Artykuł metodologiczny

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

DOI:

10.3791/56487

⸱

18 października 2017

 ,  , 
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy metodę wykorzystującą Caenorhabditis elegans jako modelowego gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych. Drobnoustroje są wprowadzane przez dietę, co sprawia, że jelito jest głównym miejscem choroby. Jelito nicieni strukturalnie i funkcjonalnie naśladuje jelita ssaków i jest przezroczyste, dzięki czemu jest podatne na mikroskopowe badania kolonizacji. Tutaj pokazujemy, że patogeny mogą powodować choroby i śmierć. Jesteśmy w stanie zidentyfikować mutanty mikrobiologiczne, które wykazują zmienioną zjadliwość. Jego zachowana wrodzona odpowiedź na stresy biotyczne sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do badania aspektów wrodzonych interakcji immunologicznych gospodarza. Pokazujemy, że gospodarze z mutacjami w genie podwójnej oksydazy nie mogą wytwarzać reaktywnych form tlenu i nie są w stanie oprzeć się zniewadze mikrobiologicznej. Dalej pokazujemy wszechstronność prezentowanego testu przeżycia, pokazując, że może on być wykorzystany do badania skutków działania inhibitorów wzrostu drobnoustrojów. Test ten może być również wykorzystany do odkrycia czynników wirulencji grzybów jako celów dla rozwoju nowych środków przeciwgrzybiczych, a także dać możliwość dalszego odkrywania interakcji gospodarz-mikroorganizm. Konstrukcja tego testu dobrze nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych całego genomu, a możliwość kriogenizacji robaków do wykorzystania w przyszłości sprawia, że jest to opłacalny i atrakcyjny model całego zwierzęcia do badania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans jest używany jako potężny organizm modelowy od ponad 50 lat. W latach sześćdziesiątych XX wieku południowoafrykański biolog Sydney Brenner był pionierem w wykorzystaniu C. elegans do badania rozwoju neuronów, torując drogę długiej linii naukowców do badania różnych aspektów biologii komórek i zwierząt u nicieni. Do tej linii zaliczają się laureaci Nagrody Nobla Craig Mello i Andrew Fire za ich pracę nad RNAi1, Robert Horvitz i John Sulston za pracę nad rozwojem narządów i apoptozą2,3,4, oraz Martin Chalfie za pracę nad zielonym białkiem fluorescencyjnym5. Chociaż ten organizm modelowy był tradycyjnie używany do badania biologii molekularnej i rozwojowej, w ciągu ostatnich 15 lat naukowcy zaczęli używać C. elegans do badania biologii różnych ludzkich patogenów, w tym Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica i Serratia marcescens6,7,8,9,10. Badania te ujawniły, że wiele mechanizmów zaangażowanych w interakcję człowiek-patogen jest konserwatywnych w nicieniach, ale także, że istnieją pewne mechanizmy odpornościowe, które są unikalne dla tego organizmu modelowego11,12. W naturze C. elegans napotyka różne zagrożenia ze strony połkniętych patogenów obecnych w glebie, co zapewniło silną presję selekcyjną, aby ewoluować i utrzymywać wyrafinowany wrodzony układ odpornościowy w świetle jelita. Wiele genów i mechanizmów zaangażowanych w ochronę światła jelit jest koordynowanych przez wysoce konserwatywne elementy, które występują również u ssaków wyższych11,13. C. elegans stanowi zatem doskonały model do badania patogenów przewodu pokarmowego, takich jak Salmonella enterica14, Shigella boydii15, lub Vibrio16.

Tutaj podkreślamy niezwykłą wszechstronność C. elegans jako modelowego gospodarza do badania czynników zakaźnych, takich jak C. albicans. C. elegans jako modelowy gospodarz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem zjadliwości, które są tańsze i bardziej czasochłonne niż model mysi, który jest powszechnie stosowany do badania kandydozy42.

W tym badaniu pokazujemy, że ten model i test przeżycia mogą być niezawodnie wykorzystywane do badania wrodzonych efektorów immunologicznych gospodarza, ważnych dla przeciwdziałania infekcjom, determinantów patogenów, które napędzają zjadliwość, oraz związków farmakologicznych, które mogą interweniować w patogenezie. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych testów, metoda ta umożliwia badanie narażenia na patogen przez całe życie zwierzęcia, od stadium larwalnego do dorosłości, a nie tylko od dorosłości do śmierci43,44. Podsumowując, nasz model C. elegans - C. albicans jest wszechstronnym i potężnym narzędziem, które można wykorzystać nie tylko do badania podstaw genetycznych napędzających infekcję i odporność, ale także do identyfikacji nowych związków do interwencji terapeutycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki dla nicieni (NGM)

  1. Na 1 l pożywki należy połączyć 20 g agaru, 2,5 g organicznego źródła azotu (np. baktopeptonu) i 3 g chlorku sodu w kolbie o pojemności 2 l. Dodaj 975 ml sterylnej wody.
    1. Dodaj sterylną mieszankę. W przypadku korzystania z automatycznego nalewaka mediów, rurki autoklawu i media przez 15 minut; Nośniki powinny być sterylizowane w autoklawie przez dłuższy czas, jeśli wytwarzana jest większa objętość.
  2. Umieść media na mieszance i pozostaw do ostygnięcia.
    1. Gdy podłoże jest ciepłe w dotyku (około 60 °C), należy w asepcie dodać 1 ml 1 M MgSO4● H2O, 1 ml 1M CaCl2, 25 ml KPO4 i 1 ml 0,5% cholesterolu w etanolu.
    2. Wlać pożywkę (ręcznie lub za pomocą pompy automatycznej) pod przepływem laminarnym do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm. Pozostawić do wyschnięcia pod kapturem na 1-2 dni przed użyciem.
      UWAGA: Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

2. Wybieranie robaków

  1. Wytnij 1,5 cm kawałek drutu aluminiowego. Ostrożnie włóż około 0,5 cm tej długości do końcówki pipety Pasteura.
    1. Za pomocą palnika Bunsena lub lampy alkoholowej rozpuść szklaną końcówkę pipety, powoli obracając ją w płomieniu, aż drut zostanie bezpiecznie przyklejony do pipety, nie naruszając przy tym oryginalnego kształtu końcówki pipety.

3. Przygotowanie kultury E. coli

  1. Za pomocą sterylnej pętli zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu E. coli OP50 w 200 ml bulionu Luria. Inkubować przez noc, wytrząsając w temperaturze 37 °C.
  2. Płynna kultura jest gotowa do użycia następnego dnia i może być przechowywana w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana.
    UWAGA: Szczep E. coli, OP50, jest używany jako źródło pożywienia dla C. elegans. Kultura ta może być używana przez okres do kilku miesięcy, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.

4. Niezbędna konserwacja C. elegans

  1. Przygotuj nasiona płytek agarowych NGM z E. coli, nakrapiając około 50 - 100 μl przygotowanej płynnej kultury OP50 na środku płytki.
  2. Przykryj płyty i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Po wyschnięciu umieść płytki w temperaturze 37 °C na noc, aby uzyskać szybki wzrost lub przechowuj w temperaturze pokojowej, jeśli pożądany jest wolniejszy wzrost.
  3. Dodaj robaki do talerza poprzez "krojenie" (patrz krok 5 protokołu "Chunking i zbieranie robaków"), zbieranie robaków pojedynczo lub umieszczanie jaj robaków bezpośrednio na talerzu (patrz krok 6 protokołu "Przygotowanie jaj").

5. Porcjowanie i zbieranie robaków

UWAGA: "Chunking" odnosi się do praktyki, która jest powszechna w utrzymaniu C. elegans. Polega to na przecięciu części płytki agarowej NGM, która zawiera robaki, i przeniesieniu tego kawałka na nową płytkę, przenosząc w ten sposób również dużą liczbę robaków w tym procesie. W ten sposób można również wyciąć zanieczyszczenia z płyty. Podczas zbierania robaków ważne jest, aby zachować integralność agaru, ponieważ robaki mogą zostać zgubione w otworach w agarze . Ponadto ważne jest, aby przed dotknięciem płytki pozwolić kilofowi ostygnąć, aby zapobiec stopieniu agaru lub spaleniu robaków.

  1. W celu szybkiego przeniesienia dużych ilości robaków na nowe płytki, za pomocą szpatułki należy wyciąć kawałek agaru NGM zawierający wybrane robaki. Usuń wycięty kawałek i połóż go ekranem do dołu na krawędzi trawnika OP50 na nowej płycie.
  2. Przenoś robaki pojedynczo, jak opisano poniżej w kroku 8.2 protokołu "Test przeżycia", używając kilofa do robaków. Podpal drut w ślimakowym kilofie, aż stanie się czerwony. Zdejmij go z płomienia i pozwól mu ostygnąć przez kilka sekund.
  3. Używając drutu na kilofie, delikatnie zeskrob trawnik z kultury OP50 wyhodowanej na nowej płycie, zakrywając drut na kilofie.
  4. Lepka kultura pokrywająca końcówkę drutu sprawia, że robaki przyklejają się do końcówki kilofa, dzięki czemu delikatnie podnoszą wybrane robaki ruchem machnięcia.
  5. Po zebraniu wybranych robaków umieść je na nowej płytce, delikatnie przesuwając kulturę po agarze . Umieść drut w płomieniu, aby usunąć pozostałą kulturę z kilofa.

6. Przygotowanie jajek

  1. Umieścić około 20 dorosłych zwierząt (około 2 - 3 dni po wykluciu, gdy są hodowane w temperaturze 20 °C) poprzez zrywanie lub fragmentowanie, jak opisano w kroku 5 protokołu "Chunking and Picking Worms" na talerzu wysianym 50 μl szczepu E. coli, OP50.
  2. Aby zebrać jaja, po 1-2 dniach zalej płytkę 10 ml buforu M9. Za pomocą szklanej pipety serologicznej zamieszaj i delikatnie wymieszaj zawartość na płytce agarowej, aby uwolnić jaja przyklejone do OP50 lub dorosłych zwierząt. Zbierz cały płyn zawierający jaja i dorosłe osobniki.
  3. Przenieść roztwór M9 i OP50 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować 15 ml stożkowej probówki o stężeniu 2 100 x g przez 2 min.
  4. Odessać około 9 ml supernatantu, nie naruszając osadu OP50.
  5. Zawiesić osad w 2 ml sterylnej wody, 1 ml wybielacza i 1 ml 0,25 M NaOH.
  6. Mieszaj delikatnie przez odwrócenie, aż większość (około 70 procent) dorosłych zwierząt będzie wyglądać na zlizowaną; zazwyczaj jaja pozostają nienaruszone podczas tego krótkiego wybielania ze względu na ich skorupę. Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez 2 minuty.
  7. Odessać supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu M9.
  8. Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez 2 minuty. Odsysać supernatant bez naruszania osadu. Zawiesić osad z 200 μl buforu M9.
    UWAGA: Przygotowanie jaj może wymagać wielu prób. Jaja mogą zostać zniszczone, jeśli są zbyt długo wystawione na działanie wybielacza. Jeśli jaja się nie wyklują, zmniejsz stężenie wybielacza w roztworze lub skróć czas ekspozycji na wybielacz.

7. Ustawienie tabliczki infekcyjnej

  1. Dozuj 3-5 ml YPD do sterylnej probówki i zaszczep ją pojedynczą kolonią Candida albicans za pomocą sterylnej pętli.
    1. Umieścić probówkę na bębnie obrotowym na około 16-18 godzin w temperaturze 30 °C.
  2. Oznacz jedną probówkę o pojemności 1,5 ml do mikrofuge, aby zawierała C. albicans, a drugą jako zawierającą OP50. Zapisz wagę każdej pustej tuby.
    1. Umieścić 500 μl nocnej kultury C. albicans w probówce oznaczonej C. albicans i 1 500 μl nocnej kultury OP50 (od kroku 3.1) do probówki oznaczonej OP50.
    2. Wirować przez 10 minut przy 16 100 x g. Odsysać supernatant bez zakłócania osadu.
    3. Zawiesić każdą granulkę w 500 μl sterylnej wody. Wirować przez 5 minut przy 16 100 x g.
    4. Odessać supernatant bez naruszania osadu. Zapisz ostateczną wagę probówek do mikrofuge.
    5. Określ wagę każdej granulki, odejmując początkową wagę probówek do mikrofuge od końcowej wagi.
  3. Używając sterylnej wody, ponownie zawiesić granulkę C. albicans na 10 mg/ml, a pastylkę OP50 na 200 mg/ml. Przygotuj główną mieszankę infekcji, łącząc 10 μl 50 mg/ml roztworu streptomycyny, 2,5 μl kultury OP50, 0,5 μl kultury C. albicans i 7 μl sterylnej wody.
    1. W przypadku płytek kontrolnych należy utworzyć mieszankę wzorcową, zastępując objętość kultury C. albicans sterylną wodą. Wysiewać 20 μl mieszanki infekcyjnej lub roztworu kontrolnego OP50 na środek płytek NGM za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Do określenia istotności statystycznej podczas analizy potrzeba około 100 robaków. Ten test jest zwykle przeprowadzany w trzech egzemplarzach. W ten sposób powstaje 3,2-krotna mieszanka infekcji, a także 3,2-krotne rozwiązanie kontrolne. Mieszanki te są wykonane tak, aby były nieco ponad 3 razy większe niż oryginalne, aby zapewnić, że pełne 20 μl zostanie wysiane na każdą płytkę, co pozostawia miejsce na błędy. Ta główna mieszanka powstaje, ponieważ gardło robaka jest zbyt małe w początkowych stadiach larwalnych (L1-L3), aby spożywać C. albicans. W przypadku ekspozycji na środki farmakologiczne, takie jak flukonazol (Rysunek 3B), środek wprowadza się do mieszaniny infekcyjnej. Stężenie środka określa się empirycznie. Na przykład w Rysunek 3B, 50 μM Flukonazol jest reprezentowany, jednak 0, 12,5, 25, 50 i 100 μM Flukonazol były również testowane przy użyciu tego samego protokołu.

8. Analiza fenotypu zdeformowanego regionu odbytu (Dar) i test przeżycia

  1. Wizualizacja fenotypu Dar
    UWAGA: Dar najlepiej wizualizować na etapie L3 i później. Dar przedstawia się jako mały występ w okolicy postanalnej robaka (Ryc. 2A), który z czasem staje się bardziej widoczny.
    1. Potwierdź, czy zwierzę ma Dar, szybko stukając w płytkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego; zwierzęta bez Dar natychmiast się cofną, podczas gdy zwierzęta z Darem będą potrzebowały wielokrotnych rund stukania, aby odwrócić swój kierunek, lub nie zrobią tego wcale.
  2. Test przeżycia
    1. Kompletne przygotowanie jaj zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 6 protokołu "Przygotowanie jaj". Policz jaja pod zakresem sekcji i rozcieńcz roztwór jaj M9, aż do uzyskania stężenia około 5-6 zdrowych jaj na μl. Za pomocą pipety dozować 20 μl próbki zawierającej około 30 jaj na przygotowaną płytkę NGM, w obszarze między kulturą bakteryjną a bokiem płytki (jaja i pokarm dla robaków, OP50, znajdują się w dwóch różnych miejscach).
    2. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez 48 godzin. Pod mikroskopem preparacyjnym policz liczbę żywych i martwych dorosłych robaków na każdej płytce, a także liczbę robaków z Darem. Zapisz procent za pomocą Dara.
    3. Rozważ martwe zwierzę, jeśli nie reaguje na stuknięcie w głowę aluminiowym drutem lub stukanie w talerz.
    4. Co drugi dzień przenoś pozostałe dorosłe robaki, zbierając je zgodnie z opisem w kroku 5 protokołu "Chunking and Picking Worms" na nową płytkę infekcyjną lub kontrolną. W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj test przeżycia, śledząc liczbę żywych, martwych i brakujących robaków każdego dnia.
      UWAGA: Ten test może trwać dwa tygodnie, zaczynając od przygotowania jaj. Ponadto roztwór jaj nie powinien być dozowany do kultury bakteryjnej, ponieważ roztwór może zawierać śladowe ilości wybielacza, który może zabić OP50. Roztwór należy również dozować w odległości około 0,5 cm od krawędzi płytki, ponieważ jajka mogą utknąć między bokami talerza a agarem. Dodatkowo, ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się robaków, przeniesienie dorosłych osobników na nowe płytki ma kluczowe znaczenie dla oddzielenia ich od potomstwa.
  3. Analizuj przetrwanie
    1. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy krzywych przeżycia (patrz lista materiałów).
    2. Porównaj krzywe przeżycia za pomocą metody Grehana-Breslowa-Wilcoxona (zakładając, że dane z wczesnych czasów przeżycia są dokładniejsze niż późniejsze, odpowiednio zważ dane), a także narzędzi statystycznych Logrank45.
      UWAGA: Na przykład w Rysunek 4B-C, przeżywalność robaków leczonych zmutowanym C. albicans jest porównywana z tymi, którym podano kontrolę izogeniczną typu dzikiego lub szczepy komplementarne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test patogenezy A (Rysunek 1) z użyciem C. albicans i C. elegans został wcześniej opisany przez nasze lab17,18 i inne labs19,20. Wykazujemy zasadność stosowania C. elegans do badania zjadliwości C. albicans, pokazując, że komórki C. albicans są szybko połykane przez robaki i gromadzą się w świetle j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane przez nas metody oznaczania zakażenia C. elegans i przeżywalności w ciągu całego życia narażenia na C. albicans można zmodyfikować w celu przetestowania innego patogenu. Płynne kultury innych bakterii lub grzybów mogą być wytwarzane i podawane C. elegans w podobny sposób. Dodatkowo, seryjne infekcje można przeznaczyć, najpierw wystawiając larwę na działanie jednego patogenu, jak opisano, a następnie przenosząc zwierzęta na nową płytkę zawierającą oddzielny patogen po osiągnięciu dorosło...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana i wspierana przez Worcester Polytechnic Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar (granulowany, klasy bakteriologicznej)Apex BioResearch Products20-248
Drut aluminiowy (95% Pt, 32 gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss Mikroskop odwróconyAxiovision Zeiss
Bacto-PeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans szczep Bli-3Caenorhabditis Centrum GenetykiBli-3(e767) CB767
Chlorek wapniaFisher ScientificBP51-250
Cholesterol, stopień Sigma, minimum 99%SigmaC8667-25G
Jednorazowe probówki hodowlane (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Mikroskop preparacyjny (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCentrum Genetyki CaenorhabditisOP50
Pryzmat GraphPad (oprogramowanie do analizy krzywej przeżycia)Oprogramowanie
LB Bulion (Millera)Apex BioResearch Products11-120
Siarczan magnezuFisher Scientific10034-99-8
Średnie szalki Petriego (35 x 10 mm)Sokół
Fosforan potasu jednozasadowySigmaP0662-500G
Chlorek soduFisher ScientificBP358-1
Fosforan soduFisher ScientificBP332-500
Typ dziki C. albicans SC5314ATCCSC5314
Typ dziki C. elegansCaenorhabditis Centrum GenetykiN2
GraphPad353001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4(2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417(2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982(2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558(2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074(2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35(2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453(2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662(2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test zaka enia grzybiczegotest prze ywalno ciwy awianie nicieniprzygotowanie jajCandida albicanskolonizacja jelitowaczynniki wirulencjiodporno wrodzona

Powiązane artykuły