Zautomatyzowany, szybki, iteracyjny test geotaksji ujemnej do analizy zachowań wspinaczkowych dorosłych w modelu neurodegeneracji Drosophila

Opracowano różne protokoły i metody analizy zachowań wspinaczkowych dorosłych Drosophila. Tradycyjna analiza jest dość pracochłonna, głównie polega na umieszczeniu pojedynczej muchy w pojedynczej fiolce i użyciu ręcznej siły do stukania muchami w celu synchronizacji^1,2,3,4. Jest to żmudne i czasochłonne, nie nadaje się do dużych badań o wysokiej przepustowości i ma potencjalne różnice w sile ręcznej używanej do stukania much, a także inne ograniczenia. Aby ulepszyć test, opracowano test Rapid iterative Negative Geotaxis (RING), który umożliwia wysokoprzepustową analizę wielu much w tym samym czasie⁵. Jednak test nadal wymaga ręcznego wywierania siły w celu zsynchronizowania działania muchy. Nasza wersja testu RING, poprawiona w stosunku do poprzedniego testu, zawiera metalową podstawę, w której znajduje się wiele fiolek zawierających muchy, automatycznie sterowanych przez silnik elektryczny, który napędza synchronizację muchy⁶. Po nagraniu mucha wznosząca się natychmiast po synchronizacji jest rejestrowana, a następnie analizowana za pomocą samodzielnie zaprojektowanego oprogramowania. Nasz zautomatyzowany test RING wyeliminował żmudny i pracochłonny proces zbierania danych z pojedynczej muchy, pojedynczo, i umożliwił zwiększenie wydajności procesu pozyskiwania danych. Ponadto zautomatyzowany test RING został wykorzystany w wielu badaniach w celu wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw choroby Alzheimera i Parkinsona, weryfikując to podejście z wysoką skutecznością^7,8,9.

W tym artykule demonstrujemy zautomatyzowany test RING z wykorzystaniem much RNAi sterowanych DDC-Gal4. DDC-Gal4 to linia Gal4 specyficznie ulegająca ekspresji w neuronach dopaminergicznych (DA) i serotoninergicznych, stanowiąc tym samym doskonałe narzędzie do analizy efektów genów docelowych związanych z deficytami lokomotorycznymi towarzyszącymi neurodegeneracji¹⁰. Ponadto włączamy UAS-Dicer2, linię muchową, która zwiększa wydajność RNAi, w celu wygenerowania UAS-Dicer2; Linia narzędzi DDC-Gal4. Muchy RNAi, które wybieramy, to auksilin (aux) RNAi v16182 (auxR¹⁶¹⁸²), gen, który wcześniej zidentyfikowaliśmy, aby wykazywać wpływ na aktywność lokomotoryczną much⁸. Muchy auxGFP są również przygotowane do analizy skutków nadekspresji aux. Pokażemy, jak wykorzystać zautomatyzowany test RING do pomiaru ujemnej geotaksji much, przedstawimy wyniki i omówimy wszelkie implikacje wynikające z wyników.

1. Kolekcja much

1. Utrzymuj muchy na standardowym pokarmie dla much w temperaturze 25 °C, wilgotności 70% i cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności.
2. Zbieraj UAS-Dicer2; DDC-GAL4 latać dziewiczo w znieczuleniu dwutlenkiem węgla (CO₂).
3. Skrzyżuj te dziewice z 2-dniowymi dorosłymi samcami much posiadającymi następujące genotypy: UAS-mCD8GFP (kontrola), auxR¹⁶¹⁸² (aux RNAi), auxGFP (nadekspresja aux) i auxR¹⁶¹⁸²; auxGFP (ratunek), ze stosunkiem samców do samic 1:2.
4. Oddzielnie zbierz nowo zamknięte samce i samice w 3 fiolkach dla każdej grupy na eksperyment, umieszczając 10 much w każdej zwykłej fiolce na muchy ze standardowym pokarmem w temperaturze 25 °C.
5. W zależności od eksperymentu, zebrane muchy należy przechowywać do 35 dni i używać ich do automatycznej analizy RING w 5, 15, 25 i 35 dniu.

2. Zautomatyzowany test RING

1. Przenieść 10 zebranych much (unisex) na genotyp do każdej fiolki, a następnie zabezpieczyć fiolkę śrubą. Analizuj muchy kontrolne i muchy przenoszące razem różne genotypy dla każdego zestawu eksperymentów (do 10 fiolek jednocześnie, 10 much w każdej fiolce).
2. Włącz aparat cyfrowy umieszczony przed aparatem i rozpocznij nagrywanie, gdy wszystkie muchy są załadowane i gotowe.
3. Po odczekaniu 1 minuty, aby muchy usadowiły się w fiolkach, włącz kontroler krokowy, który steruje sterownikiem krokowym; napędza to mały silnik elektryczny do sterowania dołączoną dźwignią tak, aby kolejno podnosił się i stukał w aparat 4 razy w ciągu 2 sekund. Zobacz Rysunek 1.
   1. Po stuknięciu zwróć uwagę, że muchy zaczynają wspinać się po ścianie. Upewnij się, że nagrywanie jest kontynuowane.
4. Powtórz synchronizację zgodnie z opisem w kroku 2.3 w odstępie 60 sekund przez 3 do 5 kolejnych prób.
5. Powtórz eksperyment dla much 5-, 15-, 25- i 35-dniowych. Przeprowadź co najmniej 3 niezależne eksperymenty dla każdej grupy, każdy eksperyment z co najmniej 30 zebranymi muchami (3 fiolki).

3. Analiza danych

1. Zaimportuj nagrane wideo do komputera.
2. Zrób migawkę filmu po 6 sekundach od stuknięcia, dla każdej próby.
3. Zaimportuj obraz migawki do oprogramowania RflyDetection (patrz Rysunek 2), korzystając z menu 'Plik'.
4. Ustaw precyzyjnie górną i dolną linię bazową fiolki, używając ikony linii bazowej na pasku narzędzi, a następnie używając kursora, aby zaznaczyć górną i dolną linię bazową na obrazie.
5. Wprowadź liczbę much w fiolce (np. 10 tutaj) w polu "Muchy w prosto" i długość fiolki (np. 14 cm tutaj) w polu "Wysokość tuby" na pasku ustawień.
   1. Należy pamiętać, że poszczególne pozycje muchy są wykrywane i oznaczane kropkami na ekranie dla każdej fiolki.
      UWAGA: Rysunek 2 pokazuje pozycje wszystkich kliknięć przycisków menu.
6. Zwróć uwagę, że oprogramowanie automatycznie określa odległość wznoszenia się dla każdej muchy i wyświetla uśrednione wartości z 10 much w każdej fiolce w tabeli na prawym panelu. (Zobacz Rysunek 2)
7. Przetwarzaj liczbę wznoszenia za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Prism) w celu dalszej analizy statystycznej.
8. Przedstaw dane jako średnią ± SEM.
9. Oblicz wartości istotności p (oznaczone gwiazdkami, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem wielokrotnego porównania Bonferroni.

Ten artykuł demonstruje użycie automatycznego testu RING do oceny negatywnego zachowania geotaksji much. W przeciwieństwie do poprzedniego testu RING, nasz test obejmuje zautomatyzowane urządzenie, które zapewnia siłę elektryczną do synchronizacji działania muchy i analizuje do setek much jednocześnie (Rysunek 1). Analiza Dicer2; Muchy DDC>auxR16182 wykazały zależny od wieku spadek odległości wspinaczki w 6-sekundowym przedziale czasowym zarówno dla samców, jak i samic much, co sugeruje, że ekspresja aux w neuronach DA ma kluczowe znaczenie dla aktywności lokomotorycznej much. Wydaje się, że nadekspresja auxGFP w neuronach DA nie ma wpływu na zdolność do wspinania się, a koekspresja auxR16182 i auxGFP w neuronach DA uratowała fenotyp RNAi (Rysunek 2 i Figura 3). Oprócz walidacji zautomatyzowanego testu RING jako wysokowydajnego i skutecznego podejścia do oceny wad motorycznych związanych ze zwyrodnieniem neuronów DA, wyniki te wskazują również, że to zautomatyzowane podejście jest przydatne w identyfikacji potencjalnych czynników ryzyka choroby Parkinsona i dostarcza wskazówek na temat ich funkcji neurodegeneracyjnych.

Rysunek 1. Zautomatyzowany aparat RING. (A i B) Widoki aparatu z przodu i z tyłu: gniazdo (1), pionowy pręt stalowy (2), śruba do mocowania rurki na ramie (3), przezroczyste plastikowe fiolki (4), pręt piankowy (5), metalowa podstawa (6), sterownik mikrokrokowy (7), sterownik elektroniczny (8), przełącznik (9), mały silnik elektryczny (10), oraz dźwignia dołączona do małego silnika elektrycznego (11). Rozmiar prostokątnej metalowej ramki wynosi 46 cm × 26 cm × 16 cm, w której znajduje się 10 przezroczystych plastikowych fiolek (2,1 cm średnicy, 14,5 cm wysokości) zabezpieczonych. Aby włączyć urządzenie, najpierw kliknij przełącznik (9), który włącza się odpowiednio (8), (7) i (10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Analiza reprezentatywnego obrazu migawki przez RflyDetection. Obraz migawki jest importowany do oprogramowania RflyDetectation, a akcja dla każdej ikony w interfejsie jest oznaczona tekstem po prawej stronie. Po ustawieniu górnej i dolnej linii bazowej oprogramowanie automatycznie wykrywa i zaznacza pozycję lotu w fiolce. Odległość wznoszenia (cm) w 6 s dla każdej muchy i uśrednione wartości dla każdej fiolki są wyświetlane w tabeli. Liczby te są następnie importowane do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Statystyczne wykresy słupkowe pokazujące zależny od wieku spadek zdolności do wspinaczki muchowej, gdy ekspresja aux jest obniżona w neuronach DA. Zautomatyzowany test RING wykorzystano do analizy negatywnego zachowania geotaksji u much o następujących genotypach: auxR16182/+ (bez Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 przelatuje skrzyżowane z w1118 (kontrola), UAS-mCD8GFP (kontrola), auxR16182, auxGFP i auxR16182; auxGFP (ratownictwo). Należy zauważyć, że zarówno samce, jak i samice much wspinały się znacznie wolniej w czasie, gdy ekspresja aux była zmniejszona w neuronach DA. Deficyty lokomotoryczne zostały uratowane po ponownym wprowadzeniu ekspresji aux. Badano muchy w wieku 5, 15, 25 i 35 dni. Samce (A) i samice (B) much są pokazane osobno. Legendy z etykietami genotypów odpowiadającymi różnym kolorom pasków są pokazane po prawej stronie. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Wartości istotności p (oznaczone gwiazdkami, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns: brak istotności, poniżej gwiazdek narysowano słupek wskazujący obiekty do porównania) obliczono w porównaniu z kontrolą mCD8GFP lub aux RNAi przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z wielokrotnym testem porównawczym Bonferroni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.