To badanie ocenia wytrzymałość na złamania kości korowej bydła na poziomie sub-mezo za pomocą mikroskopowych testów zadrapań. Jest to oryginalna, obiektywna, rygorystyczna i powtarzalna metoda proponowana do badania odporności na pękanie poniżej skali makroskopowej. Potencjalne zastosowania to badanie zmian w kruchości kości spowodowanych chorobami takimi jak osteoporoza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena kruchości kości korowej bydła za pomocą testów zadrapań
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kość to złożony materiał hierarchiczny z pięcioma odrębnymi poziomami organizacji. Czynniki takie jak starzenie się i choroby takie jak osteoporoza zwiększają kruchość kości, czyniąc je podatnymi na złamania. Ze względu na duży społeczno-ekonomiczny wpływ złamań kości na nasze społeczeństwo, istnieje zapotrzebowanie na nowatorskie sposoby oceny sprawności mechanicznej każdego hierarchicznego poziomu kości. Chociaż sztywność i wytrzymałość można badać we wszystkich skalach – nano-, mikro-, mezo- i makroskopowych – ocena pęknięć była do tej pory ograniczona do badań makroskopowych. To ograniczenie ogranicza naszą wiedzę na temat złamań kości i ogranicza zakres badań laboratoryjnych i klinicznych. W tym badaniu badamy odporność kości na złamania od mikroskopijnej do mezoskopowej skali długości za pomocą testów mikrozarysowania w połączeniu z nieliniową mechaniką złamań. Badania wykonuje się w krótkiej orientacji podłużnej na próbkach kości korowej bydła. Opracowano skrupulatny protokół eksperymentalny i przeprowadzono dużą liczbę (102) testów w celu oceny odporności na złamania próbek kości korowych przy jednoczesnym uwzględnieniu niejednorodności związanej z mikrostrukturą kości.
Wprowadzenie
W tym badaniu mierzymy odporność na złamania zbitej kości bydlęcej od mezoskali (osteony) do mikroskali (poziom blaszkowy) przy użyciu nowatorskiej techniki mikro drapania1,2,3,4,5. Na procesy pękania, w tym inicjację i propagację pęknięć w kościach, bezpośredni wpływ mają skale długości ze względu na różne składniki strukturalne i organizację na różnych poziomach hierarchii. Dlatego ocena złamań kości w mniejszych skalach długości jest niezbędna do uzyskania podstawowego zrozumienia kruchości kości. Z jednej strony, konwencjonalne testy, takie jak zginanie trzypunktowe, kompaktowe rozciąganie i testy zginania, są powszechnie przeprowadzane na kości udowej i piszczelowej bydła w celu scharakteryzowania złamań w skali makroskopowej6,7,8. Z drugiej strony, aby zmierzyć odporność na pękanie w skali mikroskopowej, zaproponowano złamanie wgniecenia Vickera9. Mikrowgłębienie wykonano przy użyciu wgłębnika Vickera w celu wygenerowania pęknięć promieniowych. Ponadto metodę odporności na pękanie metodą nanoindentation Oliver Pharr wykonano przy użyciu ostrego narożnika sześciennego indenter10.
W powyższych badaniach odporności na pękanie opartych na nanowgłębieniach, długość powstałych w ten sposób pęknięć została zmierzona przez obserwatora, a do obliczenia odporności na pękanie użyto półempirycznego modelu. Metody te są jednak niepowtarzalne, subiektywne, a wyniki w dużym stopniu zależą od umiejętności obserwatora ze względu na konieczność zmierzenia długości pęknięć za pomocą mikroskopii optycznej lub skaningowej mikroskopii elektronowej. Co więcej, testy zarysowania zostały przeprowadzone w skali nano, ale podstawowy model matematyczny nie jest oparty na fizyce, ponieważ nie uwzględnia zmniejszenia wytrzymałości z powodu pęknięć i defektów11. W związku z tym istnieje luka w wiedzy: metoda oceny złamań na poziomie mikroskopowym oparta na modelu mechanistycznym opartym na fizyce. Ta luka w wiedzy zmotywowała do zastosowania testów mikrozarysowań do zagęszczenia kości, skupiając się najpierw na próbkach świń5. Badanie zostało teraz rozszerzone, aby zrozumieć kość korową bydła.
Możliwe są dwie różne orientacje próbek: podłużna poprzeczna i krótka podłużna. Podłużne poprzeczne odpowiada właściwościom złamania prostopadłym do osi podłużnej kości udowej. Natomiast krótkie podłużne odpowiada właściwościom złamania wzdłuż osi podłużnej kości udowej5. W tym badaniu stosujemy test zarysowania na kościach korowych bydła, aby scharakteryzować odporność kości na złamania w krótkim kierunku wzdłużnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Opisany tutaj protokół jest zgodny z wytycznymi Illinois Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Pobieranie próbek
- Zbierz świeżo zebrane kości udowe bydła z rzeźni certyfikowanej przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) i transportuj je w plastikowych, hermetycznych workach w chłodziarce.
UWAGA: Na potrzeby przeprowadzonego tutaj badania kości udowe pobrano od zwierząt w wieku 24-30 miesięcy, karmionych kukurydzą i ważących około 1,000 - 1,100 funtów. - Zamrozić kości udowe w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia procedury przygotowania próbki. Ta temperatura sprawia, że kości udowe są świeże12,13,14.
2. Cięcie, czyszczenie i osadzanie próbek
- Zamrożone kości udowe rozmrażać w pojemniku z wodą przez około 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wytnij wiele krążków o grubości około 10 - 15 mm od środkowej części trzonu za pomocą diamentowej piły taśmowej do blatu, aby uzyskać próbki o jednolitym polu przekroju kości korowej.
- Użyj zestawu do preparowania, aby usunąć wszelkie tkanki miękkie lub mięso przyczepione do kości korowej.
- Przeciąć przekroje kości udowych uzyskane w kroku 2.2 za pomocą diamentowego ostrza do płytek na pilarce o niskiej prędkości w wilgotnych warunkach wzdłuż osi podłużnej kości, aby uzyskać wiele mniej więcej prostopadłościennych przekrojów.
UWAGA: W tym miejscu omówiono tylko przygotowanie próbek i próby zarysowania wykonywane na krótkich – podłużnych próbkach. Jednak z wyjątkiem kierunku cięcia, procedura przygotowania pozostaje taka sama dla orientacji poprzecznej. - Próbki należy czyścić w roztworze przygotowanym przy użyciu 1,5% anionowego środka czyszczącego i 5% wybielacza przez 20 minut w myjce ultradźwiękowej.
- Osadź próbki kości korowych w żywicy akrylowej (w tym przypadku polimetakrylanu metylu (PMMA)) dla łatwości obsługi i stabilności.
- Aby osadzić próbki, najpierw pokryj ścianki formy środkiem antyadhezyjnym. Następnie wymieszaj żywicę akrylową i utwardzacz w zlewce, zgodnie z instrukcją podaną przez producenta PMMA.
- Umieść jeden z wyciętych próbek kości korowej w każdej formie tak, aby powierzchnia, która ma być zarysowana, była skierowana w dół. Wlej mieszankę żywicy akrylowej do przygotowanych uchwytów na próbki. Pozwól próbkom utwardzić się przez okres do 4 - 5 godzin.
- Pociąć osadzone próbki na krążki o grubości 5 mm, odsłaniając powierzchnię do zarysowania, za pomocą piły wolnoobrotowej i zamontować próbki na metalowych (aluminiowych) krążkach o średnicy 34 mm i wysokości 5 mm za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
- Zawiń próbki w miernik nasączony zrównoważonym roztworem soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) i wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C do dalszego użycia15,16.
3. Protokoły szlifowania i polerowania
UWAGA: Warunkiem koniecznym do przeprowadzenia bardzo precyzyjnych testów w małych skalach jest gładka i wyrównana powierzchnia próbek. Poprzednie protokoły polerowania13,17 powodowały dużą chropowatość powierzchni, co prowadziło do znacznych niedokładności pomiaru. Wyzwanie polega na osiągnięciu niskiej średniej chropowatości powierzchni, poniżej 100 nm, na dużej powierzchni 3 x 8 mm2
.- Próbki kości korowych bydła należy zmielić w temperaturze pokojowej za pomocą papierów z węglika krzemu o ziarnistości 400 i 600 odpowiednio przez 1 minutę i 5 minut. Utrzymuj szlifierko-polerkę na podstawowych prędkościach odpowiednio 100 obr./min i 150 obr./min.
- Próbki kości kory mózgowej bydła należy mielić maszynowo w temperaturze pokojowej na papierach o ziarnistości 800 i 1200 przez 15 minut na każdym etapie. Utrzymuj szlifierko-polerkę na prędkości podstawowej 150 obr./min, prędkości głowicy 60 obr./min i obciążeniu roboczym 1 funta.
- Wypolerować próbki przy użyciu roztworów zawiesiny diamentowej o sile 3 μm, 1 μm i 0,25 μm w tej samej kolejności na twardej, perforowanej włókninie przez czas 90 minut każda w temperaturze pokojowej. Utrzymuj obciążenie robocze dla każdego kroku na poziomie 1 funta przy prędkościach podstawy i głowicy polerki odpowiednio 300 obr./min i 60 obr./min.
- Wypolerować próbkę przy użyciu roztworu zawiesiny tlenku glinu o stężeniu 0,05 μm na miękkiej, syntetycznej tkaninie ze sztucznego jedwabiu przez 90 minut przy 1 funcie przy prędkości podstawy i głowicy odpowiednio 100 obr./min i 60 obr./min, również w temperaturze pokojowej.
- Umieść próbki w zlewce z wodą dejonizowaną i umieść zlewkę w kąpieli ultradźwiękowej na 2 minuty pomiędzy każdym kolejnym etapem mielenia i polerowania, aby oczyścić pozostałości i uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Wyświetlanie cech powierzchni za pomocą mikroskopii optycznej i obrazowania SEM.
UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 1, na próbkach kości kory bydła zaobserwowano osteony, kanały Haversa, linie cementowe, obszary śródmiąższowe i luki. Te metody obrazowania ujawniają porowatą, niejednorodną i anizotropową naturę próbek kości korowych. Dodatkowo przeprowadzono zaawansowane badania powierzchni próbek w celu oceny jakości polerowanej powierzchni. Reprezentatywna wypolerowana powierzchnia jest pokazana na Rysunek 2.
4. Test mikrozarysowania
UWAGA: Testy mikrozarysowań są wykonywane na wypolerowanych próbkach kości korowej bydła za pomocą testera mikro zarysowań (Rysunek 3). Do badania używany jest diamentowy wgłębnik Rockwella o promieniu końcówki 200 μm i kącie wierzchołka 120°. Przyrząd umożliwia zastosowanie liniowego obciążenia progresywnego do 30 N. Ponadto instrument jest wyposażony w czujniki o wysokiej dokładności do pomiaru obciążenia poziomego, głębokości penetracji i emisji akustycznych generowanych w wyniku zarysowania. Instrument może rejestrować panoramy rowków scratch.
- Przed przystąpieniem do badania próbek kości korowych należy skalibrować końcówkę wgłębnika Rockwella, używając poliwęglanu jako materiału referencyjnego3.
- Umieść próbkę kości korowej na stoliku i wybierz miejsce testu zarysowania za pomocą mikroskopu optycznego zintegrowanego z modułem testera mikrozarysowań.
- Zastosować liniowe obciążenie progresywne z obciążeniem początkowym 30 mN i obciążeniem końcowym 30 N. Szybkość załadunku powinna być ustawiona na 60 N/min, a długość zarysowania na 3 mm.
- Wykonaj serię testów zarysowania na krótkich podłużnych (Rysunek 3b) próbkach kości korowej bydła, jak pokazano w Rysunek 3.
- Zwilż powierzchnię próbki HBSS po zestawie co trzy do czterech testów zarysowania, aby utrzymać je nawodnione.
- Przeanalizuj dane z testu zarysowania w oparciu o modelowanie nieliniowej mechaniki pękania2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do pomiaru chropowatości polerowanej powierzchni wykorzystano mikroskopię sił atomowych. Przyjmuje się, że próbka jest uznawana za dobrze wypolerowaną, jeśli chropowatość powierzchni jest o rząd wielkości mniejsza niż analizowane cechy powierzchni. W tym przypadku zmierzona chropowatość powierzchni wynosząca 60 nm na obszarze 40 µm x 40 µm wyraźnie spełnia to kryterium.
Rysunek 4 przedstawia wykresy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Testy mikrozarysowań wywołują pęknięcie w trybie mieszanym3. Co więcej, w krótkich podłużnych próbkach kory mózgowej bydła procesy pękania są aktywowane, gdy sonda zagłębia się w siebie. W przypadku rysy o długości 3 mm sondowana objętość pryzmatyczna ma około 3 600 μm długości, 600 μm szerokości i 480 μm głębokości. Ta duża objętość pomogła w przewidywaniu homogenizowanej odpowiedzi. Model nieliniowej mechaniki pękania umożliwił nam wyodrębnienie nośności na pękanie w oparciu o obliczenia całki <...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Departament Inżynierii Lądowej i Środowiska oraz College of Engineering na Uniwersytecie Illinois w Urbana Champaign. Dziękujemy stypendium Ravindra Kinra i Kavita Kinra za wspieranie studiów podyplomowych Kavyi Mendu. Badania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej przeprowadzono w obiektach Laboratorium Badań Materiałowych im. Fredericka Seitza oraz Instytutu Beckmana na Uniwersytecie Illinois w Urbana Champaign.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Diamentowa piła taśmowa stołowa McMaster | Carr, Elmhurst, IL | Model C-40 | Prędkość ostrza 40 mil na godzinę; Wymiary ostrza: 37 cali średnicy, 0,02 cala szerokości i 0,14 cala głębokości |
| Buehler Isomet 5000 Precyzyjny nóż | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 112780 | Prędkość ostrza w zakresie 200-5000 obr./min w przyrostach co 50 obr./min; 8-calowe diamentowe ostrze waflowe |
| Branson 5800 Ultradźwiękowy środek czyszczący | (przez) Grainger, Peoria, Illinois | 39J365 | Bransonic CPXH ma pojemność zbiornika 2,5 galona |
| Szlifierka Buehler Ecomet 250 - Polerka | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 497250 | 8-calowa płyta podstawy o zakresie prędkości od 10-500 obr./min |
| Anton Paar, CSM Instruments Tester zarysowań mikro | Paar Szwajcaria AG | 163251 | Kompaktowa platforma, czujnik emisji Acoutstic |
| Skaningowy mikroskop elektronowy ogólnego przeznaczenia JEOL 6060LV | JEOL USA, Inc., Peabody, MA | Środowiskowy skaningowy mikroskop elektronowy, który umożliwia obrazowanie przy niskich poziomach próżni. | |
| Philips XL30 ESEM FEG | FEI Company | Praca w trybie mokrym urządzenia umożliwia obrazowanie próbek nieprzewodzących bez ich zmiany | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| Kość udowa bydlęca | L& M Rzeźnia, Georgetown, IL | Karmione kukurydzą, 24-30 miesięczne dojrzałe okazy bydła. | |
| Precyzyjny środek czyszczący w proszku | Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603 | 1104-1 | Biodegradowalny, nieżrący, wolny od zakłóceń |
| odlew z tworzywa akrylowego | Mikroskopia elektronowa Sciences | 24210-02 | Polimetakrylan metylu |
| CarbiMet SiC Papier ścierny o ziarnistości 400, 8 cali, z podkładem PSA | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080400 | Szlifowanie - ścierne Papiery |
| ścierne CarbiMet SiC o ziarnistości 600, 8 cali, z podkładem PSA | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080600 | Szlifowanie - Papiery ścierne |
| Tarcze MicroCut o ziarnistości 800, 8 cali, z podkładem PSA | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080800 | Szlifowanie - Papiery ścierne |
| Tarcze MicroCut o ziarnistości 800, 8 cali, z podkładem PSA | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 16081200 Szlifowanie - Bibuły ścierne | |
| Texmet P Do 8-calowego koła PSA | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 407638 Ściereczka do polerowania | |
| 8-calowa mikrościereczka PSA | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 407518 | Ściereczka do polerowania |
| Meta Di Supreme Zawieszenie z polikrystalicznego diamentu, 3 &mikro; m | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406631 | Zawieszenie do polerowania |
| Meta Di Supreme Zawieszenie z polikrystalicznego diamentu, 1 i mikro; m | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406630 | Zawieszenie polerskie |
| Meta Di Supreme Zawieszenie z polikrystalicznego diamentu, 0,25 i mikro; m | Buehler, 41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406629 | Zawieszenie do polerowania |
| Zawieszenie do polerowania MasterPrep, 0,05 i mikro; m | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 40-6377-032 | Zawiesina polerska |
| HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific | 14025126 | Roztwór buforowy |
Bibliografia
- Akono, A., Reis, P., Ulm, F. Scratching as a fracture process: From butter to steel. Phys Rev Lett. 106 (20), 204302-204304 (2011).
- Akono, A. T., Randall, N. X., Ulm, F. J. Experimental determination of the fracture toughness via microscratch tests: application to polymers, ceramics, and metals. J of Mat Res. 27 (02), 485-493 (2012).
- Akono, A. T., Ulm, F. J. An improved technique for characterizing the fracture toughness via scratch test experiments. Wear. 313 (1-2), (2014).
- Akono, A. T. Energetic size effect law at the microscopic scale: Application to progressive-load scratch testing. J of Nanomech and Micromech. 6 (2), (2016).
- Kataruka, A., Mendu, K., Okeoghene, O., Puthuvelil, J., Akono, A. -T. Microscopic assessment of bone toughness using scratch tests. Bone Reports. 6, 17-25 (2017).
- Melvin, J. W., Evans, F. G. Crack propagation in bone. ASME Biomech Symp. , New York. (1973).
- Norman, T. L., Vashishth, D., Burr, D. B. Effect of groove on bone fracture toughness. J of Biomech. 25 (12), 1489-1492 (1992).
- Behiri, J. C., Bonfield, W. Crack velocity dependence of longitudinal fracture in bone. J of Mat Sc. 15 (7), 1841-1849 (1980).
- Mullins, L. P., Bruzzi, M. S., McHugh, P. E. Measurement of the microstructural fracture toughness of cortical bone using indentation fracture. J of Biomech. 40 (14), 3285-3288 (2007).
- Harding, D. S., Oliver, W. C., Pharr, G. M. Cracking during nanoindentation and its use in the measurement of fracture toughness. MRS Proceedings. 356, Cambridge University Press. 663-668 (1994).
- Islam, A., Dong, X. N., Wang, X. Mechanistic modeling of a nanoscratch test for determination of in situ toughness of bone. J of the Mech Bhvr of Biomed Mat. 5 (1), 156-164 (2012).
- McAlden, R. W., McGeogh, J. A., Barker, M. B., Court-Brown, C. M. Age-related changes in the tensile properties of cortical bone: the relative importance of changes in porosity, mineralization and microstructure. J. Bone Joint Surg. 75, 1193-1205 (1993).
- Zioupos, P., Gresle, M., Winwood, K. Fatigue strength of human cortical bone: age, physical, and material heterogeneity effects. J of Biomed Mat Res Part A. 86 (3), 627-636 (2008).
- Linde, F., Sørensen, H. C. F. The effect of different storage methods on the mechanical properties of trabecular bone. J of Biomech. 26 (10), 1249-1252 (1993).
- Zioupos, P. Accumulation of in-vivo fatigue microdamage and its relation to biomechanical properties in ageing human cortical bone. J of Microscopy. 201 (2), 270-278 (2001).
- Yan, J., Clifton, K. B., Mecholsky, J. J., Reep, R. L. Fracture toughness of manatee rib and bovine femur using a chevron-notched beam test. J of Biomech. 39 (6), 1066-1074 (2006).
- Xu, J., Rho, J. Y., Mishra, S. R., Fan, Z. Atomic force microscopy and nanoindentation characterization of human lamellar bone prepared by microtome sectioning and mechanical polishing technique. J of Biomed Mat ResPart A. 67 (3), 719-726 (2003).
- Yan, J., Mecholsky, J. J., Clifton, K. B. How tough is bone? Application of elastic–plastic fracture mechanics to bone. Bone. 40 (2), 479-484 (2007).
- Ritchie, R. O. The conflicts between strength and toughness. Nat Mater. 10 (11), 817-822 (2011).
- Kim, K. T., Bažant, Z. P., Yu, Q. Non-uniqueness of cohesive-crack stress-separation law of human and bovine bones and remedy by size effect tests. Intrnl J of Frac. 181 (1), 67-81 (2013).
- Bazant, Z. P., Planas, J. Fracture and size effect in concrete and other quasibrittle materials. 16, CRC press. (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
