egzosomów i inkubować przez 5 min. Płukać za pomocą 100 µL buforem PBS trzykrotnie po 10 min każdorazowo.
  4. poddać siatki działaniu 50 µL 0,05 M glicyny przez 10 min w celu zablokowania wolnych grup aldehydowych.
  5. Przenieść siatki do kropli buforu blokującego (PBS zawierający 1% BSA) na 30 min.
  6. Inkubować siatki w 50 - 100 µL przeciwciało anty-PD-L1 (1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA) przez 1 h (jeśli to konieczne, ten etap należy przeprowadzić w 4 °C (przez noc).
  7. Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) w PBS zawierającym 0,1% BSA po 10 min każdorazowo.
  8. Przenieś siatkę do kropli 2nd przeciwciała przez 1 h. Przeciwciała anty-mysie IgG sprzężone z cząsteczkami złota o rozmiarze 9–11 nm, rozcieńczone 1:100 w PBS zawierającym 0,1% BSA.
  9. Przemyć siatkę pięcioma oddzielnymi kroplami (50 µL) buforu PBS zawierającego 0,1% BSA przez 10 min każdy. Przemyć siatkę dwiema oddzielnymi kroplami (50 µL) wody destylowanej (DW). Przeprowadzić barwienie negatywne 2% octanem uranylu zgodnie z opisem w punktach od 3.4 do 3.8.
  10. Siatkę należy przechowywać w pudełku na siatki EM do późniejszej obserwacji za pomocą TEM przy napięciu 80 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obecnie egzosomy są klasyfikowane pod względem rozmiaru i kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Rysunek 2 przedstawia egzosom barwiony negatywnie oraz egzosom znakowany immunochemicznie w preparacie całego obiektu. Rysunek 3 przedstawia egzosom w przekroju oraz egzosomy znakowane immunochemicznie po wykonaniu cienkich skrawków. Barwienie złotem koloidalnym z użyciem przeciwciał przeciwko specyficznym białkom ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokół szczegółowej obserwacji struktury egzosomu i znakowania jego specyficznych białek. Barwienie ujemne zostało uznane za najlepszą metodę obrazowania egzosomów17. Ta konwencjonalna technika pokazała strukturę egzosomów w kształcie miseczki. Jednak ten kształt miseczki jest formą artefaktu, który może wystąpić w wyniku procesu suszenia. Wyniki Cryo-TEM wykazały, że egzosomy mają idealnie kulistą strukturę w roztworze wodnym25,26

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) i finansowane przez rząd koreański (MSIP&MOHW) (nr 2016M3A9B6904244). Dziękujemy również członkom Centrum Badań Biokonwergencji Medycznej za oczyszczenie egzosomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aldehyd glutarowyEMS16200
Kakodylan sodu EMS12300
Tetroksynek osmu 1 g kryształEMS19100Stosować tylko w acetonie pod wyciągiem
JUNSEI1B2031
Spurr mediumTED PELLA18108
Ultra-mikrotomLeicaUCT
Octan uranyluEMS22400Niebezpieczna substancja chemiczna
Cytrynian ołowiuEMS17900
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachiH7600
siatka niklowaEMSG200-Ni
Siatka miedzianaEMSG200-Cu
glicynaSIGMA022K5404
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaSIGMAP4417
Albumina surowicy bydlęcejAurion25557
1.w trybie ręcznym 
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD274 (B7-H1, PD-L1)BioLegend329710Cała góra Immumogold
Oczyszczona mysz IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Całe mocowanie Immumogold (Kontrola)
2nd Anty-mysia igG sprzężona 9-11 nm cząstka złotasigmaG7652
Transmisyjna mikroskopia elektronowaJEOLJEM2200FS
Wyładowanie jarzenioweJEOLJFC1100E
Siatka węglowaEMS121119
ParaformaldehydEMS19210
Siatka miedziana powlekana węglem Formvar (200 meh)EMSFCF200-CU
Powlekana węglem Formvar  Siatka niklowa (200 oczek)EMSFCF200-NI
Oczyszczanie przeciwciał

Bibliografia

  1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
  2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
  3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
  4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
  6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
  8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
  10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
  12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
  13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
  14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
  16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
  17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
  19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
  20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
  21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
  25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
  26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
  27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
  28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
  30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie egzosom wbarwienie negatywneznakowanie immunoz otemoczyszczanie egzosom wci cie ultracienkielokalizacja bia ekmorfologia egzosom wbarwienie preparat w ca ychprzygotowanie blok w
Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.