Artykuł metodologiczny

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

DOI:

10.3791/56493

⸱

25 września 2017

 , 
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest doskonałym modelowym systemem do badania glutaminergicznego przekaźnictwa synaptycznego. Opisano technikę ogniskowych zapisów makropatchowych prądów synaptycznych z wizualizowanych boutonów w larwalnym NMJ Drosophila. Technika ta wymaga zindywidualizowanego wykonania mikropipet rejestrujących, a także mikroskopu złożonego wyposażonego w duże powiększenie, obiektyw do zanurzania w wodzie na duże odległości, optykę z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC) i nasadkę fluorescencyjną. Elektroda rejestrująca jest umieszczona na szczycie wybranego boutonu synaptycznego wizualizowanego za pomocą optyki DIC, epi-fluorescencji lub obu. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala na monitorowanie aktywności synaptycznej ograniczonej liczby miejsc uwalniania. Elektroda rejestrująca ma średnicę kilku mikronów, a miejsca uwolnienia znajdujące się poza obrzeżem elektrody nie wpływają znacząco na rejestrowane prądy. Zarejestrowane prądy synaptyczne mają szybką kinetykę i mogą być łatwo rozdzielone. Zalety te są szczególnie ważne w badaniach zmutowanych linii muchowych o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila to doskonały system modelowy do badania mechanizmów molekularnych kontrolujących transmisję synaptyczną. Układ nerwowo-mięśniowy u Drosophila jest glutaminergiczny i dlatego połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) może być wykorzystane do badania konserwatywnych cech uwalniania glutaminergicznego. Od czasu badania Jana i Jana 1, larwy trzeciego stadium rozwojowego są szeroko wykorzystywane do badania wywołanej i spontanicznej transmisji synaptycznej poprzez monitorowanie potencjałów połączeń pobudzających (EJPs) lub prądów (EJC). EJP są zwykle rejestrowane wewnątrzkomórkowo za pomocą ostrej szklanej mikroelektrody i odzwierciedlają aktywność całego NMJ, w tym wszystkich butonów tworzących synapsy na danym włóknie mięśniowym.

Dla kontrastu, aktywność ograniczonej liczby miejsc uwalniania może być rejestrowana punktowo, poprzez umieszczenie końcówki mikropipety w pobliżu zakończeń neuronalnych lub żylaków synaptycznych. Technika ta została pierwotnie zastosowana przez Katza i Miledi2, a ogniskowe nagrania zewnątrzkomórkowe zostały z powodzeniem zastosowane w kilku preparatach NMJ, w tym frog3,4,5, mouse6,7,8, crustacean9,10,11,12,13,14,15,16, oraz Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Podejście to zostało następnie rozwinięte przez Dudela, który zoptymalizował elektrody kodujące makropatche24,25. W implementacji Dudela technika ta ściśle odpowiadała metodzie luźnego zacisku krosowego26.

Larwa Drosophila NMJ ma wyraźnie zdefiniowane batony synaptyczne, a linie transgeniczne z genetycznie zakodowanymi neuronalnymi znacznikami fluorescencyjnymi (zobacz Tabelę Materiałów) są łatwo dostępne. Te zalety umożliwiły nam rejestrowanie EJC i mEJC z wybranego boutonu synaptycznego20,21,22. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja elektrod rejestrujących

  1. Wyciąganie szklanych elektrod
    1. Dla ściągacza mikroelektrod należy zastosować następujący protokół (patrz Tabela materiałów):
      1. Linia 1: Bieg 510 Ciągnięcie - Prędkość 30 Czas 250; Linia 2: Heat 490 Pull - Prędkość 30 Czas 250,
        UWAGA: Jednostki czasu odpowiadają 0,5 ms na jednostkę; Pozostałe jednostki są względne. Wartość ciepła powinna być dostosowana dla każdego żarnika po przeprowadzeniu testu rampy.
    2. Użyj mikroskopu (35-krotne powiększenie), aby upewnić się, że wewnętrzna średnica wyciąganej elektrody mieści się w zakresie 7 - 10 μm (Rysunek 1A). Przechowuj kapilary w szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
  2. Polerowanie ogniowe
    1. Wypoleruj kapilary ogniowo (80 - 90% maksymalnej wartości ciepła przez 1 - 2 s) za pomocą mikrokuźni (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że końcowa średnica wewnętrzna polerowanej elektrody wynosi 5 μm (Rysunek 1A)27.
  3. Gięcie
    UWAGA: Wykonuje się dwa zgięcia w celu umieszczenia elektrody na szczycie mięśnia pod obiektywem o dużym powiększeniu.
    1. Użyj aparatury pokazanej na Rysunek 1B. Zamocuj elektrodę w manipulatorze i umieść końcówkę nad filamentem, nie dotykając go.
    2. Ustaw wartość grzania na 60 - 70% maksimum i naciśnij pedał mikrokuźni przez 1 - 2 sekundy (patrz Tabela materiałów), aby podgrzać filament. Użyj igły w kształcie litery L, aby delikatnie pociągnąć w dół końcówkę elektrody (Rysunek 1B powiększony). Wykonaj zgięcie pod kątem około 90o (Rysunek 1C).
    3. Przytrzymaj elektrodę nad płomieniem latarki ręcznie za pomocą kleszczy i wykonaj drugie zgięcie w odległości 7 - 10 mm od pierwszego zgięcia i pod kątem około 120o (Rysunek 1C).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Końcowe etapy produkcji mikropipet. (A) Końcówki elektrod po wyciągnięciu i wypolerowaniu ogniowym. (B.1) Ustawienie do gięcia końcówek. (B.2) Obszar ramki jest pokazany w powiększeniu po prawej stronie. Elektroda i żarnik są zamocowane w taki sposób, że końcówka elektrody znajduje się nieco nad drutem i nie styka się. (C.1) Elektroda rejestrująca. (C.2) Obszar ramki pokazany jest w powiększeniu po prawej stronie. Pierwsze zagięcie ma kąt około 90°, a odległość między pierwszym zagięciem a końcówką elektrody wynosi około 1 mm. Podziałka = 3 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Dodatkowe kroki przygotowawcze

  1. Przygotować roztwór podobny do hemolimfy (HL3) (w mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalozy, 115 sacharozy, 5 HEPES i 1 mM CaCl2; dostosować pH do 7,3 - 7,4. Przechowuj roztwór w lodówce i co tydzień rób świeży
    2. .
  2. Pipety stymulacyjne należy wykonywać w taki sam sposób, jak pipety szklane do nagrywania, z wyjątkiem tego, że nie ma potrzeby ich zginania.
    UWAGA: Przygotowanie elektrod stymulacyjnych jest szczegółowo opisane w 28 i 27. Ostateczna średnica po polerowaniu ogniowym powinna mieścić się w zakresie 5 - 7 μm.
  3. Włożyć pipetę stymulacyjną do uchwytu mikroelektrody podłączonego do strzykawki.
  4. Wytwarzanie płytek rozwarstwiających z małych szalek Petriego (35 x 10 mm) pokrytych żywicą epoksydową z kauczuku silikonowego (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z opisem w 28.
    UWAGA: Kauczuk silikonowy powinien być całkowicie utwardzony przed użyciem.
  5. Wybierz wędrującą larwę trzeciego stadium rozwojowego i rozetnij ją zgodnie z opisem w27,28,29,30.
    UWAGA: Aby uwidocznić boutony, użyj szczepu muchy CD8-GFP (patrz Tabela Materiałów)
    1. Za pomocą kleszczy (patrz Tabela materiałów) wybierz 3. larwy w stadium rozwojowym z fiolki.
    2. Przygwoźdź larwy, umieszczając pierwszą szpilkę z tyłu, a drugą z przodu (blisko haczyków gębowych).
    3. Dodaj roztwór HL3.
    4. Wykonaj cięcie za pomocą nożyczek sprężynowych (patrz Tabela materiałów) od górnego kołka do dolnego po grzbietowej stronie larw.
    5. Przypnij filet z larw, umieszczając 2 dodatkowe szpilki po lewej i prawej stronie larw.
    6. Usuń wnętrzności i tchawice za pomocą kleszczy.
    7. Przetnij nerwy tuż poza brzusznym rdzeniem nerwowym za pomocą nożyczek sprężynowych.

3. Nagrania elektryczne EJC

figure-protocol-2
Rysunek 2. Konfiguracja nagrywania. Próbka NMJ przypięta do pokrytej silikonem szalki Petriego (strzałka) jest umieszczana nad ruchomym stolikiem pionowego mikroskopu złożonego wyposażonego w zdolności epifluorescencyjne, obiektyw o dużym powiększeniu i dwa mikromanipulatory. Mikroskop umieszczony jest na stole antywibracyjnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. nagranie
    1. Umieść szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopowym (Rysunek 2). Włóż elektrodę odniesienia do kąpieli.
    2. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3. Pod obiektywem 10x (patrz Tabela Materiałów) zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją na mięśniach 6 i 7 segmentów brzucha 2, 3 lub 4 za pomocą mikromanipulatora (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 3 A.1 i A.2).
    3. Przełącz obiektyw na 60x (patrz Tabela materiałów). Skoncentruj się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki epi-fluorescencyjnej lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na szczycie synaptycznego boutonu (Rysunek 3 B.1-3).
    4. Bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia. Nadmierne ciśnienie może uszkodzić NMJ lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej. Upewnij się, że końcówka elektrody nie jest zatkana - jeśli tak, wymień ją.
    5. Włącz wzmacniacz, płytę A/D i komputer.
    6. Wybierz tryb cęgów napięcia na wzmacniaczu.
    7. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i wybierz tryb "bez przerw".
    8. Obserwuj wygląd mEJC na ekranie komputera.
    9. Upewnij się, że amplituda mEJC mieści się w zakresie 0,2 - 0,7 nA.
      UWAGA: Mniejsze EJC wskazują, że elektroda rejestrująca ma wady lub nie jest prawidłowo ustawiona.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wizualizacja butonów synaptycznych. (A) Obraz w jasnym polu segmentu półkuli w powiększeniu 10x (A.1) oraz powiększonego obszaru pudełkowego pokazującego mięśnie 6 i 7 (A.2, strzałka oznacza elektrodę rejestrującą). Pasek skali = 50 μm. (B) Bulony synaptyczne są wizualizowane w linii Drosophila z genetycznie kodowanym markerem neuronalnym (CD8-GFP) za pomocą obrazowania epi-fluorescencji (B.1) lub optyki DIC (B.2). Zdjęcia są wykonywane za pomocą obiektywu 60x i kostki filtra do obrazowania GFP (patrz Tabela materiałów). Butony synaptyczne są oznaczone strzałkami, a nakładka obrazów fluorescencyjnych i DIC jest pokazana w B.3. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. stymulacja
    1. Za pomocą mikromanipulatora, pod kontrolą wizualną, umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzuszne 2 - 4.
    2. Zastosuj podciśnienie, pociągając za tłok strzykawki połączonej z uchwytem elektrody, tak aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody (Rysunek 2).
    3. Włącz stymulator. Przekręć pokrętło na jednostce izolacyjnej (patrz Tabela materiałów), aby ustawić prąd zerowy, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJC (lub do momentu osiągnięcia progu).
    4. Stymulację należy przeprowadzić w reżimie ponadprogowym, przy wzroście prądu stymulacji około dwukrotnie, w porównaniu z progiem dla obserwacji EJCs.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że taka intensywność stymulacji jest optymalna, aby uniknąć awarii potencjału czynnościowego i wyzwolenia potencjału czynnościowego. Na przykład, jeśli EJC pojawiają się przy prądzie stymulacji 0,2 mA, użyj prądu 0,4 mA przez cały eksperyment.
  2. Odporność na uszczelnienie
    1. Zmierz rezystancję uszczelnienia elektrody rejestrującej makropatch, przekręcając przełącznik rezystancji elektrody amplifier do pozycji "test uszczelnienia". Zwróć uwagę, że wartość rezystancji uszczelnienia w GΩ zostanie wyświetlona w oknie "bieżący".
    2. Upewnij się, że rezystancja uszczelnienia mieści się w zakresie 0,5 - 2 MΩ. Wartości spoza tego zakresu wskazują, że elektroda nie jest odpowiednio wypolerowana lub niewłaściwie ustawiona.
    3. Monitoruj rezystancję uszczelnienia podczas całego nagrania, upewniając się, że pozostaje ona stała przez cały czas trwania eksperymentu.

4. Analiza

  1. Analizuj nagrania za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Nasze laboratorium korzysta z autorskiego oprogramowania Quantan31, które jest dostosowane do wykrywania EJC i mEJC zarejestrowanych ogniskowo (Rysunek 4). To oprogramowanie zawiera gaussowski filtr cyfrowy i umożliwia wykrywanie pików kwantowych w nakładających się zdarzeniach wielokwantowych (Rysunek 4A). Inne podejścia są opisane w17.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Analiza ilościowa. Wykrywanie mEJC (A) i EJC (B) przez oprogramowanie Quantan. Obszar wydarzenia jest oznaczony kolorem zielonym, a szczyty są oznaczone czerwonymi grotami strzałek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniskowe zapisy makropatchy umożliwiają monitorowanie aktywności synaptycznej z wybranych bultonów synaptycznych (Rysunek 5). Gdy elektroda jest umieszczona na szczycie synaptycznego boutonu (Rysunek 5A, miejsce 1), zarejestrowane mEJC (Rysunek 5C, miejsce 1) mają amplitudy znacznie przekraczające poziom szumu i ostre fazy narastania (w zakresie poniżej milisekundy). Gdy elektroda rejestrująca jest odsunięta od węzła synaptyczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila stanowi korzystny organizm modelowy do badania transmisji synaptycznej. Zastosowano kilka konfiguracji zapisu w larwalnym NMJ, w tym wewnątrzkomórkowe zapisy potencjałów synaptycznych, zapisy prądów synaptycznych z dwoma zaciskami napięciowymi elektrod 33,34 oraz opisane tutaj ogniskowe zapisy makropatchy prądów synaptycznych. Ta ostatnia technika pozwala na precyzyjną kwantyfikację transmisji synaptycznej w wizualizowanych boutonach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez grant NIH R01 MH 099557

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sutter P-97Instrument SutterP-97Ściągacz do mikroelektrod
Narishige MF-830NarishigeMF-830Microforge
WPI MF200WPIMF200Microforge
Kapilarki szklaneWPIB150-86-10Kapilarki szklane
Mikropalnik 1WG61Grainer1WG61
Mikropalnik Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow CorningSYLGARD 184Silikon do przygotowania płytek preparacyjnych
Szpilki do preparacjiAmazonB00J5PMPJASzpilki do pozycjonowania larw
PęsetaWPIINC500342Pęseta do zakładania szpilek, usuwania wnętrzności i tchawicy.
NożyczkiWPIINC501778Nożyczki do cięcia naskórka larw i nerwów.
Olympus BX61WIOlympusBX61WIMikroskop pionowy
Olympus Lumplan FL N 60xOlympusUPLFLN 60XObiektyw mikroskopowy 60X
Olympus UPlan FL N 10xOlympusUplanfl N 10XObiektyw mikroskopowy 10X
Narishige MicromanipulatorNarishigeMHW-3Trójosiowy mikromanipulator hydrauliczny do wody
npi Electronic GmbH ELC-03XSnpi Electronic GmbHELC-03XSWzmacniacz elektrofizjologiczny
A.M.P.I Master 8A.M.P.I.Master 8Stymulator elektryczny
A.M.P.I Iso-FlexA.M.P.I.Iso-FlexStimulus isolator
Stół antywibracyjny TMC63-9090Stół antywibracyjny
TMC Klatka FaradayaTMC81-333-90Klatka Faradaya
Digidata 1322AAxon InstrumentsDigidata 1322ADigidata
Dell Dell Dimension 5150z systemem operacyjnym Win XP
Uchwyt elektrodyWPIMEH3SWUchwyt elektrody
Filtr optycznyOmega optycznyXF 115-2Kostka filtrująca do wykrywania białka zielonej fluorescencji (GFP)
pCLAMP 8Axon Instruments8.0.0.81Oprogramowanie do rejestracji sygnału
QuantanOprogramowaniewewnętrzne-Oprogramowaniedo przetwarzania
sygnałów Canton-S (Wildtype)Bloomington Stock Center64349Żyłka kontrolna
cpx SH1Hojny prezent J.T. Littleton-Complexinnokautująca linia muchowa ze zwiększoną spontaniczną egzocytozą
CD8-GFPBloomington Stock Center5137Linka muchowa z neuronalną fluorescencyjną (GFP) Znacznik
Komputer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
  2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
  3. Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
  4. Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
  5. Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
  6. Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
  7. Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
  8. Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
  9. Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
  10. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
  11. Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
  12. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
  13. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
  14. Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
  15. Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
  16. Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
  17. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
  18. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  19. Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
  20. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
  21. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
  22. Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
  23. Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
  24. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
  25. Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
  26. Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
  27. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
  28. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  29. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  30. Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
  31. Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
  32. Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
  33. Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
  34. Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
  35. Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

z cze nerwowo mi niowe Drosophilamonitorowanie pr du synaptycznegowytwarzanie mikropipetkontrast interferencyjny r nicowyoptyka du ego powi kszeniatechniki elektrofizjologicznewizualizacja p czk w synaptycznychminiaturowe pr dy blaszczasteprzygotowanie pipety stymuluj cej

Powiązane artykuły