Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka rusztowań z włókien modyfikowanych przez Griffithsin w celu zapobiegania infekcjom przenoszonym drogą płciową

DOI:

10.3791/56492

⸱

31 października 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje procedurę wytwarzania i charakteryzowania włókien elektroprzędzonych z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) modyfikowanych przez Griffithsin, które wykazują silne działanie adhezyjne i przeciwwirusowe przeciwko zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 in vitro. Opisano metody stosowane do syntezy, modyfikacji powierzchni i charakterystyki wynikowej morfologii, koniugacji i desorpcji Griffithsiny z włókien modyfikowanych powierzchniowo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włókna elektroprzędzione (EF) były szeroko stosowane w różnych zastosowaniach terapeutycznych; jednak dopiero niedawno zostały zastosowane jako technologia do zapobiegania i leczenia infekcji przenoszonych drogą płciową (STI). Co więcej, wiele technologii EF koncentruje się na kapsułkowaniu substancji czynnej, w porównaniu z wykorzystaniem powierzchni do nadania biofunkcjonalności. Tutaj opisujemy metodę wytwarzania i modyfikowania powierzchni włókien elektroprzędzonych z kwasu poli(mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) za pomocą silnej przeciwwirusowej lektyny Griffithsin (GRFT). PLGA to polimer zatwierdzony przez FDA, który jest szeroko stosowany w dostarczaniu leków ze względu na swoje wyjątkowe właściwości chemiczne i biokompatybilne. GRFT jest naturalną, silną i bezpieczną lektyną, która ma szerokie działanie przeciwko wielu wirusom, w tym ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Po połączeniu, włókna modyfikowane GRFT wykazały silną inaktywację HIV-1 in vitro. Niniejszy manuskrypt opisuje metody wytwarzania i charakteryzowania EF modyfikowanych przez GRFT. Po pierwsze, PLGA jest elektroprzędzona w celu stworzenia rusztowania światłowodowego. Włókna są następnie modyfikowane powierzchniowo za pomocą GRFT przy użyciu chemii 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS). Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) została wykorzystana do oceny wielkości i morfologii preparatów modyfikowanych powierzchniowo. Dodatkowo, ELISA na bazie gp120 lub hemaglutyniny (HA) może być użyty do ilościowego określenia ilości sprzężonego GRFT, a także desorpcji GRFT z powierzchni włókna. Protokół ten może być szerzej stosowany do wytwarzania włókien, które są modyfikowane powierzchniowo za pomocą różnych białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie EFs jako platformy do miejscowego dostarczania ma potencjał do znacznego zmniejszenia liczby chorób przenoszonych drogą płciową. Obecnie ponad 36 milionów osób żyje z wirusem HIV, z ponad dwoma milionami nowych przypadków zgłoszonych w samym tylko 2015 roku1,2. Dodatkowo, zakażenie wirusem opryszczki pospolitej typu 2 (HSV-2) dotyka setki milionów ludzi na całym świecie i wykazano, że zwiększa nabycie wirusa HIV o 2 - 5 razy3. Ze względu na związek między zakażeniem HSV-2 a nabyciem wirusa HIV istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem nowych substancji czynnych, które zapewniają jednoczesną ochronę przed wieloma chorobami przenoszonymi drogą płciową. Co więcej, opracowanie nowych nośników w celu poprawy dostarczania tych środków przeciwwirusowych daje możliwość dalszego zwiększenia siły ochronnej i terapeutycznej. Aby osiągnąć ten cel, EF zostały zbadane jako nowa platforma dostarczania w celu zmniejszenia częstości występowania zakażeń HIV-1 i HSV-2.

W ciągu ostatnich dwóch dekad EF były szeroko stosowane w dziedzinach dostarczania leków i inżynierii tkankowej4. Często biokompatybilne polimery są wybierane tak, aby łatwo przekładały się na zastosowania terapeutyczne. Aby wytworzyć polimerowe EF, wybrany polimer rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym lub roztworze wodnym, w zależności od stopnia hydrofobowości polimeru5. Interesujące czynniki czynne są następnie dodawane do rozpuszczalnika lub roztworu wodnego przed procesem elektroprzędzenia. Roztwór polimeru jest następnie zasysany do strzykawki i powoli wyrzucany, będąc pod wpływem prądu elektrycznego. W wyniku tego procesu zazwyczaj powstają włókna polimerowe o makrostrukturach arkuszowych lub cylindrycznych (Rysunek 1) i średnicach włókien w zakresie od mikro- do nanoskali6. W przypadku większości zastosowań terapeutycznych substancje czynne są włączane do włókien podczas procesu elektroprzędzenia i są uwalniane z włókna poprzez dyfuzję, a następnie degradację włókien. Szybkość degradacji lub uwalniania może być zmieniana poprzez stosowanie różnych typów polimerów lub mieszanek polimerów w celu ustalenia pożądanego profilu uwalniania, nadając unikalne właściwości chemiczne i fizyczne7 i promując enkapsulację praktycznie każdego związku. W związku z tym EF okazały się korzystne w dostarczaniu leków małocząsteczkowych i czynników biologicznych, w tym białek, peptydów, oligonukleotydów i czynników wzrostu6,8,9.

W dziedzinie zapobiegania chorobom przenoszonym drogą płciową, EF były ostatnio używane do włączania i dostarczania trwałego lub indukowalnego uwalniania środków przeciwwirusowych10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. W jednym z najwcześniejszych badań opracowano włókna reagujące na pH, aby uwalniać substancje czynne w odpowiedzi na zmiany środowiskowe w żeńskim układzie rozrodczym (FRT), jako metoda ochrony na żądanie przed HIV-111. Od tego czasu w innych badaniach analizowano mieszanki polimerowe składające się z tlenku etylenu (PEO) i kwasu poli-L-mlekowego (PLLA), aby ocenić regulowane uwalnianie środków przeciwwirusowych i antykoncepcyjnych w celu zapobiegania HIV-1 i antykoncepcji in vitro12. Dodatkowe badania wykazały wykonalność EF w celu zapewnienia: przedłużonego uwalniania małocząsteczkowych leków przeciwwirusowych14, silnych i elastycznych właściwości mechanicznych20, architektury dostarczania 3-D21, hamowanie penetracji plemników12, oraz zdolność do łączenia się z innymi technologiami dostarczania13. Wreszcie, wcześniejsze prace oceniały włókna polimerowe pod kątem ciągłego dostarczania środków przeciwwirusowych przeciwko powszechnym wirusom współinfekującym, HSV-2 i HIV-114. W tym badaniu włókna polimerowe zapewniały aktywność komplementarną do dostarczania przeciwwirusowego, zachowując swoją strukturę przez okres do 1 miesiąca i zapewniając fizyczną barierę dla wnikania wirusa. Na podstawie tych wyników zaobserwowano, że EF mogą być stosowane zarówno do fizycznego, jak i chemicznego hamowania infekcji wirusowej.

Podczas gdy regulowane właściwości uwalniania sprawiają, że polimerowe EF są atrakcyjną platformą dostarczania mikrobicydów, EF zostały opracowane w innych zastosowaniach, aby służyć jako rusztowania modyfikowane powierzchniowo7. EF zostały użyte do naśladowania morfologii macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), często działając jako rusztowania poprawiające regenerację komórkową22 i zwiększające ich użyteczność w inżynierii tkankowej23,24. Włókna składające się z polimerów, takich jak poli-ε-kaprolakton (PCL) i PLLA, zostały zmodyfikowane powierzchniowo czynnikami wzrostu i białkami po elektroprzędzeniu, aby nadać właściwości podobne do ECM, w tym zwiększoną adhezję komórkową i proliferację25,26. Ponadto oceniono przeciwdrobnoustrojowe EF modyfikowane powierzchniowo, aby zapobiec rozwojowi określonych bakterii chorobotwórczych27,28. Ze względu na tę wszechstronność i zdolność do wywoływania efektów biologicznych, technologia EF nadal rozwija się w różnych dziedzinach, aby zapewnić wielomechaniczną funkcjonalność. Jednak pomimo ich użyteczności w różnych zastosowaniach, włókna modyfikowane powierzchniowo dopiero niedawno zostały zbadane w dziedzinie mikrobicydów29.

Równolegle z rozwojem nowych technologii zapobiegania i leczenia chorób przenoszonych drogą płciową, opracowano nowe biologiczne terapie. Jednym z najbardziej obiecujących kandydatów na środki bakteriobójcze jest adhezyjna lektyna przeciwwirusowa, GRFT30. Pierwotnie pochodząca z gatunku krasnorostów, GRFT wykazała aktywność jako silny inhibitor wirusa HIV, HSV-2, SARS, a także wirusa zapalenia wątroby typu C31,32,33,34,35,36. W rzeczywistości, wśród biologicznie nastawionych inhibitorów, GRFT ma najsilniejsze działanie anty-HIV, inaktywując HIV-1 niemal natychmiast po kontakcie30, zachowując stabilność i aktywność w obecności pożywek hodowlanych z drobnoustrojów pochwy przez okres do 10 dni37. Niedawno wykazano, że 0,1% żel GRFT chroni myszy przed dopochwowym prowokacją HSV-2, co czyni go obiecującym kandydatem na pierwszą linię ochrony zarówno przed HSV-2, jak i HIV-132,38. W szczególności w przypadku wirusa HIV, GRFT hamuje infekcję poprzez fizyczne wiązanie reszt glikanów związanych z gp120 lub terminalną mannozą N na powierzchniach otoczki wirusa, aby zapobiec przedostawaniu się38,39,40,41,42. To hamowanie jest bardzo silne, a IC50s zbliża się do 3 ng / mL43. Oprócz hamowania zakażenia wirusem HIV, badania wykazały również, że GRFT chroni przed zakażeniem HSV-2 poprzez hamowanie rozprzestrzeniania się wirusa z komórki na komórkę32. We wszystkich przypadkach wykazano, że GRFT jest adhezyjny do cząstek wirusa, wykazując jednocześnie wysoką odporność na denaturację. Wreszcie, GRFT wykazał synergistyczne działanie z kombinacjami tenofowiru (TFV) i innych leków przeciwwirusowych44, dzięki czemu jest wykonalne i prawdopodobnie korzystne do jednoczesnego stosowania z EFs. Silne właściwości GRFT sprawiają, że jest to doskonały kandydat na lek przeciwwirusowy na bazie biologicznej, w którym dostarczanie może być wzmocnione za pomocą technologii EF.

Wykorzystując tę wiedzę o adhezyjnych i wrodzonych właściwościach przeciwwirusowych GRFT, zaprojektowano rusztowanie z włókien polimerowych, które integruje te właściwości, aby zapewnić pierwszą warstwę hamowania wnikania wirusa29. Szukając inspiracji w sposobie, w jaki śluz szyjkowo-pochwowy utrudnia transport wirusa głównie poprzez interakcje mukoadhezyjne mucyny, postawiliśmy hipotezę, że używając EF jako rusztowania i kowalencyjnie modyfikując powierzchnię za pomocą GRFT, wysoka gęstość GRFT sprzężonego z powierzchnią osłabiłaby i dezaktywowała wirusa w jego punkcie wejścia45,46,47. W tym przypadku EF zostały opracowane jako stacjonarne rusztowanie, aby zapewnić opartą na białku, wirusową platformę barierową inaktywującą adhezję. Staraliśmy się połączyć silne właściwości przeciwwirusowe GRFT z biokompatybilną, modyfikowalną i trwałą platformą polimerową, aby stworzyć nową "pułapkę" na wirusa.

Aby osiągnąć te cele, włókna składające się z PLGA były elektroprzędzone, a chemia EDC-NHS została użyta do późniejszej modyfikacji powierzchni EF za pomocą GRFT. PLGA służył jako polimer modelowy ze względu na jego szerokie zastosowanie w electrospinningu48, w połączeniu z jego biokompatybilnością i opłacalnością. Dodatkowo, modyfikacja powierzchni wykorzystuje dużą powierzchnię EF i stanowi użyteczną alternatywę, którą można połączyć z enkapsulacją, aby zmaksymalizować użyteczność światłowodu49. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod enkapsulacji, w których dostępna jest tylko część GRFT (i tylko przejściowo obecna w FRT), modyfikacja powierzchni może umożliwić GRFT utrzymanie maksymalnej bioaktywności przez cały czas trwania leczenia. Co więcej, włączenie związków hydrofilowych, takich jak białka, tradycyjnymi metodami elektroprzędzenia, może skutkować niższą wydajnością enkapsulacji i utratą aktywności białek50. W związku z tym włókna modyfikowane powierzchniowo GRFT mogą stanowić obiecującą alternatywną metodę dostarczania, która może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z elektroprzędzeniem w celu zwiększenia ochrony przed infekcją przenoszoną drogą płciową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i produkcja rusztowania z włókien elektroprzędzonych

UWAGA: Wszystkie prace z rozpuszczalnikami lub roztworami polimerów powinny być wykonywane w dygestoriach chemicznych. Przed rozpoczęciem protokołu należy zapoznać się z kartą charakterystyki każdego odczynnika.

  1. Aby elektrowirować 3 ml 15% w/w roztworu polimeru PLGA, odważ 720 mg 50:50 poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA; 0,55 do 0,75 dL/g, 31-57 kDa) do 10 ml fiolki scyntylacyjnej. Objętość roztworu jest oparta na typowej wielkości partii stosowanej w bieżących badaniach.
    UWAGA: Masę polimeru, którą należy dodać do danej objętości rozpuszczalnika, należy obliczyć, określając najpierw gęstość rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia polimeru. Gęstość rozpuszczalnika Heksafluoro-2-propanol (HFIP) wynosi 1,59 g/ml. Zatem masa rozpuszczalnika, w oparciu o potrzebną objętość 3,0 ml HFIP, wynosi 4,8 g (3,0 ml x 1,59 g/ml). W przypadku 15% w/w frakcji PLGA do HFIP, 720 mg PLGA należy dodać do 3,0 ml HFIP (0,15 x 4,800 mg = 720 mg). Zaletą stosowania polimeru/roztworu % w/w, a nie % w/v, jest to, że zapewnia to określoną masę roztworu końcowego. Ta zdefiniowana masa umożliwia dokładniejszą wymianę rozpuszczalnika w przypadku odparowania rozpuszczalnika na etapie 1.3.
  2. Dodać 3,0 ml HFIP do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej PLGA (z kroku 1.1) za pomocą szklanej pipety serologicznej. Przykryć fiolkę folią z tworzywa sztucznego, a następnie zmierzyć i zanotować masę fiolki.
  3. Zawiesinę polimerową inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru. Jeśli jakikolwiek rozpuszczalnik odparuje, zmniejszając masę fiolki, należy dodawać HFIP do momentu, aż fiolka osiągnie swoją pierwotną masę w kroku 1.2.
  4. Po inkubacji przygotuj aparat do elektroprzędzenia (Rysunek 2A). Chociaż można użyć trzpienia o dowolnym rozmiarze, tutaj jako kolektor zastosowano obrotowy trzpień ze stali nierdzewnej o średnicy zewnętrznej 25 mm.
    UWAGA: Większa średnica trzpienia zmniejszy grubość włókna, przy tej samej objętości roztworu do elektroprzędzenia.
  5. Odessać roztwór polimeru do strzykawki o pojemności 3 ml.
  6. Podłącz końcówkę igły o rozmiarze 18 i średnicy 1/2 cala do strzykawki i dozuj nadmiar roztworu (zwykle 0,25 ml), aby usunąć pustą przestrzeń w końcówce igły.
  7. Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu instrumentu na 2,0 ml/h,
    UWAGA: To natężenie przepływu zostało wcześniej zoptymalizowane w oparciu o lepkość polimeru dla tego preparatu.
  8. Podłącz źródło zasilania do igły strzykawki i elektrowiruj roztwór polimeru pod napięciem +27 kV. Odległość między igłą a kolektorem powinna być ustawiona na około 25 cm (Rysunek 2B).
    UWAGA: W procesie elektroprzędzenia powstaje para rozpuszczalnika. Użyj dygestoria lub zamkniętego urządzenia (Rysunek 2), aby usunąć szkodliwą parę.
  9. Gdy cały roztwór zostanie elektrowirowany, wyłącz źródło zasilania i pozwól trzpieniu wirować przez dodatkowe 30 minut, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik.
  10. Wyłącz obracający się kolektor trzpienia i użyj żyletki, aby odciąć włókno z trzpienia. Użyj ostrza, aby delikatnie oderwać włókno od trzpienia.
  11. Zbierz elektroprzędzone włókno PLGA na oznakowaną szalkę Petriego i umieść na noc w eksykatorze, aby usunąć resztki rozpuszczalnika.

2. Modyfikacja powierzchni włókien za pomocą GRFT

  1. Przygotować roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (bufor MES). Przygotować PBS, rozpuszczając 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 1 l ultraczystej wody. Podobnie, rozpuść 19,52 g MES (wolny kwas, MW 195,2) i 29,22 g NaCl w 1 l ultraczystej wody, aby przygotować bufor MES. Upewnij się, że końcowe pH każdego roztworu wynosi odpowiednio 7,2 - 7,5 i 5,0 - 6,0 - 6,0 za pomocą pH-metru.
  2. Przygotuj indywidualne roztwory robocze EDC (2 mM) i NHS (5 mM).
    1. Wyjmij EDC i NHS z zamrażarki i pozwól im zrównoważyć się do temperatury pokojowej przed ważeniem.
    2. Odważyć 4 mg EDC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    3. Odważyć 6 mg NHS do innej probówki do mikrowirówki.
    4. Dodać 1 ml buforu MES do każdej probówki. Energicznie wymieszaj obie probówki, aby upewnić się, że odczynniki są całkowicie rozpuszczone.
  3. Przygotować roztwór hydroksyloaminy, ważąc 70 mg w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
  4. Dodaj 20 ml PBS do hydroksyloaminy i wiruj do rozpuszczenia.
  5. Zmasuj odpowiednią ilość włókna PLGA w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Zazwyczaj do każdej partii reakcyjnej stosuje się 75 mg błonnika.
  6. Dodać 8 ml buforu MES do probówki o pojemności 15 ml.
  7. Dodać do probówki po 1 ml każdego z przygotowanych wcześniej roztworów EDC i NHS. Ostateczna objętość roztworu powinna wynosić 10 ml. Końcowe stężenia EDC i NHS powinny wynosić odpowiednio 0,4 mg/ml i 0,6 mg/ml.
  8. Zamknij i uszczelnij probówkę o pojemności 15 ml folią z tworzywa sztucznego i umieść ją na rotatorze, aby umożliwić delikatne odwrócenie roztworu przez 15 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 3B). Ten krok aktywuje grupy karboksylowe na polimerze, aby umożliwić kowalencyjną modyfikację białkiem GRFT (Rysunek 3A).
  9. Po aktywacji ostrożnie wygasić reakcję, dodając do probówki 14 μl β-merkaptoetanolu. Odwróć probówkę kilka razy, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    UWAGA: β-merkaptoetanol jest wysoce toksyczny i powinien być stosowany wyłącznie w wyciągach chemicznych.
  10. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przepłukać włókno PLGA 10 ml PBS, aby usunąć resztki β-merkaptoetanolu.
  11. Po wypłukaniu dodaj odpowiednią ilość roztworu podstawowego GRFT do probówki. Na przykład błonnik o stężeniu 5 nmol GRFT / mg wymagałby 6,35 μl roztworu podstawowego GRFT (z 10 mg / ml) na mg błonnika. Tak więc próbka błonnika o stężeniu 75 mg wymagałaby 476,25 μl roztworu podstawowego GRFT o stężeniu 10 mg/mL.
    UWAGA: Wyprodukowano włókna GRFT o teoretycznych obciążeniach 0,05, 0,5 i 5 nmol GRFT na mg włókna.
  12. Dodaj tyle PBS, aby doprowadzić końcową objętość do 8 ml, zamknij i odwróć probówkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  13. Uszczelnij rurkę folią z tworzywa sztucznego i ponownie umieść na wirniku, tym razem na 2 godziny.
  14. Po 2 godzinach inkubacji wygasić reakcję, dodając 2 ml roztworu hydroksyloaminy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zgodnie z instrukcjami producenta, końcowe stężenie hydroksyloaminy podczas reakcji hartowania powinno wynosić 0,7 mg/ml.
  15. Dobrze wymieszać roztwór i wyrzucić supernatant. Spłucz zmodyfikowane powierzchniowo włókno PLGA dwukrotnie 10 ml ultraczystej wody, aby usunąć wszelkie niesprzężone GRFT.
  16. Przenieś włókno na szalkę Petriego i umieść w eksykatorze, aż włókno całkowicie wyschnie. Przenieść szalkę Petriego do temperatury 4 °C w celu przechowywania.

3. Charakterystyka SEM włókien modyfikowanych powierzchniowo GRFT

  1. Umieść pasek dwustronnej taśmy węglowej na uchwycie próbki SEM. Oznacz dolną część mocowania próbki informacjami identyfikującymi próbkę za pomocą trwałego markera.
  2. Wytnij trzy próbki z jednego włókna o zmodyfikowanej powierzchni i umieść je na oddzielnych mocowaniach próbek. Grubość każdej próbki wynosi około 0,5 mm.
  3. Napylaj próbki za pomocą indukowanego elektronami osadzania cząstek ze złotej płytki. Napylanie przez 90 s, przy napięciu 2,4 kV.
    UWAGA: Czas napylania może się różnić w zależności od parametrów sprzętu, w tym voltage i amperage.
  4. Zobrazuj próbki pod napięciem 8 kV w powiększeniu od 1 000 do 5 000X.

4. Ekstrakcja GRFT z włókien modyfikowanych powierzchniowo

  1. Rozmasuj 2 mg błonnika w trzech egzemplarzach do 1,5 ml probówek do mikrowirówek.
  2. Dodaj 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do probówki, a następnie wiruj i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie rozpuścić błonnik.
  3. Po inkubacji rozcieńczyć 10 μl podwielokrotności roztworu włókna DMSO z kroku 4.2, co najmniej 100-krotnie w buforze Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).
  4. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu wczytania charakterystyki za pomocą testu ELISA.

5. Pomiar desorpcji GRFT z włókien

  1. Aby ocenić ilość GRFT uwolnionego lub zdesorbowanego z włókna, należy zważyć 5 - 10 mg włókna modyfikowanego powierzchniowo i umieścić w probówce do mikrowirówki. Zapisz masę włókna w każdej probówce.
  2. Do każdej próbki dodać 1 ml odpowiedniego roztworu, który naśladuje środowisko fizjologiczne (np. PBS, bufor TE, symulowany płyn pochwowy (SVF) itp.).
  3. Inkubować próbki przez 1 godzinę na wytrząsarce obracającej się przy 200 obr./min, 37 °C.
  4. Po inkubacji usunąć z fiolki około 1 ml buforu TE zawierającego zdesorbowany GRFT i przekazać do probówek zbiorczych. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu oznaczania ilościowego białka.
  5. Przenieść próbkę do nowej probówki do mikrowirówki, dodać 1 ml świeżego roztworu buforowego do włókna w probówce do mikrowirówki i inkubować do następnego punktu czasowego.
  6. Typowe punkty czasowe używane do pomiaru uwalniania to: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 godziny i 1 tydzień. W tych badaniach zaobserwowano znikomą desorpcję po 4 godzinach.

6. Kwantyfikacja ekstrakcji i desorpcji GRFT za pomocą testu ELISA

  1. Pokryj 96-dołkową płytkę ELISA 0,1 ml HA (10 μg/ml) na dołek, jak opisano wcześniej51. Uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (Rysunek 4).
  2. Usunąć bufor powlekający i dodać 0,3 ml buforu blokującego (2 - 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS z 0,05% polisorbatem 20) do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Po inkubacji przepłukać płytkę 3 razy 1x PBS z 0,1% polisorbatem 20 (PBS-P). Po wypłukaniu dozować 0,1 ml próbki, wzorca lub PBS jako kontrolę ujemną do odpowiednich studzienek. Ponownie inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Ponownie przepłukać płytkę 3 razy za pomocą PBS-P. Po wypłukaniu dodać 0,1 ml przeciwciała pierwszorzędowego (koziej surowicy anty-GRFT) do każdej studzienki i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała rozcieńcza się w stosunku 1:10 000 w PBS.
  5. Po inkubacji próbek z przeciwciałem pierwszorzędowym ponownie przepłukać płytki 3 razy PBS-P. Dodać 0,1 ml przeciwciała drugorzędowego (IgG królika sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór przeciwciała drugorzędowego rozcieńcza się w stosunku 1:10 000 w PBS.
  6. Umyj talerz 3 razy. Dodaj 0,1 ml substratu 2-peroksydazy TMB do każdego dołka. Monitoruj rozwój koloru (około 2 min), a następnie dodaj 0,1 ml H2SO4 (1 N), aby wygasić reakcję. Odczyt płytki przy długości fali 450 nm na czytniku płytek.
  7. Uśrednij wartości tła OD (studzienki, które otrzymują tylko PBS) i odejmij to od grup eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologia włókien ma znaczący wpływ na zdolność modyfikowanych powierzchniowo EF do zapewnienia ochrony przed wirusami. Chociaż elektroprzędzenie jest wygodną i nieskomplikowaną procedurą, niezoptymalizowane preparaty polimerowe mogą powodować nieregularną morfologię włókien (Rysunek 5B-C). Zmiany w warunkach elektroprzędzenia, które powodują powstawanie perełkowych lub amorficznych matowych morfologii, są często spowodowane niezgodnością rozpuszczaln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na swoją porowatą strukturę i dużą powierzchnię, EF znalazły wiele zastosowań w opiece zdrowotnej, a jednym z nich jest służenie jako terapeutyczne pojazdy dostawcze. Leki i inne substancje czynne mogą być włączane do EF w celu przestrajalnego dostarczania, podczas gdy leki biologiczne i ligandy chemiczne mogą być sprzężone z powierzchnią włókna w celu celowania specyficznego dla komórki52 lub biodetekcji53. W tym miejscu opisano wytwarzanie modyfikowanych powier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Funduszowi Dziedzictwa Żydowskiego za Doskonałość za sfinansowanie tych badań. Dziękujemy dr Stuartowi Williamsowi II za hojne udostępnienie systemu elektroprzędzalnego. Dziękujemy również dr Kennethowi Palmerowi za dostarczenie nam Griffithsina. Dodatkowo dziękujemy dr Nobuyuki Matoba i jego laboratorium za przeszkolenie nas w pracy GRFT ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli(laktyd-ko-glikolid) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 
igła dozująca 18g x 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Strzykawka Luer-lok końcówka VWR309657
Parafilm (folia plastikowa)Sigma AldrichP7793
Kwas 2-(N-Morfolino)etanosulfonowy (bufor MES)Sigma AldrichM3671 
Chlorek soduSigma AldrichS7653
Chlorek potasuSigma AldrichP9333
Fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichS7907
Fosforan potasu jednozasadowySigma AldrichP0662
Hydroksysukcynimid (NHS)Thermo Scientific 24500
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)Thermo Scientific 22980
2-merkaptoetanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAzamówienie, brak numeru produktu
Milipore Milipore317275
Monolaurynian glikolu polietylenowego sorbitanu (Polisorbat, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Płaskodenne immunoniesterylne płytki 96-dołkoweThermo Scientific 3355
Hemaglutynina grypy (HA)Kentucky BioprocessingNAwykonane na zamówienie, brak numeru produktu
Kozia anty-GRFT (przeciwciało pierwotne)Kentucky BioprocessingNAwykonane na zamówienie, brak numeru produktu
Królik anty-kozioł IgG-HRP (przeciwciało wtórne)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell PeroksydazaSubstrate KPL52-00-00
147541000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytwarzanie w kien metod elektroprz dzeniaelektroprz dzenie PLGAchemia modyfikacji powierzchniinaktywacja HIV 1 przez griffithsynanaliza za pomoc skaningowej mikroskopii elektronowejilo ciowe oznaczanie bia ek metod ELISAsprz ganie EDC NHScharakterystyka morfologii w kiendostarczanie lek w przeciwwirusowych

Powiązane artykuły