Artykuł metodologiczny

Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 września 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół pobierania próbek ludzkiej tkanki kosmków łożyskowych, a następnie izolacji cytotrofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Leczenie trofoblastów TNFα podsumowuje stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości i ułatwia odkrycie celów molekularnych regulowanych przez stan zapalny w łożyskach z otyłością matczyną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość matki wiąże się ze zwiększonym ryzykiem niekorzystnych skutków okołoporodowych, które prawdopodobnie są spowodowane upośledzoną funkcją łożyska, co można częściowo przypisać rozregulowaniu autofagii. Nieprawidłowe zmiany w ekspresji regulatorów autofagii w łożyskach po otyłych ciążach mogą być regulowane przez procesy zapalne związane zarówno z otyłością, jak i ciążą. Opisano tutaj protokół pobierania próbek tkanki kosmków i izolacji cytotrofoblastów kosmków z terminu łożysko ludzkie do pierwotnej hodowli komórek. Następnie stosuje się metodę symulacji środowiska zapalnego w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości poprzez leczenie pierwotnych trofoblastów z beztłuszczowej ciąży czynnikiem martwicy nowotworu alfa (TNFα), cytokiną prozapalną, która jest podwyższona w otyłości i w ciąży. Dzięki wdrożeniu opisanego tutaj protokołu stwierdzono, że narażenie na egzogenny TNFα reguluje ekspresję Rubikonu, negatywnego regulatora autofagii, w trofoblastach z chudych ciąż z płodami żeńskimi. Podczas gdy różne czynniki biologiczne w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości utrzymują potencjał do modulowania krytycznych szlaków w trofoblastach, ten system ex vivo jest szczególnie przydatny do określenia, czy wzorce ekspresji obserwowane in vivo w ludzkich łożyskach z otyłością matki są bezpośrednim wynikiem sygnalizacji TNFα. Ostatecznie podejście to daje możliwość przeanalizowania regulacyjnych i molekularnych implikacji stanu zapalnego związanego z otyłością matki dla autofagii i innych krytycznych szlaków komórkowych w trofoblastach, które mogą potencjalnie wpływać na funkcję łożyska.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość to stan zapalny charakteryzujący się przewlekłym stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia, wynikającym z nadmiaru tkanki tłuszczowej i dostępności składników odżywczych. W otyłości cytokiny prozapalne są podwyższone w tkankach metabolicznych, a także ogólnoustrojowo w krążeniu. Solidny materiał dowodowy wykazał, że TNFα jest znacznie podwyższony w przypadku otyłości, co ma wpływ na insulinooporność i dysfunkcję metaboliczną1. Aktywacja TNFα przyczynia się również do patogenezy choroby w stanach takich jak rak i autoimmunizacja, co czyni go atrakcyjnym celem terapeutycznym2.

Stan zapalny w otyłości jest potęgowany przez ciążę, również stan prozapalny3,4. Wcześniej wykazano, że zawartość TNFα w łożysku wzrasta wraz z otyłością matczyną w ciążach z płodami żeńskimi. Co więcej, leczenie TNFα hamuje oddychanie mitochondrialne w żeńskich, ale nie męskich komórkach trofoblastu, co sugeruje, że TNFα jest zaangażowany w regulację metabolizmu łożyska w sposób dymorficzny płciowo5. Otyłość matki wiąże się ze zwiększoną częstością występowania różnych powikłań podczas ciąży, w tym urodzenia martwego dziecka, przy czym najbardziej podatne są płody płci męskiej3,6,7,8. Ze względu na jego kluczową rolę na styku matka-płód, zmiany w zdolności funkcjonalnej łożyska w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości w odpowiedzi na sygnalizację zapalną mogą odgrywać ważną rolę w pośredniczeniu w wynikach otyłych ciąż

.

Cytotroblasty i syncytiotrofoblasty w tkance kosmkowej łożyska są kluczowe dla sygnalizacji endokrynologicznej oraz wymiany składników odżywczych i tlenu między matką a rozwijającym się płodem9. Zakłócenia zdolności funkcjonalnej cytotrofoblastów kosmków (zwanych dalej trofoblastami) mogą zagrażać zdrowiu i rozwojowi płodu. Protokół ten opisuje metodę pobierania próbek tkanki kosmkowej z ludzkiego łożyska terminowego poprzez wypreparowanie płytek kosmówkowych i podstawnych wraz ze zoptymalizowaną procedurą izolacji trofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Protokół ten wywodzi się z uznanych metodologii obejmujących enzymatyczne trawienie tkanki kosmków w celu uwolnienia komórek z macierzy zewnątrzkomórkowej, a następnie wirowanie o różnej gęstości w celu wyizolowania trofoblastów10,11,12. Protokół ten szczegółowo opisuje podejście, w którym pierwotne trofoblasty z łożysk z beztłuszczowej ciąży są traktowane pożywkami hodowlanymi uzupełnionymi TNFα w celu symulacji jednego składnika środowiska zapalnego związanego z otyłością matki. Na koniec opisano prostą procedurę zbierania całkowitych lizatów komórkowych z trofoblastów poddanych działaniu TNFα, a następnie Western blot w celu wykrycia zmian w ekspresji genów.

Chociaż ten model nie podsumowuje w całości otyłości w macicy, dostarcza kontrolowanego systemu, który pozwala na analizę indywidualnego udziału stanu zapalnego za pośrednictwem TNFα w odpowiedzi trofoblastów na otyłość matki. Model ten daje zarówno możliwość odkrycia lub potwierdzenia celów molekularnych bezpośrednio regulowanych przez sygnalizację TNFα w trofoblastach, jak i pozwala sprawdzić, czy zmiany we wzorcach ekspresji genów obserwowane in vivo w łożyskach z otyłością matki mogą być wynikiem zapalenia za pośrednictwem TNFα.

Opisane tutaj podejście zostało wdrożone w celu zbadania wpływu zapalenia za pośrednictwem TNFα na regulację autofagii u ludzkich trofoblastów. Trofoblasty z otyłych ciąż z płodami męskimi wykazują zaburzony obrót autofagiczny lub dojrzewanie autofagosomów13. Białko o nazwie Rubicon (białko domeny RUN Beclin1-oddziałujące i bogate w cysteinę), które jest zlokalizowane w lizosomach i późnych endosomach, zostało niedawno opisane jako "hamulec" w procesie obrotu autofagicznego, ponieważ działa jako negatywny regulator dojrzewania autofagosomu14,15. W rzeczywistości Rubicon jest rzadkim przykładem białka, które hamuje autofagię, co czyni go cennym celem terapeutycznym. Dostępnych jest bardzo niewiele informacji na temat patofizjologicznego znaczenia Rubikonu, z wyjątkiem jego roli we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na drobnoustroje16,17 i ochrona kardiomiocytów18. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, stwierdzono, że Rubikon jest regulowany w górę w żeńskich pierwotnych trofoblastach w odpowiedzi na leczenie zwiększającym się stężeniem TNFα do 250 pg/ml. Regulacja Rubikonu może odgrywać rolę w tym, jak płody żeńskie radzą sobie lepiej niż mężczyźni w ciążach z otyłością matki. Rekapitulacja stanu zapalnego związanego z otyłością matki ex vivo poprzez wystawienie ludzkich trofoblastów na egzogenny TNFα stanowi platformę do badania wpływu otyłego środowiska wewnątrzmacicznego na regulację krytycznych szlaków w trofoblastach, a co za tym idzie, na funkcję łożyska.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łożyska zostały pobrane z Oddziału Porodowego Szpitala Uniwersyteckiego zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board of Oregon Health and Science University w Portland, Oregon, za świadomą zgodą pacjentów.

1. Pobieranie tkanki łożyskowej

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Cały sprzęt, który ma kontakt z tkanką, musi być sterylny.
    1. Wysterylizować sprzęt do preparacji przez autoklawowanie przez 60 minut w temperaturze 121 °C.
    2. Używaj środków ochrony osobistej (PPE): fartuchów laboratoryjnych/fartuchów/fartuchów, rękawiczek i maski z osłoną twarzy lub goglami.
    3. Włączyć łaźnię wodną i ustawić na 37 °C.
    4. Ogrzać dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 25 ml kompletnej pożywki (zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, Tabela 3) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    5. Za świadomą zgodą pacjentki należy uzyskać łożysko natychmiast po porodzie przez cesarskie cięcie.
    6. Zapoznaj się z łożyskiem. Pępowina jest wprowadzana po stronie płodu (płytka kosmówkowa) i można zobaczyć naczynia krwionośne promieniujące z miejsca wprowadzenia pępowiny. Przeciwna strona to strona matczyna lub płytka podstawna. Obejmuje decidua i struktury zawierające drzewa naczyniowe, zwane liścieniami.
  2. Pobieranie próbek tkanki kosmkowej
    UWAGA: Tkankę kosmkową należy pobrać z łożyska jak najszybciej po porodzie, najlepiej w ciągu 30 minut lub krócej.
    1. Z płytką kosmówkową skierowaną do góry, wyciąć 2-3 odcinki o pełnej grubości (o wymiarach około 2,5 cm x 2,5 cm) 2-3 cm od brzegu łożyska losowo, używając kleszczy i nożyczek (Rysunek 1A).
      UWAGA: Unikaj części łożyska, które wydają się nieprawidłowe (np. białe zwapnienia).
    2. Odetnij płytki kosmówkowe i podstawne oraz wszelkie duże naczynia krwionośne.
    3. Umieścić powstałą tkankę kosmkową (Ryc. 1B, łącznie około 80 - 120 g) w ciepłym kompletnym podłożu i rozpocząć izolację trofoblastu w ciągu 30 minut od pobrania próbki.
      UWAGA: Na niektóre dalsze testy i zastosowania ma wpływ długość okresu opóźnienia między dostarczeniem, pobraniem próbek i izolacją trofoblastu. Najlepiej, aby okresy te były jak najkrótsze i spójne między izolacjami.
    4. Stosując techniki opisane w krokach 1.2.1 - 1.2.2, pobrać 5 losowych odcinków tkanki kosmkowej o wymiarach 1 cm x 1 cm z całego łożyska (w tym ze środka).
    5. Pokrój każdą próbkę tkanki kosmkowej o wymiarach 1 cm x 1 cm na 4-5 mniejszych kawałków (około 30 mg każdy), umieść w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml i błyskawicznie zamroź w płynie N2. Przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w późniejszych analizach.

2. Izolacja trofoblastów z tkanki kosmkowej

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Używaj sterylnego sprzętu i wykonuj zabiegi z udziałem komórek w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Rozmrozić cztery zamrożone gradienty gęstości (Tabela 1, patrz tabela podstawowych materiałów, odczynników i sprzętu, materiał uzupełniający) w temperaturze 4 °C w noc poprzedzającą pojawienie się łożyska.
      UWAGA: Alternatywnie gradienty gęstości można wykonać w dniu izolacji.
    2. Włączyć wirówkę i ustawić na 20 °C.
      UWAGA: Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy maksymalnym przyspieszaniu i zwalnianiu, chyba że określono inaczej.
    3. Przygotować 1x buforowany przez HEPS roztwór soli (HBSS) uzupełniony o Ca+2 i Mg+2 (Tabela 3).
    4. Podgrzej trypsynę do temperatury 37 °C.
    5. Rozcieńczyć DNazę do około 2720 kilojednostek/ml w sterylnym uzupełnionym HBSS.
    6. Podgrzej 50 ml surowicy cielęcej nowonarodzonego do temperatury 37 °C.
    7. Podgrzej całe podłoże do temperatury 37 °C.
    8. Ciepłe media do zamrażania (90% FBS, 10% DMSO, tabela 3) do 37 °C.
      ostrożność: DMSO jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w rękawiczkach.
    9. Przygotować bufor wytrawiający (Tabela 2 i 3), mieszając 308 ml uzupełnionego HBSS, 50 ml trypsyny (3751,7 jednostek BAEE/ml) i 0,5 ml DNazy (379,4 kilojednostek/ml) w sterylnej butelce.
      UWAGA: Przybliżony czas potrzebny do wyizolowania komórek z tkanki kosmków wynosi 7 godzin.
  2. Przetwarzanie tkanki kosmkowej
    1. Opłucz każdy kawałek tkanki kosmkowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze pokojowej (PBS). W razie potrzeby powtórz i wymień PBS, aż nadmiar krwi zostanie usunięty (płukanie PBS będzie jasnoczerwone lub różowe, gdy tkanka zostanie dokładnie wypłukana).
    2. Umieść tkankę kosmków na sterylnej szalce Petriego i usuń jak najwięcej naczyń krwionośnych, delikatnie zeskrobując miękką tkankę kosmkową z naczyń za pomocą szkiełka mikroskopowego.
    3. Drobno zmiel powstałą tkankę kosmkową za pomocą nożyczek.
  3. Trawienie tkanek kosmków i surowa izolacja trofoblastów
    1. Przenieść zmieloną tkankę kosmkową do sterylnej butelki z roztworem do wytrawiania zgodnie z objętościami obliczonymi na podstawie specyficznej aktywności trypsyny i DNazy (165 ml, tabela 2).
    2. Po 35 minutach inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 70 obrotów na minutę (obr./min), przechylić butelkę do wytrawiania na bok i pozwolić, aby niestrawione kawałki tkanki osiadły na dnie butelki. Ostrożnie pobrać supernatant za pomocą pipety serologicznej, omijając osiadłą tkankę.
    3. Dozować supernatant przez sitko o pojemności 100 μm równomiernie między probówkami stożkowymi o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, zaleca się rozpoczęcie drugiego trawienia od dodania roztworu wytrawiającego (110 ml, Tabela 2) do pozostałej osiadłej tkanki i wznowienia inkubacji zgodnie z opisem w kroku 2.3.2.
    4. Delikatnie ułóż 3 - 5 ml NCS pod odcedzonym supernatantem, powoli dozując z pipety serologicznej na dnie probówki. Powinna być widoczna łąkotka pomiędzy napiętym supernatantem (zawierającym trofoblasty) a NCS (Rysunek 2A).
    5. Odwirować supernatanty nad NCS w stężeniu 1,250 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Powstała w ten sposób osadka będzie zawierała czerwone krwinki w najniższej warstwie, a następnie białą warstwę zawierającą komórki trofoblastu (Ryc. 2B).
    6. Powtórzyć kroki 2.3.2-2.3.5 dla każdego z drugiego i trzeciego etapu trawienia (dodając odpowiednio 110 ml i 83,5 m roztworu trawiącego do butelki z tkanką, Tabela 2).
    7. Po odwirowaniu wszystkich supernatantów należy ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml ciepłej, kompletnej pożywki, a następnie połączyć zawiesiny razem.
    8. Podzielić zawiesinę komórek równo między dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1,250 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C.
    9. Delikatnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą z granulek komórek w 6 ml ciepłej, kompletnej pożywki.
  4. Wirowanie gęstości
    1. Podzielić zawiesinę komórek równo między cztery gradienty gęstości (po 3 ml każdy), powoli i ostrożnie nakładając zawiesinę komórek na wierzch gradientów gęstości za pomocą pipety do przenoszenia.
    2. Odwirować gradienty gęstości przy 1 250 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C przy minimalnym przyspieszaniu i zwalnianiu. W ten sposób powinny powstać wyraźne prążki osadzonych komórek (Tabela 4).
    3. Powoli i ostrożnie usuwać górne warstwy podłoża o gradiencie gęstości (DGM), aż do osiągnięcia nieprzezroczystych pasm zawierających komórki trofoblastu (między 35 - 50% DGM) (Tabela 4).
    4. Przenieś pasma trofoblastu do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i napełnij ciepłym kompletnym podłożem.
    5. Delikatnie odwrócić probówki 3 - 6 razy, aby wymieszać i odwirować w temperaturze 1 250 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 5 ml ciepłej, kompletnej pożywki. Połącz zawiesiny komórek i policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego (lub preferowanej metody zliczania komórek).
  5. Liczenie komórek za pomocą hemocytometru
    1. Wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując w górę i w dół pipetą serologiczną lub delikatnie obracając probówkę kilka razy.
    2. Połączyć równe części zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego (tj. po 20 μl każda) w oddzielnej probówce i delikatnie wymieszać.
    3. Inkubować przez 1 - 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Delikatnie dozować 15 - 20 μl mieszaniny komórek i błękitu trypanowego między szkiełko nakrywkowe a hemocytometr i pozwolić komórkom dyfundować przez siatkę poprzez działanie kapilarne.
    5. Policz żywe komórki (martwe komórki zostaną zabarwione na ciemnoniebiesko) w każdym z czterech kwadrantów 4 x 4 z licznikiem zliczeń. Zastosuj system liczenia, aby upewnić się, że komórki nie są liczone więcej niż raz (tj. nie licz komórek, które dotykają dolnej lub lewej granicy).
      UWAGA: Każdy kwadrant 4 x 4 powinien zawierać od 50 do 150 komórek. Zbyt mała lub zbyt duża liczba komórek może prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania liczby komórek.
    6. Uśrednić całkowitą liczbę komórek z każdego z kwadrantów 4 x 4, pomnożyć przez 104, a następnie pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (zawiesina komórek do błękitu trypanowego), aby obliczyć liczbę komórek na ml.
    7. Pomnóż liczbę komórek na ml przez całkowitą objętość zawiesiny komórek, aby obliczyć całkowitą wydajność komórek.
      UWAGA: Oczekuje się, że około 100 milionów komórek zostanie pobranych z izolacji, zaczynając od 80-120 g tkanki kosmkowej.
  6. Ogniwa galwaniczne
    1. Umieść 3 miliony komórek/dołek (3,3 x 10,5 komórek nacm2) na płytce 6-dołkowej (2 ml zawiesiny na dołek) i delikatnie kołysz się w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
      UWAGA: Trofoblasty wymagają płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, aby prawidłowo przylegały. Do promowania syncytializacji wymagana jest monowarstwa komórek.
    2. Pozostaw platerowane komórki w okapie z przepływem laminarnym na około 30 minut, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie, osiadanie i przyleganie komórek do dna studzienek przed umieszczeniem w inkubatorze.
    3. Hodowla komórek przez okres do 72 godzin (przy codziennej wymianie pożywki) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%CO2 i wilgotnością 95%.
      UWAGA: Zbadaj trofoblasty pod mikroskopem przy 10 - 20 razy co 24 godziny hodowli. Trofoblasty nie namnażają się i nie mogą być przenoszone. W ciągu 72 godzin hodowli okrągłe pojedyncze trofoblasty łączą się, tworząc syncytium (Ryc. 3A i B).
  7. Zamrażanie komórek
    1. Niewykorzystane komórki osadzać przez odwirowanie w temperaturze 1 250 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
    2. Odessać jak najwięcej pożywki z osadu.
    3. Zawiesić osad w pożywce do zamrażania (Tabela 3).
    4. Zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania wypełnionym 100% izopropanolem. Następnego dnia przenieść zamrożone porcje do płynu N2 w celu długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Komórki można hodować po zamrożeniu.
  8. Rozmrażanie komórek
    1. Usunąć porcję zamrożonych komórek i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, podczas wirowania. Usunąć podwielokrotność z łaźni wodnej tuż przed jej całkowitym rozmrożeniem do postaci płynnej.
    2. Natychmiast przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zaczynając na początku zwalniać, dodaj 10 ml kompletnej pożywki z przerywanym mieszaniem.
    3. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.
    4. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 - 5 ml ciepłej, kompletnej pożywki.
    6. Policz komórki i płytkę zgodnie z wcześniejszym opisem.

3. Leczenie pierwotnych trofoblastów TNFα, zbiór lizatów komórkowych i Western Blotting

  1. preparat
    1. Podgrzej całe podłoże do temperatury 37 °C.
    2. Przygotować zapas 10 μg/ml TNFα w kompletnych pożywkach i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    3. Przygotuj zapas roboczy TNFα o stężeniu 1 μg/ml w kompletnych pożywkach, gdy będziesz gotowy do obróbki komórek. Seryjnie rozcieńczać materiał roboczy TNFα do 104 pg/ml, 103 pg/ml, 500 pg/mL, 250 pg/ml i 125 pg/ml w kompletnych pożywkach.
      UWAGA: Stężenie TNFα wynoszące 104pg/ml jest umiarkowanie cytotoksyczne. Dostosowanie badanych stężeń TNFα będzie zależało od specyfiki pożądanych dalszych zastosowań.
  2. Traktowanie komórek TNFα
    1. Po 24 godzinach hodowli odessać pożywki hodowlane z komórek i zastąpić 2 ml pożywki uzupełnionej TNFα na basenik na płytkach 6-dołkowych (co najmniej dwa dołki na zabieg i kontrolę nośnika).
    2. Po 24 godzinach ekspozycji na TNFα (48 godzin hodowli) należy zastąpić pożywki uzupełnione TNFα kompletnymi pożywkami.
  3. Pobieranie komórek i białko ogółem
    1. Po 72 godzinach hodowli (24 godziny po usunięciu TNFα), odessać pożywkę, delikatnie przepłukać komórki PBS o temperaturze pokojowej i dodać 80 μl lodowatego buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA) zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy i fosfatazy (Tabela 3) bezpośrednio do każdego dołka.
    2. Usuń komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, gromadząc studzienki w grupach leczonych.
    3. Poddać komórki lizie, wirując probówki na wysokich obrotach przez co najmniej trzy odstępy czasu po 15 sekund.
    4. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 15 min.
      UWAGA: Alternatywnie, po kroku 3.3.3., komórki można inkubować na lodzie przez 15 minut z przerywanym mieszaniem poprzez przesuwanie probówki, wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół.
    5. Powtórz krok 3.3.3.
    6. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych.
    7. Przenieść supernatant (zawierający białko komórkowe) do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu można zatrzymać protokół i wznowić go w późniejszym czasie. Wskazane jest wykonanie kilku porcji próbek białek komórkowych, aby uniknąć wielu cykli zamrażania i rozmrażania.
    8. Oznaczyć całkowite stężenie białka za pomocą preferowanej metody, takiej jak test kwasu bicinchoninowego (BCA, patrz tabela podstawowych materiałów, odczynników i sprzętu, materiał uzupełniający).
  4. SDS-PAGE i Western Blotting dla Rubikonu lub Białka Zainteresowania
    UWAGA: Postępuj zgodnie z protokołami Western blott zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z preferowanego systemu laboratoryjnego.
    1. Załadować od 20 do 40 μg białka całkowitego do buforu próbki (tabela 3) na studzienkę na 12% żel akrylamidowy. Oddzielić białka za pomocą SDS-PAGE w uruchomionym buforze (Tabela 3).
    2. Przenieść białka na mokro z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) zgodnie z instrukcjami producenta w buforze transferowym (Tabela 3).
    3. Inkubować błonę w 5% mleku w proszku w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,1% Tween 20 (TBST, tabela 3) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
    4. Inkubować błonę w przeciwciałie pierwszorzędowym Rubicon (patrz tabela podstawowych materiałów, odczynników i sprzętu, materiał dodatkowy) w stosunku 1:500 w 1% mleku w proszku w TBST przez noc w temperaturze 4 °C z kołysaniem.
    5. Delikatnie umyj membranę 3 x 5 min w TBST i 1 x 5 min w TBS w temperaturze pokojowej z bujaniem.
    6. Inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym w proporcjach 1:2000 - 1:5000 (sprzężony z HRP lub preferowany widoczny koniugat, patrz tabela podstawowych materiałów, odczynników i sprzętu, materiał uzupełniający) w 5% mleku w proszku w TBST przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
    7. Powtórzyć procedurę płukania opisaną w kroku 3.4.5 i uwidocznić plamę za pomocą odpowiedniej wizualizacji (tj. chemiluminescencyjnego) podłoża na systemie obrazowania.
    8. Powtórzyć procedurę prania opisaną w kroku 3.4.5 i zbadać membranę pod kątem β-aktyny lub preferowanej kontroli obciążenia zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. W preferowanym oprogramowaniu do analizy obrazu przeanalizuj ekspresję Rubikonu poprzez ręczne ilościowe określenie absorbancji (intensywności pasma), odejmowanie absorbancji tła i normalizację do odpowiednich intensywności pasma kontroli obciążenia. Przeprowadzać analizy statystyczne w stosownych przypadkach w celu zbadania statystycznie istotnych zmian w poziomach białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łożyska ludzkie donoszone od szczupłych matek (wskaźnik masy ciała (BMI) sprzed ciąży <25) z niepowikłanymi ciążami, noszących potomstwo płci żeńskiej, zostały pobrane i pobrane próbki w ciągu 15 minut od porodu przez cesarskie cięcie (bez porodu). Łożyska badano pod kątem braku zwapnień i typowego rozwoju: o masie od 300 do 600 g z usuniętą pępowiną i błonami, o okrągłym kształcie, o średnicy od 15 do 25 cm, z pępowiną wprowadzoną do środka łożyska. Tkankę kosmkową wypreparowano z pły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łożysko, odpowiedzialne za regulację wzrostu płodu, wykazuje upośledzoną funkcję w środowisku otyłości6. Pomimo wysokiego zapotrzebowania metabolicznego trofoblastów, łożyska z otyłością matczyną wykazują dysfunkcyjne oddychanie mitochondrialne 6,19. Zmiany w metabolizmie łożyskowym mogą przyczyniać się do zwiększonej częstości występowania powikłań i niekorzystnych wyników u płodu obserwowanych w ciążach otyłych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują kobietom, które oddały swoje łożyska do tego badania. Dziękujemy również Działowi Porodów i Porodów OHSU oraz Zespołowi Badań nad Matką i Płodem za koordynację pobierania łożysk. Jesteśmy wdzięczni dr Ericowi Wangowi i dr Kelly Kuo za wsparcie i pomoc w metodach eksperymentalnych i optymalizacji.

Ta praca została sfinansowana przez NIH HD076259A (AM) i AHA GRNT29960007 (AM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (anhydr.)Sigma-AldrichC1016-100G
MgSO4 (anhydrod.)Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TrypsynaGibco15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.
Inhibitory proteazy/fosfatazy:Thermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTA, Invitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
Deoksycholan sodu.Fisher ScientificAAJ6228822
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco" s Medium (IMDM)Gibco12440-046
Surowica bydlęca płodu (FBS)Corning35-010-CV
Surowica cielęca noworodka (NCS)Gibco26010-074
Penicylina/Streptomycyna (pióro/paciorkowiec)Gibco15140-122
10% formalinaFisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNF&alfa;Sigma-AldrichSRP3177-50UG
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco70013-032
K2EDTA probówki do pobierania krwi w suszarceBD366450
Percoll (podłoże o gradiencie gęstości, DGM)GE Healthcare17-0891-01
Płytki 6-dołkoweCorning353046
Sitka komórkoweFisher Scientific22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2,0 mL, naturalnyFisher Scientific22363352
Trypan BlueCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini komórka trans-BlotBio-Rad1658033
Zestaw TGX FastCast do akrylamidu, 12% Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 Komora odlewniczaBio-Rad1654112
4X Laemmli Bufor do próbekBio-Rad1610747
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148-100ML
GlicynaBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
Instant Beztłuszczowe mleko w suchymmleku Goździk
Rubikon (D9F7) Technologiasygnalizacji komórkowej8465S
Monoklonalne przeciwciało anty-β-aktynowe wytwarzane u myszySigma-AldrichA2228-100UL
Anty-królicze IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciała sprzężonego z HRP7074S
Anty-mysie IgG, przeciwciałosprzężone z HRPTechnologia sygnalizacji komórkowej7076S
SuperSignal West Pico PLUS Podłoże chemiluminescencyjneThermo Scientific34578
LS002139, , , , , , , , , mAb królika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975(2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja trofoblastupobieranie pr bek tkanki kosmkowejtraktowanie TNF alfapierwotna hodowla kom rekWestern blottinganaliza immunocytochemicznawirowanie w gradiencie g sto ciekspresja Rubiconumodel oty o ci matczynejregulacja autofagii

Powiązane artykuły