Artykuł metodologiczny

Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji

DOI:

10.3791/56507

⸱

12 września 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby neurodegeneracyjne są często związane z postępującą utratą zdolności ruchowych, skróceniem życia i neurodegeneracją zależną od wieku. Aby zrozumieć mechanizm tych zjawisk komórkowych i ich przyczynowo-skutkowe relacje, Drosophila melanogaster, dzięki swoim wyrafinowanym narzędziom genetycznym i różnorodnym cechom behawioralnym, jest wykorzystywana jako model chorobowy do oceny fenotypów neurodegeneracyjnych. Opisujemy tu metodę wysoko-przepustową do analizy zachowania ujemnej geotaksji u dorosłych muchówek Drosophila, jako wskaźnik możliwych defektów ruchowych związanych z neurodegeneracją. Zbudowano i opracowano zautomatyzowaną maszynę do synchronizacji much za pomocą początkowego impulsu elektrycznego, umożliwiając później rejestrowanie zachowania ujemnej geotaksji w ciągu sekund do kilku minut. Zdjęcia z nagranego cyfrowo wideo są następnie przetwarzane za pomocą samodzielnie zaprojektowanego oprogramowania RflyDetection do manipulacji danymi statystycznymi. W odróżnieniu od ręcznie kontrolowanego testu ujemnej geotaksji opartego na pojedynczej muszce, ten precyzyjny, szybki i wysoko-przepustowy protokół umożliwia pozyskiwanie danych z ponad setek much jednocześnie, zapewniając wydajne podejście do poszerzenia naszego zrozumienia dla mechanizmu leżącego u podstaw deficytów ruchowych związanych z neurodegeneracją.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A variety of protocols and methods have been developed for analyzing Drosophila adult climbing behavior. Rather laborious, the traditional analysis mostly involves putting a single fly into an individual vial and uses a manual force to tap flies down for synchronization1,2,3,4. It is tedious and time consuming, unsuitable for large high-throughput studies, and has potential variations of the manual force used to tap down the flies as well as other limitations. To improve the assay, a Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING) assay was developed which allows high-throughput analysis over numerous flies at the same time5. However, the assay still requires a manually exerting force to synchronize fly action. Our version of the RING assay, revised upon the previous assay, includes a metal base hosting multiple fly-containing vials automatically controlled by an electric motor to drive fly synchronization6. Upon recording, the fly climbing immediately after synchronization is recorded then analyzed using a self-designed software. Our automated RING assay has eliminated the tedious and labor-intensive process in collecting data from a single fly, one at a time, and enabled the data acquisition process to be more efficient. In addition, the automated RING assay has been employed in a number of studies to elucidate the mechanism underlying Alzheimer's and Parkinson's Disease, validating the approach with high efficiency7,8,9.

In this article, we demonstrate the automated RING assay using the DDC-Gal4 driven RNAi flies. DDC-Gal4 is a Gal4 line specifically expressing in dopaminergic (DA) and serotonergic neurons, thus representing a great tool for analyzing the target gene effects associated with locomotor deficits accompanying neurodegeneration10. In addition, we incorporate UAS-Dicer2, a fly line that enhances RNAi efficiency, to generate the UAS-Dicer2; DDC-Gal4 tool line. The RNAi flies we choose to use is the auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), a gene that we have previously identified to exhibit an effect on fly locomotor activity8. auxGFP flies are also prepared for analyzing effects upon aux overexpression. We will show how to use the automated RING assay to measure fly negative geotaxis, present the results, and discuss any implications acquired from the results.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kolekcja much

  1. Utrzymuj muchy na standardowym pokarmie na 25 °C, 70% wilgotności i 12 h/12 h cyklu światło/ciemność.
  2. Zbieraj dziewicze muchy UAS-Dicer2; DDC-GAL4 pod znieczuleniem dwutlenkiem węgla (CO2).
  3. Skrzyżuj te dziewicze samice z 2-dniowymi dorosłymi samcami o następujących genotypach: UAS-mCD8GFP (kontrolne), auxR16182 (aux RNAi), auxGFP (aux przelew), i auxR16182; auxGFP (ratunek), przy stosunku samiec: samica 1:2.
  4. Oddzielnie zbieraj nowo wylęgające się samce i samice w 3 pojemnikach dla każdej grupy na doświadczenie, umieszczając 10 much w każdym zwykłym pojemniku z pokarmem standardowym w 25 °C.
  5. W zależności od eksperymentu, trzymaj zebrane muchy do 35 dni i używaj ich do zautomatyzowanej analizy RING w dniu 5, 15, 25 i 35.

2. Zautomatyzowany test RING

  1. Przenieś 10 zebranych much (unisex) na pojedynczy genotyp do każdego pojemnika, a następnie zabezpiecz pojemnik śrubą. Analizuj muchy kontrolne i muchy z różnymi genotypami razem dla każdego zestawu eksperymentów (do 10 pojemników jednocześnie, 10 much w każdym pojemniku).
  2. Włącz cyfrową kamerę umieszczoną przed urządzeniem i zacznij nagrywać, gdy wszystkie muchy są załadowane i gotowe.
  3. Po pozwoleniu na 1 min. na osiedlenie się much w pojemnikach, włącz kontroler krokowy, który steruje sterownikiem krokowym; to napędza mały silniczek elektryczny do sterowania dźwignią, aby kolejno podnosiła się i stukała w urządzenie 4 razy w 2 s. Zobacz Rysunek 1.
    1. Po stukaniu zauważ, że muchy zaczynają wspinać się po ścianie. Upewnij się, że nagrywanie trwa nadal.
  4. Powtórz synchronizację zgodnie z opisem w punkcie 2.3 w odstępach 60 s na 3 do 5 kolejnych prób.
  5. Powtórz eksperyment dla much w wieku 5, 15, 25 i 35 dni. Przeprowadź co najmniej 3 niezależne eksperymenty dla każdej grupy, każdy eksperyment z co najmniej 30 zebranymi muchami (3 pojemniki).

3. Analiza danych

  1. Zaimportuj nagranie do komputera.
  2. Zrób zrzut ekranu z nagrania 6 s po stukaniu, dla każdej próby.
  3. Zaimportuj obraz zrzutu do oprogramowania RflyDetection (zobacz Rysunek 2), używając menu "Plik".
  4. Ustaw górną i dolną linię bazową pojemnika precyzyjnie, używając ikony linii bazowej na pasku narzędziowym, a następnie używając kursora do zaznaczenia górnej i dolnej linii bazowej na obrazie.
  5. Wprowadź liczbę much na pojemnik (np. 10 tutaj) do pola "Muchy w prostokącie" i długość pojemnika (np. 14 cm tutaj) w polu "Wysokość rury" w pasku ustawień.
    1. Zwróć uwagę, że położenia pojedynczych much są wykrywane i oznakowane kropkami na ekranie dla każdego pojemnika.
      UWAGA: Rysunek 2 wskazuje położenia wszystkich kliknięć przycisków menu.
  6. Zwróć uwagę, że oprogramowanie automatycznie określa odległość wspinaczki dla każdej muchy i wyświetla wartości średnie z 10 much w każdym pojemniku w tabeli na prawej panelu. (Zobacz Rysunek 2)
  7. Przetwórz liczbę wspinaczy za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Prism) do dalszej analizy statystycznej.
  8. Przedstaw dane jako średnia ± SEM.
  9. Oblicz wartości p znaczącości (wskazane gwiazdkami, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) przy użyciu jednokierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Bonferroniego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł demonstruje zastosowanie zautomatyzowanego testu RING w ocenie zachowania ujemnej geotaksji u much. W przeciwieństwie do poprzedniego testu RING, nasz test obejmuje zautomatyzowany aparat, który dostarcza siłę elektryczną do synchronizacji działania much i analizuje jednocześnie nawet setki much (Rycina 1). Analiza much Dicer2; DDC>auxR16182 wykazała wiek-zależny spadek w odległości wspinaczki w 6-sekundowym przedziale cz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj zautomatyzowany test RING umożliwia wysokowydajną analizę zachowania gelotaktycznego muchy na dużą skalę dla setek much jednocześnie. Wcześniej istniejące strategie analizy wspinaczki dorosłych much obejmowały obserwacje pojedynczej muchy w pojedynczej probówce, a pozycja muchy była manualnie wykrywana gołym okiem. Ten dość żmudny proces mógł czasami powodować niewłaściwe odczytywanie lub błędne interpretowanie danych, a także pracochłonną pracę. Nasz zautomatyzowany test RING rozpoczyna się od prostego kli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bloomington Stock Center oraz Vienna Drosophila RNAi Center za szczepy much. Patent na aparat RING należy do Shanghai Advanced Research Institute, Chińskiej Akademii Nauk. Wnioski o oprogramowanie RflyDetection należy kierować do Fu-de Huang (patrz lista autorów). Praca ta została wsparta grantami z Narodowego Programu Badań Podstawowych Chin (Program 973 2013CB945602) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31270825 i 31171043). Dziękujemy członkom laboratorium Ho za dyskusję i uwagi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Forma Environmental ChamberThermo3949
Carbon dioxide cylindersFuLian GAS TechnologyGB/T6052
HDR-CamcorderSONYHDR-CX220E
Binocular stereomicroscopeXin ZhenSMZ-168BL
Electronic scalesMinQiaoSL1002N
RefrigeratorHaierSC-350
Agar-agar powderSinopharm10000561
GlucoseSinopharm10010518
Corn mealSinopharm5464654
Brown sugarLiuCaiYuan45467936
Instant dry yeastAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4Prezent od Fude Huang
AuxGFPPrezent od Henry Chang

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zachowanie wspinaczkowe Drosophilazautomatyzowany test RINGsynchronizacja muchoprogramowanie RflyDetectionmodel neurodegeneracjianaliza deficyt w motorycznychprotok wysokoprzepustowystymulacja impulsem elektrycznympomiar dystansu wspinaczki

Powiązane artykuły